雄性密斑刺鲀与雌性六斑刺鲀人工杂交繁育技术研究.pdf

文章编号：（）：雄性密斑刺与雌性六斑刺人工杂交繁育技术研究收稿日期：修回日期：基金项目：海南热带海洋学院水产南繁联合开放课题（）作者简介：叶丙聪（），硕士研究生，主要从事水产养殖。：通信作者：岳彦峰（），副研究员。：叶丙聪，岳彦峰，黄海，彭士明，蒋科技（中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 ；海南热带海洋学院，海南三亚 ）摘要：密斑刺（）与六斑刺（）是种极具养殖开发潜力的经济鱼类，广泛分布于中国东南沿海。通过对刺亲鱼培育、性腺催熟、授精孵化及苗种培育等系列技术的摸索，以期建立 种刺人工杂交技术体系。针对亲鱼培育，通过人工调配强化饵料，试验组性腺指数均优于对照组，有效促进了性腺发育；在性腺催熟方面，采用注射适量绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素 的方式，使亲本的性腺同步率达到（），显著优于对照组；在授精孵化方面，通过人工授精方式和适宜的孵化条件，促使受精率达到（），孵化率达到（），显著优于对照组；在苗种培育阶段，通过调整仔稚鱼不同发育阶段的适口饵料，经过 培育，培育出全长（）幼鱼。研究结果可为进一步挖掘具有优良性状刺杂交品种的开发提供技术支撑，并对促进中国水产养殖品种向多元化发展，改善渔业产业结构具有重要的现实意义。关键词：密斑刺；六斑刺；营养强化；杂交技术中图分类号：文献标志码：刺（）是形目（）刺科（）鱼类的通称，在中国有 属种 ，其中密斑刺（）及六斑刺（）都俗称为气瓜仔、刺龟等。据报道 ，密斑刺最大体质量可达 ，体长 ；而六斑刺常见体质量 ，体长 。二者均为热带海洋底层鱼类，主要栖息于浅海礁石区、软质底海域或开放性水域，游动缓慢 ，主要于夜间捕食软体动物、海胆、寄居蟹及螃蟹等无脊椎动物。密斑刺与六斑刺肉质鲜美，鱼皮富含胶原蛋白，熬成的粥被誉为“天下 第 一 美 粥”，深 受 南 方 海 鲜 市 场 的 欢迎 。目前市场上的密斑刺与六斑刺全部来源于海洋捕捞，天然资源因过度捕捞呈锐减趋势 ，尤其是密斑刺，近海已难觅踪迹，仅西沙群岛和南沙群岛附近海域可见。刺人工养殖和繁育方面的研究少见报道 。杂交是水产种业工程中筛选和提高养殖物种性状的一种有效手段 ，目前应用较多的领域是在石斑鱼类选育 中，例 如，利 用 父 本（）鞍 带 石 斑 鱼（）与母本（）棕点石斑鱼渔业信息与战略 年（）杂交产生的新品种龙虎斑，具备了父本鞍带石斑鱼的生长速度，又具有母本棕点石斑鱼的繁育优势，并且在抗逆性能方面具有显著的优势，为石斑鱼类养殖提供了优质的种质资源 。本研究采用父本（）密斑刺与母本（）六斑刺进行杂交育种，利用密斑刺的个体大、生长迅速的特点，结合六斑刺性腺发育调控技术成熟、怀卵量大、初次性成熟年龄早的特点，通过杂交来获得生长快、个体大、育苗量多的刺新品种，结果对于选育养殖性状优良的刺新品种将具有重要的实际意义。鉴于密斑刺与六斑刺的繁殖季节不同，在人工培育条件下实现二者的性腺发育同步性是本研究的关键技术。通常的解决方法是采集雄性亲本的精液进行液氮冷冻保存，待雌性亲本性腺发育成熟后进行人工授精来获得杂交的胚胎。