YY_T 1292.2-2015 医疗器械生殖和发育毒性试验 第2部分：胚胎发育毒性试验.pdf

I C S1 1.0 4 0.0 1C3 0中华人民共和国医药行业标准Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5医疗器械生殖和发育毒性试验第2部分:胚胎发育毒性试验T e s t f o r r e p r o d u c t i v ea n dd e v e l o p m e n t a l t o x i c i t yo fm e d i c a l d e v i c e sP a r t 2:P r e n a t a l d e v e l o p m e n t a l t o x i c i t y t e s t2 0 1 5-0 3-0 2发布2 0 1 6-0 1-0 1实施国家食品药品监督管理总局发 布中国质量标准出版传媒有限公司内部使用前 言 YY/T1 2 9 2 医疗器械生殖和发育毒性试验 拟分部分出版,目前计划发布如下部分:第1部分:筛选试验;第2部分:胚胎发育毒性试验;本部分为YY/T1 2 9 2的第2部分。本部分按照G B/T1.12 0 0 9给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(S A C/T C2 4 8)归口。本部分起草单位:国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、四川医疗器械生物材料和制品检验中心、中国医学科学院北京协和医学院新药安全评价研究中心。本部分起草人:赵增琳、刘成虎、邹文、梁洁、包捷。Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用引 言 G B/T1 6 8 8 6.3中给出的检测潜在生殖和发育毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织(O E C D)化学品测试指南 中规定的方法,但这些方法是针对化学品的特性制定而成,同时未给出详细的试验步骤,因此不适宜直接用于医疗器械或材料的检测。本部分参照O E C D4 1 4试验方法的基本原则,并根据医疗器械或材料的特性对试验方法进行了适当的修改,规定了详细的试验步骤,可作为G B/T1 6 8 8 6.3中生殖和发育毒性试验中的一项方法标准。医疗器械或材料的生殖和发育毒性潜能对人类健康有十分重要的影响。特别是针对可吸收性医疗器械或含可沥滤物的医疗器械。G B/T1 6 8 8 6.3中推荐下列医疗器械或材料,在缺乏排除生殖和发育毒性风险证据的情况下,应考虑进行生殖和发育毒性试验。a)具有可能与生殖组织或胚胎(胎儿)直接长期或永久接触的器械(包括可吸收或可沥滤物质,如硅凝胶乳房植入物);b)储能医疗器械。本部分提供受孕期间接触医疗器械对受孕母体和胚胎发育影响的一般性信息,其主要是对母体效应、死亡、结构畸形或胎儿发育改变的评价。本部分不包括功能缺陷的内容。由于受到试验样品制备以及试验方法确认等方面局限性的影响,在确定进行胚胎发育毒性试验之前,应充分考虑G B/T1 6 8 8 6.1和G B/T1 6 8 8 6.1 8的要求。应在评价医疗器械使用中引发胚胎发育毒性风险的基础上,对进行试验的决定予以论证。对可吸收性或含可沥滤物质的医疗器械,如果在吸收、代谢和分布研究方面有充分可靠的数据,或者医疗器械或材料浸提液中鉴别出的所有成分均无胚胎发育毒性时,就无需再进行试验。对医疗器械进行可接受的生物学风险评估后,如胚胎发育毒性的风险已被排除,则无需再进行试验。Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用医疗器械生殖和发育毒性试验第2部分:胚胎发育毒性试验1 范围YY/T1 2 9 2的本部分规定了医疗器械或材料胚胎发育毒性试验的方法。