离缘蝽的触角转录组和嗅觉相关基因.pdf

引文格式：柳大军,付淑慧,郭青枝,等.离缘蝽的触角转录组和嗅觉相关基因J.云南农业大学学报(自然科学),2024,39(2):1016.DOI:10.12101/j.issn.1004-390X(n).202303048离缘蝽的触角转录组和嗅觉相关基因*柳大军，付淑慧，郭青枝，靳辉，施宝仪，王洪潇，张虎芳*，史晓晶*(忻州师范学院生物系，山西忻州034000)摘要:【目的】获得离缘蝽(Chorosoma macilentum)成虫触角的转录组数据，通过功能注释鉴定嗅觉相关基因，以期为研究离缘蝽触角信息交流的分子基础提供理论依据。【方法】采用 IlluminaHiSeq 高通量测序平台对离缘蝽雌、雄成虫触角转录组进行测序，并对相关数据进行注释和表达差异分析。【结果】经组装后获得93395 条 unigenes，其中 22904 条在 NR 数据库得到注释，与茶翅蝽(Halyomorpha halys)相似性最高，为42.84%。GO 注释结果显示：26769 条 unigenes 根据其功能注释到细胞组分、分子功能和生物学过程 3 类53 个亚类。KEGG 代谢通路分析结果显示：10831 条 unigenes 参与了 5 类代谢通路，且以信号转导占比最高，为 11.62%。基于注释信息，在离缘蝽触角转录组中挖掘出 94 个嗅觉相关基因，包括 54 个嗅觉受体基因、25 个气味结合蛋白基因、7 个化学感受蛋白基因、5 个味觉受体基因和 3 个感觉神经元膜蛋白基因。表达差异分析显示：与雌虫触角转录组相比，离缘蝽雄虫触角转录组包括 131 个上调表达基因和 171 个下调表达基因，下调表达基因中包含 1 个化学感受蛋白基因，且有 5 个嗅觉受体基因仅在雄成虫触角中表达。【结论】本研究测得了离缘蝽成虫触角转录组，筛选出嗅觉相关基因，推测雌、雄离缘蝽成虫对外界气味化合物的识别存在差异，差异表达基因可能在离缘蝽信息识别过程中发挥着重要作用。关键词:离缘蝽；触角；转录组测序；嗅觉相关基因；差异表达基因中图分类号:Q969.352.2文献标志码:A文章编号:1004390X(2024)02001007Antennal Transcriptome and Olfactory-related Genes ofChorosoma macilentumLIUDajun，FUShuhui，GUOQingzhi，JINHui，SHIBaoyi，WANGHongxiao，ZHANGHufang，SHIXiaojing(DepartmentofBiology,XinzhouNormalUniversity,Xinzhou034000,China)Abstract:PurposeToobtainantennaltranscriptomedataofChorosoma macilentumandidenti-fytheolfactory-relatedgenes,providingtheoreticalfoundationforthemolecularfunctionofantennalinformationcommunication.MethodsThetranscriptomicdatabaseofC.macilentumwasestab-lishedusingIlluminaHiSeqhigh-throughputsequencing,andtherelateddatawereannotatedandexpresseddifferently.ResultsTotally93395unigeneswereobtainedthroughassemblingaftertranscriptomesequencing,ofwhich22904unigeneswereannotatedbasedontheNRdatabase,and收稿日期：2023-03-23修回日期：2024-03-25网络首发日期：2024-04-17*基金项目：山西省基础研究计划青年科学研究项目(20210302124140)；山西省基础研究计划自然科学研究面上项目(202103021224331)。作者简介：柳大军(1989)，男，山西右玉人，博士，讲师，主要从事昆虫分子进化研究。E-mail：*通信作者 Correspondingauthors：张虎芳(1962)，女，山西新绛人，博士，教授，主要从事昆虫系统学研究。E-mail：zh_；史晓晶(1983)，女，山西祁县人，博士，教授，主要从事害虫生物防治研究。