目前大部分石斑鱼的杂交育种，多采用这种技术方法，尤其在北方地区对杂交石斑鱼的培育，该方法已经取得了显著的成效。然而，刺的人工采集精液和人工授精，均由于刺这一物种的形态特殊性而操作难度巨大，同时又因为刺的卵巢发育为分批产卵类型导致成熟的卵子获取不易。本研究通过亲本的营养强化和环境因子调控的技术方法，促进密斑刺与六斑刺性腺发育和性成熟趋于同步，并辅助以注射适量的促熟激素，再用独特的人工授精方式使雄性密斑刺与雌性六斑刺实现精卵结合，获得优质的受精卵。初孵仔鱼在人工培育过程中，通过对营养和环境因子的不断摸索，最终成功培育至幼鱼阶段，为促进刺新品种的规模化养殖及其科学杂交繁育提供了参考依据。材料与方法 亲鱼来源与培育试验亲鱼来源于海南省琼海市潭门码头收购的野生密斑刺与六斑刺。挑选体表无伤、游动正常、体质量（）的雄性密斑刺，以及体质量（）的雌性六斑刺作为试验亲鱼。种亲鱼均采用类似的驯养方式，分别暂养在 水体的玻璃钢水槽中，每天定点定时投喂 次，饱食投喂。取经过暗沉淀、砂滤池过滤的海水作为亲鱼的培养用水：水温为 ，盐度为 ，溶解氧（，）保持 。密斑刺每天换水量 ，采用功率 的小水泵制造流水，流水；停歇时长控制在 ，无直射光，光照强度 ，光照时长昼夜比从 逐渐变至 ；六斑刺每天分 次换水，换水量 ，无直射光，光照强度 ，光照时长维持在昼夜比为 ：。换水和流水均错开投饵时间。营养强化试验。将刺（分别包括雄性密斑刺和雌性六斑刺）分为 组，每组 个重复，每个重复 尾鱼（雌雄各占 ）。试验组投喂基础饲料 强化饵料，对照组投喂基础饲料。刺的强化饵料配制如下：鱼宝饲料（日本林兼产业株式会社）、新鲜虾肉（海捕野生虾）、繁殖强化添加剂（表 ）、鱼油、维生素 、维生素 和 牛磺酸。密斑刺的饵料中再添加日本林兼产业株式会社生产的繁殖强化剂 ；六斑刺的饵料不再添加繁殖强化剂。每天早上 ：和中午 ：各投喂 次，饱食投喂，营养强化培养的时间为 。表 繁殖强化添加剂的成分比例 序号成分名称成分比例乌贼内脏粉 裂藻粉 海洋酵母 复合维生素 维生素 醋酸酯 大豆卵磷脂 南极磷虾粉 亲鱼性腺催熟亲鱼营养强化后，为保证亲鱼卵子与精子的同步成熟，对亲鱼进行催熟。雌性六斑刺催熟的方法为：注射绒毛膜促性腺激素（，）和促黄体素释放激素（，），注射次数为 次。第一次注射 为 单 位 ，为 ，注射时间为上午 。间隔 第 期叶丙聪，等：雄性密斑刺与雌性六斑刺人工杂交繁育技术研究，进行第二次注射，第二次注射 为 单位 ，为 。雄性密斑刺催熟方法为：注射 ，注射次数为 次。第一次注射 的剂量为 ，注射时间为上午 。间隔 ，进行第二次注射，第二次注射 的剂量为 。在注射完第二针催熟的激素 后，每间隔 检查 次雌性六斑刺个体。待观察到雌性六斑刺生殖孔外缘微红并松弛时，用吸管轻轻插入雌性生殖孔取少许卵子，镜检是否达到性成熟。若成熟，可进行人工挤压排卵。成熟的雄性密斑刺，轻微挤压其生殖孔会有白色精液流出。雌性与雄性的成熟系数及同步率计算方式见式（）式（）。