本部分适用于医疗器械或材料生殖和发育毒性试验。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T1 6 8 8 6.1 医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验G B/T1 6 8 8 6.2 医疗器械生物学评价 第2部分:动物福利要求G B/T1 6 8 8 6.3 医疗器械生物学评价 第3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验G B/T1 6 8 8 6.1 2 医疗器械生物学评价 第1 2部分:样品制备与参照样品3术语和定义G B/T1 6 8 8 6.1、G B/T1 6 8 8 6.3和G B/T1 6 8 8 6.1 2界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1发育毒理学 d e v e l o p m e n t a l t o x i c o l o g y子代在出生前、围产期或出生后到性成熟阶段接触医疗器械所引起的机体发育毒性。主要包括:机体死亡、结构异常、生长改变和功能缺陷。发育毒理学通常指的是畸胎学。3.2生长改变 a l t e r e dg r o w t h子代器官、体重或大小的改变。3.3异常(畸形)a l t e r a t i o n s(a n o m a l i e s)发育过程中的结构异常,包括畸形和变异。3.3.1畸形(主要异常)m a l f o r m a t i o n(m a j o ra b n o r m a l i t y)被认为对试验动物有害的结构改变(可具有致死性),通常比较少见。3.3.2变异(小异常)v a r i a t i o n(m i n o ra b n o r m a l i t y)被认为对试验动物危害较小或无害的结构改变;可一过性出现并且对照组中出现频率相对较高。3.4孕体 c o n c e p t u s从受精后到分娩前各发育阶段全过程衍化的受精卵数,包括胎膜及胚胎或胎儿。1Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用3.5植入(着床)i m p l a n t a t i o n(n i d a t i o n)囊胚与子宫内膜粘附,包括穿过子宫上皮并嵌入子宫内膜。3.6胚胎 e m b r y o任何机体的早期或发育阶段,尤其指受精卵长轴出现后直到所有主要结构形成之间的发育产物。3.7胚胎毒性 e m b r y o t o x i c i t y对胚胎的正常结构、发育、生长和/或活力有害的毒性。3.8胎儿 f o e t u s在胚后期发育中未出生的子代。3.9胎儿毒性 f o e t o t o x i c i t y对胎儿的正常结构、发育、生长和/或活力有害的毒性。3.1 0流产 a b o r t i o n将未成熟的妊娠产物(胚胎或无活力的胎儿)从子宫中清除。3.1 1再吸收 r e s o r p t i o n已经植入子宫的孕体,随后死亡并正在吸收或已经吸收。3.1 1.1早期再吸收 e a r l yr e s o r p t i o n没有可识别的胚胎或胎儿的植入证据。3.1 1.2晚期再吸收 l a t e r e s o r p t i o n具有外形退化改变的死亡胚胎或胎儿。3.1 2未观察到有害作用的剂量水平 n o-o b s e r v e d-a d v e r s e-e f f e c t l e v e l;N O A E L没有观察到任何毒性效应的最高剂量水平。4 主要设备生物显微镜、体视显微镜、游标卡尺(百分尺)、病理检查器具等。5 试验原理通常情况下,将已经妊娠的动物给予供试物,给予时间从着床到预定处死的前一天。处死时间宜尽可能与正常分娩的时间接近,以避免由于早产导致试验数据的丢失。