E-mail：网络首发地址：https:/ halys(42.84%).AnnotatedresultsofGOdatabaseshowedthat26769unigenesdividedinto53subcategoriesandthreetypes(cellularcomponents,molecular functions,and biological processes).KEGG metabolic pathway analysisshowedthat10831unigeneswereannotatedintofivemetabolismpathways,andmostunigeneswereinvolvedinsignaltransduction(11.62%).Basedontheannotatedinformationofunigenes,94genesencodingolfaction-relatedproteinsofC.macilentum,including54olfactoryreceptorproteingenes,25odorantbindingproteingenes,sevenchemosensoryproteingenes,fivegustatoryreceptorgenes,andonesensoryneuronmembraneproteingenes.Comparedwiththetranscriptomeoffemalean-tenna,thetranscriptomeofmaleantennaincluded131up-regulatedgenesand171down-regulatedgenes,andthedown-regulatedgenescontainedonechemoreceptorproteingene,andfiveolfactoryreceptorgeneswereexpressedonlyintheantennaeofmaleadults.ConclusionInthisstudy,theantennaltranscriptomesofadultbugsaredetermined,andtheolfactory-relatedgenesarescreenedout.The results indicate that female and male adults have different recognition of external odorcompounds,andtheolfactorydifferentiallyexpressedgenesmayplayanimportantroleintheinfor-mationrecognitionprocesses.Keywords:Chorosoma macilentum;antenna;transcriptomesequencing;olfaction-relatedgenes;dif-ferentiallyexpressedgenes嗅觉在昆虫取食、交配、产卵、定位寄主等重要生命过程中具有不可替代的作用，对种群的生存和繁衍也有重要的影响1-2。作为感受外界信号的主要器官，昆虫的触角上有识别不同气味的嗅觉蛋白，在进化过程中形成了一套能够感知环境中各类信息物质的独特嗅觉感受系统。嗅觉的完成需要多种与嗅觉相关的基因发挥作用，如气味结合蛋白基因、化学感受蛋白基因、嗅觉受体基因等3-5。研究昆虫嗅觉相关基因对进一步了解昆虫嗅觉机制、调控昆虫行为和进行生物防治具有重要意义。近年来，随着第 2 代测序技术的发展和广泛普及，昆虫的转录组学研究也得到快速的发展，转录组测序应用范围也越来越广，如挖掘功能基因、分析基因表达等6-8。目前，运用昆虫触角转录组学研究嗅觉相关基因的研究已有报道，如：从不同形态的麦长管蚜(Sitobion avenae)成虫触角转录组数据中鉴定出该昆虫气味结合蛋白和化学感受蛋白的种类9；从七星瓢虫(Coccinellaseptempunctata)触角转录组数据中鉴定出触角嗅觉相关基因，且这些基因与食性分化有一定的关系10；从花椒窄吉丁(Agrilus zanthoxylumi)成虫触角转录组中挖掘出嗅觉有关基因并进行功能注释11。昆虫触角转录组学研究可以提供大量分子标记和遗传学信息，为害虫防治、物种系统发生进化关系等研究奠定了良好的基础。离缘蝽(Chorosoma macilentum)隶属于半翅目(Hemiptera)异翅亚目(Heteroptera)姬缘蝽科(Rhopalidae)，多喜食禾本科植物，如小麦、白茅、披碱草、无芒雀麦等。