雌性成熟系数 卵巢质量 鱼体质量 （）雄性成熟系数 精巢质量 鱼体质量 （）同步率 达到性成熟亲本数量 试验总亲本数量 （）人工授精用浓度为 丁香酚对亲鱼进行麻醉，分别对雄性密斑刺和雌性六斑刺进行取精和取卵，在取精和取卵前，用剪刀减去腹部棘刺。取精：将雄性密斑刺侧放解剖盘中，用湿毛巾遮住头部；将生殖孔用干燥纸巾擦干，用拇指和食指，在生殖孔上方约 两侧的地方，轻微朝生殖孔方向挤压。待有白色精液流出时，用吸管及时吸取，并将精液保存在温度为 的保温箱中备用。取精后的亲鱼放回培育池单独培养。取卵：将雌性六斑刺侧放于解剖盘中，用湿毛巾在生殖孔以上 处朝向头部包裹住。将生殖孔用干燥纸巾擦干，然后从 处，轻微朝生殖孔方向缓慢挤压，待有卵子流出时，将收集卵的器皿放在生殖孔下方进行收集，取卵后的亲鱼放回培育池单独培养。精卵结合：将提前取好的精子倒进装有卵的器皿中（精子与卵子比例为 ），用羽毛轻轻搅拌 使精卵充分结合，之后缓慢加入约 受精卵容积的海水，水温 ，盐度为 ，继续用羽毛轻轻搅拌约 ，再用洁净的同温同盐海水漂洗数次，洗去多余的精液，最后将受精卵倒入孵化桶中进行孵化，孵化的水温为 ，盐度 。按式（）和式（）分别计算受精率与孵化率。受精率 受精卵数 获卵总数 （）孵化率 初孵仔鱼数 受精卵数 （）苗种培育在杂交刺仔、稚鱼培育阶段，根据仔、稚鱼的生长 情 况，依 次 选 择 并 控 制 投 喂 密 度 为：轮虫 丰年虫无节幼体 个 培育水体、桡足类 个 培育水体、丰年虫成体 个 培育水体以及冰冻糠虾作为饵料，活体饵料均经小球藻强化培育 后投喂，各饵料种类重叠交叉 。后期逐渐驯化为颗粒饲料，每天每 进行 次投喂。仔、稚鱼培育管理：育苗海水经砂滤，盐度 ，水温 ，溶解氧 。每平方米 个充气头，光照强度控制在 以下。每天 和 分别记录育苗池水温，不定期测定盐度、和溶解氧含量。培育 后，每天清晨吸污，清除死鱼、残饵及排泄物。育苗前期，育苗池中仅每天添加水 ；后开始换水，换水量随仔、稚鱼发育而逐渐加大，从 逐渐增加到 。每天检查育苗池内饵料生物量，观察仔、稚鱼的生活习性，摄食情况以及形态变化，每天观察测定仔、稚鱼的生长情况，计算生长速度（式 ）。生长速度（）（试验末鱼平均全长 试验初鱼平均全长）天数（）试验结果 亲鱼营养强化结果营养强化 后，结果（表 ）显示：试验组中六 斑 刺 雌 鱼 性 腺 成 熟 系 数 为（），卵巢质量（），上述指标值均显著高于对照组；试验组中密斑刺雄性性腺成熟系数为（），其精子浓度（渔业信息与战略 年表 雄性密斑刺与雌性六斑刺营养强化结果 雌性六斑刺性腺成熟系数卵巢质量 卵巢卵直径 雄性密斑刺性腺成熟系数精巢质量 精子浓度（个 ）对照组（）（）试验组（）（）注：不同上标字母表示对照组与试验组存在显著差异（）：（）个 ，均显著高于对照组（）。性腺催熟性腺催熟结果（表 ）显示：试验组中，通过注射催性腺成熟激素，使雌性六斑刺性腺成熟系数达到（），雄性密斑刺性腺成熟系数达到（），同步率为（），与对照组相比，均有差异显著（）。表 亲鱼性腺催熟率 雌性性腺成熟系数雄性性腺成熟系数同步率对照组（）（）（）试验组（）（）（）注：不同上标字母表示对照组与试验组存在显著差异（）：（）授精孵化试验组中通过人工授精及控制适宜的孵化温度，使受精卵的受精率达到（），孵化率为（），与对照组相比（表 ），试验组能显著提高刺亲鱼受精卵的受精率及孵化率（）。