鱼腥草破壁饮片单次和重复给药毒性试验.pdf

基金项目:广东省科技领军人才项目(.)广东省重点领域研发计划“新药创制”重点专项(.)广州市农业和社会发展科技项目(.)中山市科技计划项目(.)作者简介:雷夏凌女高级工程师研究方向:新药临床前安全性评价:.通信作者:杨威男博士教授正高级工程师博士生导师研究方向:新药药理毒理:.鱼腥草破壁饮片单次和重复给药毒性试验雷夏凌邓雯陈炜璇戴锦龙郭健敏黄远铿张前亮成金乐杨威(.广州湾区生物医药研究院广东莱恩医药研究院有限公司广东省药物非临床评价研究企业重点实验室国家中药现代化工程技术研究中心中药非临床评价分中心广东省创新药物评价与研究工程技术研究中心广东 广州.中山市中智药业集团有限公司广东 中山.国家企业技术中心广东 中山.中药破壁饮片国家地方联合工程研究中心广东 中山)摘要:目的 研究大鼠单次和重复给予鱼腥草破壁饮片后的毒性反应为临床研究及应用提供参考的依据方法 鱼腥草破壁饮片和鱼腥草饮片均以.的最大给药量单次灌胃给予大鼠观察毒性反应并持续观察 周鱼腥草破壁饮片以.、.、.鱼腥草饮片.、.连续 个月对 大鼠灌胃给药恢复期 周进行临床观察、体重、摄食量、血清生化学、血液学、肾损伤生物标志物及病理学等各项检查 结果鱼腥草破壁饮片、鱼腥草饮片以.对 大鼠单次灌胃给药未见明显毒性反应鱼腥草破壁饮片及鱼腥草饮片重复给药 个月各剂量组各项检查均未见异常 结论 鱼腥草破壁饮片、鱼腥草饮片单次经口给药对 大鼠的最大耐受剂量().鱼腥草破壁饮片、鱼腥草饮片对 大鼠连续灌胃给药 个月的无毒作用剂量()为.鱼腥草破壁饮片、鱼腥草饮片在相同给药剂量下 大鼠毒性反应无明显区别关键词:鱼腥草破壁饮片鱼腥草饮片单次给药毒性试验重复给药毒性试验肾脏毒性中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):.药学研究 .().().:.在 年 月美国的权威医学期刊科学转化医学发表了一篇论文指出大部分马兜铃科的中草药含有马兜铃酸()马兜铃酸不论剂量大小都对肾脏造成不可逆的损伤持续引发了业界对马兜铃酸是否引起肾毒性的激烈争论 鱼腥草非马兜铃科但其含马兜铃酸在体内的代谢产物马兜铃内酰胺()成分马兜铃内酰胺作为马兜铃酸类似物()其安全性一直备受争议 鱼腥草为三白草科蕺菜草本植物的新鲜全草和地上干燥部分挥发油、黄酮类、生物碱、多糖化合物为鱼腥草的主要成分其中生物碱类分离所得的马兜铃内酰胺有、目前无相关报道证明鱼腥草中含具有肾脏毒性成分的马兜铃酸、(、)和马兜铃内酰胺()马兜铃酸的主要毒性表现为肾小管上皮细胞坏死及凋亡、肾小管功能障碍、肾间质纤维化马兜铃酸在人体内代谢成马兜铃内酰胺进而与 结合损害肾脏纤维化导致尿路上皮癌造成不可逆的肾损伤但报道显示有毒性的仅仅是马兜铃内酰胺 多认为其马兜铃内酰胺 的肾毒性不明确 肾脏机体功能完整性对整体的稳态极为重要发生肾脏中毒后果可能很严重但鱼腥草的肾脏毒性的报道较少因此亟须进行相关的研究新型饮片鱼腥草破壁饮片经破壁技术处理基本实现了对原饮片全成分的转移中药材经破壁粉碎后有效成分、无效成分的暴露水平增加继而可能存在不良反应增大的风险 鉴于目前对鱼腥草的安全性及其所含马兜铃内酰胺类成分的肾毒性研究仍不够充分本研究通过对鱼腥草破壁饮片进行单次和重复给药毒性试验研究并针对马兜铃酸、马兜铃内酰胺 的肾毒性特征检测相关肾毒性标志物的表达水平评论其非临床安全性及与传统丹参饮片的差异以期为鱼腥草破壁饮片临床应用的安全性及鱼腥草中马兜铃内酰胺类成分的肾毒性研究提供参考依据 材料.药物 单次给药毒性试验:鱼腥草破壁饮片(批 号:)、鱼 腥 草 饮 片(批 号:)重复给药毒性试验:鱼腥草破壁饮片(批 号:)、鱼 腥 草 饮 片(批 号:)以上药物均来源于相同批次原料执行广东省中药破壁饮片质量标准研究规范(试行)中山市中智药业集团有限公司提供.主要试剂 单次给药毒性试验:异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司批号:)羧甲基纤维素钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司批号:)重复给药毒性试验:异氟烷(深圳市瑞沃德生命 科 技 有 限 公 司批 号:、)羧甲基纤维素钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司批号:)大鼠肾损伤分子 检测试剂盒(广州开晨生物科技有限公司批号:、)微球蛋白检测试剂盒(浙江伊利康生物技术有限公司批号:)乙酰氨基葡萄糖苷酶试剂盒:(浙江伊利康生物技术有限公司批号:)大鼠免疫球蛋白 检测试剂盒(广 州 开 晨 生 物 科 技 有 限 公 司 批 号:)大鼠免疫球蛋白 检测试剂盒(批号:)大鼠免疫球蛋白 检测试 剂 盒(广 州 开 晨 生 物 科 技 有 限 公 司 批 号:)大鼠免疫球蛋白 检测试剂盒(广州开晨生物科技有限公司批号:).