离缘蝽常群集于植株上部，吸食幼嫩部分的汁液，导致植物枯萎、果实脱落，甚至死亡12。此外，碱草等禾本科牧草也是离缘蝽的常见寄主，内蒙古草原中若虫于6 月盛发，7 月中、下旬羽化，8 月下旬逐渐蛰伏过冬13。目前，关于离缘蝽的研究多局限于其分类的探讨，对其防治的研究较少14-15，且其触角嗅觉相关基因的研究尚未见报道。本研究采用 Il-luminaHiSeq 高通量测序平台对离缘蝽雌、雄成虫触角转录组进行测序，对 unigenes 进行基因功能注释，研究结果可为今后研究离缘蝽嗅觉蛋白的作用机制提供理论支撑，也为开展害虫绿色防控提供参考。1 材料与方法1.1供试昆虫离缘蝽采自山西省忻州市忻府区(112.68N，38.51E)，选取活动能力较强的雌、雄成虫各 100只，切下触角并立即放入液氮中保存备用。第2期柳大军，等：离缘蝽的触角转录组和嗅觉相关基因111.2总 RNA 的提取和检测采用 RNeasyMini 试剂盒(天根生化科技，北京)提取离缘蝽雌、雄成虫触角总 RNA，具体操作按说明书进行；采用 Nanodrop2000 和 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的浓度和纯度；采用Agilent2100Bioanalyzer 检测 RNA 的完整性。1.3cDNA 文库的构建和测序通过 Oligo 磁珠富集总 RNA 中带有 polyA 结构的 mRNA。由于接头长度是固定的，若片段较短，将导致接头序列的比例偏高，从而降低有效数据的比例；若片段较长，则不利于上机测序过程中簇的生成，因此，采用离子打断的方式，将RNA 打断为长度约 300bp 的片段。以 RNA 为模板，用 6 碱基随机引物和逆转录酶合成第 1 链cDNA，并以此为模板合成第 2 链 cDNA，构建cDNA 文库。之后，采用 PCR 扩增进行文库片段富集，再根据片段大小选择 450bp 的文库。根据文库上机有效浓度以及下机文库所需数据量，将含有不同 Index 序列的文库按等摩尔的比例混合。样品经过建库后，基于 IlluminaHiSeq 测序平台进行文库双末端高通量测序。cDNA 文库的构建和测序由派森诺(上海)生物公司进行。1.4转录本的拼接和组装对原始下机数据进行过滤，去除带接头且长度小于 50bp、平均质量在 Q20 以下的 reads，采用 Trinity 软件对得到的高质量序列(cleanreads)进行从头拼接进而得到转录本序列。将拼接得到的 Contigs 按由短到长的顺序依次排列，按照总长度的一半或 90%找到对应的 Contig，该长度即为 N50(或 N90)，用于衡量测序质量，长度越长，说明测序质量越好。转录本聚类后，将最长的转录本作为 unigene 进行非冗余蛋白(non-redundantproteins，NR)、基因本体(geneontology，GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG)等数据库注释预测；同时，将过滤后的序列比对到 unigene，得到每个unigene 的 reads 数量。1.5转录组数据分析及嗅觉相关基因鉴定通过 BLAST 同源搜索从转录组数据中鉴定嗅觉相关基因。在基因表达量分析中，以 FPKM值(fragmentsperkilobaseofexonmodelpermillionmappedreads，即每千个碱基转录每百万映射读取的碎片)评估不同嗅觉基因在雌、雄成虫中的表达量。采用 R 语言的 DESeq 包对基因进行表达差异显著性分析，将表达差异倍数|log2(Fo-ldChange)|1 或显著性 P0.05 作为筛选差异表达基因的条件。2 结果与分析2.1序列测序与组装由表 1 可知：离缘蝽雌、雄成虫触角转录组经测序和筛选后得到的总碱基数均大于 6Gb；碱基质量值超过 Q30 的碱基占比均为 92.08%，超过 Q20 的碱基占比分别为 96.89%和 96.83%，组装完整性较好。cleanreads 进行拼接组装后，共获得 195063条转录本，平均长度为 902bp，N50 为 1232bp，N90 为 399bp，GC 含量为 35.75%；提取每个基因中最长的转录本为 unigene，共获得 93395 条unigenes，平均长度为 765bp，N50 为 915bp，N90为 364bp，GC 含量为 35.81%(表 2)。unigenes 长度分布结果显示：随着序列长度的增加，unige-nes 的数量逐渐减少(表 3)。