本部分不仅对生物体器官形成期进行观察(如啮齿动物一般5d 1 5d,家兔6d 1 8d),而且也能检查着床前,适宜时,整个妊娠期直到剖宫产前一天的影响。在处死妊娠动物后立即进行剖宫产,并检查子宫内容物,评价胎仔的软组织和骨骼的改变情况。注:如采用植入方式,宜根据植入物的特性确定植入的频次和时间,以确保实验动物在整个实验周期中接触供试物。2Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用6 实验动物6.1 总则所有的动物实验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行,并且还应符合G B/T1 6 8 8 6.2的要求。6.2 动物的种属和要求常用的实验动物为大鼠或家兔。正式试验前要将动物至少饲养5d以适应实验室环境。实验动物宜标明种属、品系、来源、性别、体重和/或周龄。试验开始时,动物的体重差异宜控制在最小范围,每只动物的体重不能超过同性别平均体重的2 0%。宜将雌性动物与来自同一种属和品系的雄性动物进行交配,并宜避免近亲交配。7 样品制备7.1 根据G B/T1 6 8 8 6.1 2的原则,制备试验样品。只要可能,医疗器械都应在“备用”状态下进行试验。7.2 对于储能医疗器械,应以动物全身接触为宜,使用剂量应为与人体生殖器官接触所预期剂量的倍数。8 试验步骤8.1 动物的数量试验组和对照组宜有足够数量的雌性动物,以保证在尸检时约有2 0只妊娠动物。每组不少于1 6只妊娠动物。妊娠动物的死亡率不得高于1 0%。8.2 剂量水平的选择8.2.1 宜参考现有的毒理数据以及关于受试物或相关物质的毒代动力学方面的所有信息来选择相应的剂量范围以免造成过度的母体毒性反应。这些信息也可有助于确定剂量的频次。8.2.2 以最大耐受剂量或动物模型的生理限量作为动物接触的最大剂量,该剂量应为估计的人体最大接触剂量的倍数(以剂量的质量或表面积每千克受试者表示)。注:与典型的化学物生殖和发育毒性试验不同,多数材料可能得不出明显的剂量-效应关系,对于这些材料,可以考虑采用接触的最大剂量试验来判定是否存在毒性危害,但宜对试验所采用的剂量范围提供相应的支持性数据。8.2.3 若认为试验样品可能对试验动物产生胚胎发育毒性时,宜至少设置3个剂量水平。除非受到供试物理化和生物特性的限制,否则所选择的最高剂量宜引起一些发育和(或)母体毒性(如临床症状或体重下降),但不引起死亡或严重损伤。宜至少有一个中间剂量组引起轻微的可观察到的毒性效应。最低剂量则不引起任何母体毒性或发育毒性。剂量水平的递减顺序宜能反映剂量-效应关系和未观察到有害作用的剂量水平(NOA E L)或接近检出限的剂量,而这一剂量可作为测试的基准值。递减剂量水平通常选择2倍4倍间距为最佳,如果设置第4个剂量组,则可使用很大的组距(如,超过1 0倍)。虽然目的是确定母体的NOA E L,但是对没有确定此剂量水平的研究也是可以接受的。8.3 动物处理8.3.1 宜根据器械的特点和预期临床使用部位采用原位接触法。对于难以模拟临床使用接触的器械,3Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用宜对所选择的接触方式进行论证。8.3.2 宜根据最近的个体体重对试验动物给予受试物。但在妊娠晚期宜对剂量进行适当的调整。如果实验动物出现了严重的、过度的毒性反应,宜将其以人道方式处死。如果有一些妊娠动物出现了严重的毒性反应,宜考虑终止该组试验。如采用灌胃法给液,宜使用胃管或合适的插管一次性给予。宜根据实验动物的大小来确定能一次给液的最大体积,每次给液量不宜超过1m L/1 0 0g体重,水性溶液最大体积可使用2m L/1 0 0g体重。当使用玉米油作为介质时,最大体积不宜超过0.4m L/1 0 0g体重。宜通过调整溶液浓度来减少受试物体积的差异,以确保所有剂量组的体积是相同的。