表 受精卵的受精率及孵化率 受精率孵化率对照组（常温 ）（）（）试验组（）（）（）注：不同上标字母表示对照组与试验组存在显著差异（）：（）苗种培育结果杂交刺初孵仔鱼经过 的培育，生长到幼鱼阶段。如表 所示，龄的苗种成活率 ，龄的苗种成活率 ，龄的苗种成活率 ；平均全长分别为（）、（）和（）；生长速度为 、及 。表 苗种培育结果 平均成活率平均全长生长速度 龄 （）龄 （）龄 （）分析与讨论杂交选育是鱼类最普遍的育种方式之一，不仅能结合亲本的一些优良性状，同时能够丰富遗传结构的多样性，使得后代获得亲本原先不具有的优良性状，形成杂交优势 。郑炜强等 在大黄鱼（）选育试验中发现，通过野生群体与选育养殖群体的杂交，能选育出生长快、抗逆性高的优质群体，从而提高大黄鱼子代的经济性状。郑元强等 通过杂交选育，将黄河鲤（）抗病性强、生长快、骨架大等优良基因在子代锦鲤中不断固定，定向培育出目标性状稳定、品质较高的优质国产锦鲤品种。徐 田 军 等 在 筛 选 抗 鳗 弧 菌 病 的 牙 鲆（）家系试验中，通过日本牙鲆与中国牙鲆间的杂交进行遗传改良，培育出了产量高、抗病性强的牙鲆新品种，奠定牙鲆养殖业健康高效的发展基础。亲鱼的性腺发育可以通过环境因子和饲料中营养物质的调控来达到促性腺发育的目的，如茎柔鱼（）生殖能量积累中，性腺发育对环境波动敏感性较高，生殖投入方式显示出相应的环境适变性，并且与生殖产卵策略有关 。在研究环境因子对第 期叶丙聪，等：雄性密斑刺与雌性六斑刺人工杂交繁育技术研究性腺发育影响作用的同时，饲料的营养强化也具有重要的作用 。营养强化，即保证亲本营养充足供给，既是满足鱼类生长发育、维持生理活动的基本需求，也是提高亲本的性腺发育、配子质量及幼鱼孵化率和成活率的物质保证。亲本饵料中充足的营养和能量对于其性腺成熟是必要的，并影响亲鱼的性腺发育、性成熟、受精率、受精卵孵化率及苗种存活率和质量 。本试验中，通过强化饵料营养，保证亲鱼刺性腺发育的营养需求，促进了亲鱼刺性腺良好发育。同时，性腺发育也需要特殊的营养物质来强化，如水产饲料中，脂肪含量水平及其组成部分中卵磷脂和磷脂酰乙醇胺是亲鱼卵巢主要的磷脂来源，磷脂能够提高鱼类的生殖能力和产卵频率，以及改善配子质量和孵化率，从而能提高幼体发育质量 。本试验在性腺发育的强化添加剂中，除了大豆卵磷脂，同时还添加了乌贼内脏粉、裂壶藻粉、海洋酵母和南极磷虾粉等，这些原料中同样包含了卵磷脂的成分，能够满足亲鱼发育过程中所需要的卵磷脂 。另外，饲料中不饱和脂肪酸，如二十二碳六烯酸（，）和二十碳五烯酸（，）是亲鱼性腺发育的重要营养素，对亲鱼产卵效果、精卵质量和仔稚幼鱼的生长发育都有显著影响。等 在研究饲料 比例对西伯利亚鲟（）产卵性能、卵子和子代质量的影响中，特别强调了 对西伯利亚鲟繁殖性能的重要影响，饲料中高含量的 可以提高卵粒中 、和总多不饱和脂肪酸（，）含量，以及雌鱼血液中的雌二醇、酮基睾酮和黄体激素含量，从而提高雌鱼的繁殖性能。本试验投喂亲鱼的营养强化添加剂的成分中富含 和 等高不饱和脂肪酸，保证了强化添加剂能满足亲鱼性腺的发育。