2.2基因功能注释将获得的 unigenes 序列在公共数据库中进行BLAST 比对，得到离缘蝽触角 unigenes 的功能注释结果(表 4)。其中，注释到 unigenes 数量最多的是 NR 数据库，占比为 24.52%。在所有数据库中均注释成功的 unigenes 有 2993 条，占比为 3.20%。经 NR 数据库比对注释到离缘蝽触角转录组unigenes22904 条，其中与茶翅蝽(Halyomorphahalys)的相似度最高，占比为 42.84%；其次分别为点蜂缘蝽(Riptortus pedestris，4.38%)、温带臭虫(Cimex lectularius，4.27%)、豌豆蚜(Acyrthosiphon表 1 离缘蝽雌、雄成虫触角样品转录组测序结果Tab.1SequencingresultsofantennaetranscriptomesamplesfromfemaleandmaleadultsofChorosoma macilentum样本sample原始总读数totalrawreads筛选后总读数totalcleanreads筛选后总碱基数/GbtotalcleanbasesQ20占比/%proportionofQ20Q30占比/%proportionofQ30雌性female42097490398565706.0296.8992.08雄性male42588210400550686.0596.8392.0812云南农业大学学报第39卷pisum，3.13%)、柑橘木虱(Diaphorina citri，2.70%)、黑褐毛山蚁(Lasius niger，2.41%)、家蚕(Bombyxmori，1.83%)。在该数据库的比对中，E 值为 0的 unigenes 占 3.26%，0E10100的 unigenes 占19.20%；10100E1060的unigenes 占13.68%，1060E1045的 unigenes 占 8.71%，1045E1030的unigenes 占 11.94%，1030E1015的 unigenes 占19.07%，101510)占 12.59%，其中，10FPKM100 的基因数为 11079 个，100FPKM10)占 12.59%，包括 131 个上调表达基因和 171 个下调表达基因，且下调表达基因中有 1 个化学感受蛋白基因。此外，基因表达量分析显示：有 5 个嗅觉受体基因仅在雄成虫触角中表达。以上结果均表明离缘蝽雌、雄成虫对外界气味化合物的识别存在差异。其他昆虫如茶谷蛾(Agriophara rhombata)雌、雄触角转录组中有 7 个上调表达基因和 5 个下调表达基因，推测嗅觉差异表达基因可能在性信息素识别过程中发挥着重要作用24；花椒窄吉丁的OBP 基因中，AzanOBP1 和 AzanOBP2 在雌成虫触角中不表达，在雄成虫触角中微量表达，推测高丰度表达的 OBP基因功能与雄成虫识别同类异性释放的信息素或寄主植物释放的挥发物有关9；绿芫菁(Lytta caraganae)的 2 个 OBP 基因和 2 个CSP 基因在雄成虫触角中高表达，10 个 OBP 基因和 2 个 CSP 基因在雌成虫触角中高表达，推测这些基因可能在交配或与寄主互作时发挥重要作用30。嗅觉差异表达基因还可能对离缘蝽寻找寄主、选择产卵场所、通信联络、寻觅异性等识别过程有较大影响，在后续离缘蝽生态学分子机制研究中，可以将这些差异表达基因作为重点研究对象。4 结论本研究采用第 2 代测序技术，结合生物信息学方法对离缘蝽的触角转录组进行测序及分析，构建了离缘蝽雌、雄成虫触角转录组数据库，丰富了异翅亚目昆虫基因数据。对所有组装得到的unigenes 进行注释后，筛选得到 94 个与嗅觉相关的基因，这些基因具有不同的功能类型，为后续利用嗅觉信息物质进行离缘蝽生物防治提供了重要的分子信息。参考文献刘一博,刘俊峰,马烨,等.昆虫化学通讯之谜J.应用昆虫学报,2020,57(5):1057.DOI:10.7679/j.issn.2095-1353.2020.106.1吴帆,张莉,邱一蕾,等.昆虫嗅觉结合蛋白研究进展J.昆虫学报,2021,64(4):525.DOI:10.16380/j.kcxb.2021.04.011.2蔡普默,张琪文,宋蕴哲,等.双翅目昆虫触角感受器种类与功能研究进展J.江西农业大学学报,2021,43(3):574.DOI:10.13836/j.jjau.2021064.3PELOSI P,ZHU J,KNOLL W.Odorant-binding 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