8.3.3 通常情况下,宜从受精卵着床当天(例如交配后第5天)至剖宫产前一天对妊娠动物每天给予供试物。如果可获得的前期研究结果没有显示存在高潜在性的着床前吸收,则从交配当天至处死前一天给予供试物。宜注意妊娠期不适当的处理或应激可能会导致流产。为消除非处理因素导致的流产,宜避免对妊娠动物进行不恰当的处理以及来自外部因素如噪音等的应激作用。8.3.4 宜使用平行对照组。平行对照组宜为假处理对照组或浸提介质对照组(如适用),除了不给予受试物以外,动物的处理方式与试验组完全相同。9 结果观察9.1 临床体征宜至少每天一次观察和记录动物的临床症状。宜在每天的相同时间观察,同时考虑在给予供试物后预期反应的高峰期进行观察。宜记录动物的情况包括死亡、濒死、相关的行为改变和所有明显的毒性效应。9.2 体重测量实验动物宜当天称重,试验期间至少每隔3d一次以及处死当天对动物进行称重。9.3 食物消耗量宜每隔3d测量一次每笼孕鼠的食物消耗量并和体重测量同时进行。9.4 尸检9.4.1 宜在预期分娩的前一天处死妊娠动物。在处死前出现流产或早产征兆的动物宜被处死并进行肉眼观察。9.4.2 宜对试验结束时或在试验过程中死亡的孕体进行肉眼观察其所有结构异常或病理改变。宜优先在不知道试验组信息的前提下对剖宫产动物及其胎仔进行分析评价,以控制偏倚。9.5 子宫内容物的检查9.5.1 宜在试验结束时或在动物死亡后立即取出子宫并确定怀孕状况。看起来未妊娠的子宫宜进一步检查(如啮齿类动物用硫化铵,家兔用S a l e w s k i染色或用其他可选择的适宜方法)以确定未受孕状态。9.5.2 宜称重包括子宫颈在内的妊娠子宫。在试验过程中死亡的动物则不宜进行妊娠子宫称重。9.5.3 宜确定妊娠动物的黄体数。9.5.4 宜检查子宫内容物中的胚胎数、死胎数和活胎数。宜对再吸收程度进行描述以便估计孕体死亡的相对时间。4Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用9.6 胎仔的检查9.6.1 宜确定每只胎仔的性别和体重。9.6.2 宜检查每只胎仔的外观变化。9.6.3 宜检查胎仔的骨骼和软组织变化(如变异和畸形或异常)。优先(但并不是必需)对胎仔异常进行分类。如果进行了分类,宜对每一类别的分类标准进行详细的说明。宜着重检查生殖道以发现任何异常发育。9.6.4 对于啮齿类动物,宜对每窝大约一半的动物进行骨骼异常检查。同时可采用合适的连续切片法或仔细的大体解剖法对剩余的动物进行软组织异常的检查。9.6.5 对于非啮齿类动物,如家兔,宜对所有的胎仔进行软组织和骨骼异常的检查。宜对这些胎仔的软组织异常进行仔细的解剖检查,包括对内部心脏结构的进一步检查,以评价这些胎仔的身体。宜仔细解剖一半胎仔的头部,采用标准的连续切片法或其他同样灵敏的方法检查软组织是否出现异常(包括眼睛、脑、鼻道和舌)。剩余的部分及其他胎仔宜采用与啮齿类动物同样的方法进行骨骼异常的检查。9.6.6 附录A附录C给出了胎鼠检查方法。1 0 数据分析1 0.1 数据应以表格的形式给出每只动物的数据并进行汇总,表中应显示试验开始前每组和每代动物数、试验过程中死亡或人道方式处死的动物数、死亡或人道方式处死时间、妊娠动物数、出现中毒症状的动物数以及所观察到的毒性症状的描述,包括毒性开始的时间、持续时间、所有毒性反应的严重程度、胎仔的类型以及所有窝相关的数据。1 0.2 宜采用适宜的统计方法以窝为单位对数据结果进行评价。宜使用普遍接受的统计方法;统计方法的选择宜为试验设计的一部分,推荐的统计学方法有方差分析(ANOVA)和卡方检验(2)等。宜报告那些没有存活到规定处死日期的动物数据,这些数据可包括在相关联的组均值中。宜根据个体情况来判断来源于该动物的数据的相关性,以此为依据判断这些数据是包括于组均值中还是从组均值中剔除。1 1 结果评价1 1.1 宜根据观察到的效应评价胚胎发育毒性研究结果。