杂交的主要目的是为了获得杂种优势，为开发有价值的杂交组合提供依据。等 在研究印度尼西亚个不同地区的种鲤品系完全杂交的优势分析中发现，某些品系的杂交子代能产生较高的正特定配合力和杂种优势，提高原亲本的利用潜力，尤其是显性遗传方差对鲤鱼的表型性状表达影响更大。等 研究杂交选 育 后 低 眼 无 齿 巨 鲶（）进行免疫反应的过程中发现，通过攻击感染后，杂交子代群体的特异性免疫应答显著高于普通群体。范武江等 在研究日本沼虾（）杂交选育群体子代与地方群体子代形态的通径分析中发现，杂交子代在生长发育、免疫及抗逆相关基因的表达方面表现出显著的杂交优势。这表明，水产动物遗传改良的育种方案可以通过杂交来进行。本试验通过雄性密斑刺和雌性六斑刺杂交方法得到的杂交刺其 龄苗种生长速度 ；比六斑刺苗种生长速度提高 以上，相对于六斑刺的生长速度，得到了显著提升 。综上，本试验通过人工授精的方式使雄性密斑刺与雌性六斑刺实现精卵结合，得到高质量的杂交受精卵，经过后期苗种培育，得到一定规模数量的苗种。密斑刺与六斑刺杂交技术的实现，可促进中国水产养殖品种向多元化发展，对于改善渔业产业结构、促进产业经济发展具有重要的现实意义。参考文献：苏志星，岳彦峰，施兆鸿，等六斑刺仔稚鱼发育过程中消化酶和非特异性免疫因子的活性变化 海洋渔业，（）：苏锦祥中国动物志：硬骨鱼纲形目，海蛾鱼目，喉盘鱼目，?目 北京：科学出版社，岳彦峰，彭士明，张晨捷，等六斑刺人工育苗技术研究 渔业信息与战略，（）：岳彦峰，苏志星，彭士明，等六斑刺苗种的养殖技术 水产养殖，（）：岳彦峰，苏志星，彭士明，等野生六斑刺的人工驯养技术 中国水产，（）：，（：），（），（）：孟振，刘新富，雷霁霖，等略论我国海水鱼类苗种繁育和种质改良的研究 渔业信息与战略，（）：，谢起浪，刘伟成，单乐州，等海水鱼类人工繁育技术的研究进展 水产科学，（）：渔业信息与战略 年 王林娜，田永胜，李振通，等棕点石斑鱼、杂交“金虎斑”及珍珠龙胆的肌肉营养成分分析及品质评价 水产学报，（）：熊阳，王帅，郭稳杰，等不同动物饵料 超雄黄颡鱼性腺发育的影响 水产学报，（）：，（），（）：郭建丽，马爱军，岳亮，等鱼类抗逆性状选育研究进展 海洋科学，（）：郑炜强，黄伟卿，韩坤煌，等大黄鱼选育群体与野生群体杂交 生长性状研究 水产科学，（）：郑元强，马嵩，苏锷，等锦鲤与黄河鲤杂交选育试验 中国水产，（）：徐田军，陈松林，田永胜，等牙鲆抗鳗弧菌病家系筛选及其分析 中国水产科学，（）：连晋欣茎柔鱼生殖能量积累及对栖息海域环境的响应关系 上海：上海海洋大学，吕峰，巩杰，倪建忠，等不同饵料投喂对南美白对虾亲虾性腺成熟及 基因表达的影响 黑龙江畜牧兽医，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：常国亮，葛永春，邓登，等种饵料对中华绒螯蟹卵巢发育和育肥效果的影响 水产科学，（）：，（），：，（），（）：，（），：范武江，陆根海，朱俊鹏，等 日本沼虾杂交选育群体 和亲本群体的形态性状对体重影响的通径分析 中国水产科学，（）：第 期叶丙聪，等：雄性密斑刺与雌性六斑刺人工杂交繁育技术研究 ，（，；，）：，（），（）（），（），：；