评价宜至少包括以下信息:a)母鼠和胎仔的试验结果,包括:评价动物接触试验物质与发病率及其程度的相关性或不相关性;b)胎仔外观、软组织、骨骼异常等的分类标准;c)适宜时,可参照历史对照数据来加强对试验结果的解释;d)计算所有百分率或指标时所用的动物数;e)研究结果充分的统计学分析,适宜时,宜包括分析方法的详细信息,以便独立的评审人员/统计学家能对分析进行再评价或重新分析。1 1.2 如试验证明受试物无毒性作用,宜考虑进一步研究确定受试物的吸收和生物利用度。1 2 试验报告试验报告宜至少包含以下信息:a)试验物质:5Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用 物理性质及理化特性,如相关;识别信息,包括已知/已确定的C A S号;纯度。b)介质(如适用):宜对介质的选择进行论证。c)试验动物:使用的种属和品系;动物的数量和年龄;来源、饲养条件和饲料等;试验开始时每只动物的体重。d)试验条件:剂量水平选择的说明;试验物制备方法的详细说明、浓度、稳定性和均匀度;给液的详细信息;将饲料/饮用水中的受试物的浓度(p p m)转化为实际剂量m g/(k gd),如适用;环境条件;食物和水质量的详细信息。e)试验结果:母体毒性反应数据(按剂量),包括但不仅限于:试验开始时的动物数,存活的动物数,妊娠动物数和流产动物数,以及早产动物数;试验过程中动物死亡日期或动物是否存活到试验结束;宜报告未存活到预定处死期的动物数据,但不参与组间对比;观察到任何一只有异常临床症状动物的日期及其随后的病程;体重、体重变化和妊娠子宫重量,包括通过体重来矫正妊娠子宫的重量;食物消耗量和水消耗量(如果测量);尸检结果,包括子宫重量;宜报告母体及其发育作用的NOA E L值。f)不同剂量组着床胎仔的发育情况,包括:黄体数;着床数、存活数和存活率死胎数和再吸收数;着床前、着床后流失的数量和百分比。g)不同剂量组活胎胎仔的发育,包括:活胎数和活胎率;性别比率;胎仔体重,优先按性别和性别组合;胎仔外观、软组织、骨骼畸形及其他相关异常变化;分类标准,如适用;外观、软组织、骨骼异常的活胎和死胎总数及其百分比,以及各种畸形和相关异常变化的种类和发生率。h)结果的讨论。i)结论。6Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用1 3 结果的解释胚胎发育毒性研究为了解多次接触某一试验物质对受孕动物的作用提供了信息。研究结果的解释宜与亚慢性、生殖毒性、毒代动力学及其他研究相结合。由于本试验重点观察了一般毒性和发育毒性终点,因此,试验结果可区分未出现一般毒性时的发育毒性和那些只在对母体动物有毒性的剂量水平才出现的发育毒性。7Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用附 录 A(资料性附录)试剂配制A.1 试验用水为蒸馏水。A.2 茜素红溶液:茜素红0.1g,氢氧化钾1 0g,蒸馏水10 0 0m L,室温避光储存。A.3 透明液A:甘油2 0 0m L,氢氧化钾1 0g,蒸馏水7 9 0m L。A.4 透明液B:甘油与蒸馏水等量混合。A.5 固定液(B o u i ns液):苦味酸饱和液7 5m L,甲醛2 0m L,冰醋酸5m L,室温储存。8Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用附 录 B(资料性附录)胎鼠骨标本的制作与检查B.1 胎鼠骨标本的制作将胎鼠放入9 5%(体积分数)乙醇中固定2周 3周,取出胎鼠流水冲洗数分钟后放入1g/1 0 0m L2g/1 0 0m L的氢氧化钾(KOH)溶液中(至少5倍于胎仔体积)浸泡8h7 2h,透明后放入茜素红-S应用液中染色6h4 8h,并轻摇1次/d 2次/d,至胎鼠头骨染红。再依次放入透明液A中1d 2d,放入透明液B中2d 3d。B.2 胎鼠骨标本的检查待骨骼染红而软组织基本褪色,将标本置于平皿中,用透射光源,在体视显微镜下作整体观察,然后逐步检查骨骼。测量囟门大小,矢状缝的宽度,头顶间骨及后头骨缺损情况,然后检查胸骨的数目,缺失或融合(胸骨为6个,骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨)。肋骨通常1 2对1 3对,常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目(颈椎7个,胸椎1 21 3个,腰椎56个,底椎4个,尾椎35个),有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。胎鼠骨骼检查项目见表B.1。注:也可采用剥皮法制备骨骼标本,即将胎鼠去皮、去内脏及脂肪后,放入茜素红溶液染色,当天摇动2次3次,待骨骼染成红色为止。将胎鼠依次置于透明液A中1d 2d,透明液B中2d 3d,待胎鼠骨骼染红,而软组织的紫红色基本褪去后,可将其置于甘油中。表B.1 胎鼠骨骼检查项目枕骨骨化中心、发育不全脊柱骨数目、融合、纵裂、部分裂开、骨化中心数、发育不全、缩窄、脱离、形状骨盆弓数目、骨化中心数、形状异常、融合、裂开缩窄、脱离四肢骨形状、数目腕骨骨化中心数掌骨形状趾骨形状肋骨数目、形状、融合、分叉、缺损、发育不全胸骨形状、完全缺损、胸骨节融合、裂开、形状异常、发育不全9Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用附 录 C(资料性附录)胎鼠头部和内脏检查C.1 胎鼠头部和内脏检查C.1.1 头部检查将胎鼠放入B o u i ns液中,固定2周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液,将鼠仰放在石蜡板上,剪去四肢和尾,用刀片在头部横切或纵切共5刀。按下列不同部位的断面观察头部器官的异常:a)经口从舌与两口角向枕部横切,观察大脑、间脑、延髓、舌及颚裂;b)在眼前面作垂直纵切,可见鼻部;c)从头部垂直通过眼球中央作纵切;d)沿头部最大横位处穿过作横切;以上切面的目的可观察舌裂、颚裂、眼球畸形、脑和脑室异常;e)沿下颚水平通过颈部中部作横切,可观察气管、食管和延脑或脊髓。C.1.2 胎鼠头部的常见异常如下:a)头部(脊髓);b)嗅球发育不全;c)侧脑室扩张;d)第三脑室扩张;e)无脑症;f)无眼球症;g)小眼球症;h)角膜缺损;i)单眼球。C.1.3 内脏检查自腹中线剪开胸、腹腔,依次检查心、肺、横膈膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置,查毕将其摘除,再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫或睾丸位置及发育情况。然后将肾脏切开,观察有无肾盂积水与扩大。胎鼠内脏的常见异常见表C.1。表C.1 胎鼠内脏的常见异常胸部腹部右位心肝分叶异常房间隔缺损肾上腺缺失室间隔缺损多囊肾主动脉弓马蹄肾食道闭锁膀胱缺失气管狭窄睾丸缺失无肺症卵巢缺失01Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用表C.1(续)胸部腹部多肺症卵巢异位肺叶融合子宫缺失膈疝子宫发育不全气管食管瘘肾积水内脏异位肾缺失输卵管积水Y Y/T1 2 9 2.22 0 1 5中国质量标准出版传媒有限公司内部使用510222921T/YY中 华 人 民 共 和 国 医 药行业标准医疗器械生殖和发育毒性试验第2部分:胚胎发育毒性试验YY/T1 2 9 2.22 0 1 5*中 国 标 准 出 版 社 出 版 发 行北京市朝阳区和平里西街甲2号(1 0 0 0 2 9)北京市西城区三里河北街1 6号(1 0 0 0 4 5)网址:www.g b 1 6 8.c n服务热线:4 0 0-1 6 8-0 0 1 00 1 0-6 8 5 2 2 0 0 62 0 1 5年6月第一版*书号:1 5 5 0 6 62-2 8 7 5 5版权专有 侵权必究