实验动物 单次给药毒性试验 大鼠 只 周龄体重 重复给药毒性试验 药学研究 .大鼠 只 周龄体重 以上动物为 级购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司实验动物生产许可证号:(湘)实验动物饲养于 级动物房所有环境技术指标均符合 屏障环境技术要求实验动物使用许可证号:(粤)本动物实验经福利伦理委员会审查批准伦理审查证书编号:、.主要仪器 型全自动血液分析仪(日本 公司)型尿液分析仪(桂林市医疗电子仪器厂)日立 全自动生化分析仪(日本日立公司)酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)生物显微镜(德国 公司)药物制备与分析.药物制备 鱼腥草破壁饮片混悬液:称取鱼腥草破壁饮片加入.溶液至一定体积倒入破壁草本料理机搅拌 配成所需浓度的混悬药液 鱼腥草饮片水煎液:称取鱼腥草饮片至全自动煎药壶中加水浸泡 第一次武火煮沸文火再煎煮 过滤出第一次煎煮液第二次在滤渣中加水武火煮沸文火再煎煮 合并配成所需浓度的鱼腥草饮片溶液.药物分析情况 以槲皮素为检测成分.浓度范围内的鱼腥草破壁饮片混悬液和.浓度范围内的鱼腥草饮片溶液室温条件下各时间点浓度测定值的 均小于保存 基本稳定鱼腥草破壁饮片溶液和鱼腥草饮片溶液配制系统合格 方法.单次给药毒性试验 试验选用 大鼠 只按体重和性别均衡随机分为 组分别为阴性对照组、鱼腥草破壁饮片组(.、最大给药剂量)、鱼腥草饮片组(.)每组 只动物雌雄各半 各组均 灌胃给药鱼腥草破壁饮片组 给药 次 次给药时间至少间隔 鱼腥草饮片 内单次灌胃给药 各组给药后连续观察至少 以后每天观察 次持续观察 周 进行动物临床观察内容:外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、排泄物性状、饮食情况、中毒反应和死亡情况等.重复给药毒性试验 试验选用 大鼠 只分为 阴 性 对 照 组、鱼 腥 草 破 壁 饮 片 高 .()最大给药剂量、中.()、低.()剂量组、鱼腥草饮片组.()只/组雌雄各半 阴性对照组、鱼腥草破壁饮片高、中、低剂量组组均每天给药 次鱼腥草饮片高、低剂量组组每天给药 次连续给药 个月恢复期 周 试验期间每天进行临床观察每周测定 次动物体重和摄食量在给药中期、给药结束、恢复期分别剖检、只动物进行血液学、凝血功能、血清生化学、病理学、免疫球蛋白、尿常规、生物标志物及病理学等各项检查 全自动生化分析仪检测晨尿的谷氨酸脱氢酶()、乙酰氨基葡萄糖苷酶()、微球蛋白采用 法检测肾损伤分子()结果.单次给药毒性试验 试验期间鱼腥草破壁饮片组、鱼腥草饮片组、阴性对照品组动物均没有出现死亡大鼠的临床观察、摄食量、体重及病理大体解剖观察均未见异常.重复给药毒性试验.临床观察 试验期间各剂量组及阴性对照组的外观体征、行为活动、分泌物、对刺激的反应、呼吸、排泄物、中毒反应和死亡情况等均未见异常的改变.摄食量与体重鱼腥草破壁饮片高剂量组雄性动物在给药期间摄食量普遍减少但动物体重与阴性对照组比较无明显差异其他组别摄食量均未见异常各剂量组及阴性对照组动物的体重均未发现与受试物相关的异常变化.血液学及凝血功能 在给药末期雌性动物方面鱼腥草饮片高剂量组的 有所升高鱼腥草破壁饮片高剂量组的 有所延长以上反应在正常变化范围内变化幅度小无毒理学意义 各剂量组动物的血液学指标均未发现有毒理学意义的异常变化.生化学各剂量组动物的肾功能指标血清尿素氮()、肌酐()、尿酸()及其他生化学指标均未发现有毒理学意义的异常变化.免疫球蛋白各剂量组动物的、均未发现异常改变.脏器重量和系数各剂量组动物的各脏器重量和系数均在正常范围内结果见表.尿酶、尿低分子蛋白、全自动生化分析仪检测晨尿的谷氨酸脱氢酶()、乙酰药学研究 .氨基葡萄糖苷酶()、微球蛋白采用 法检测 给药末期和恢复期鱼腥草破壁饮片及鱼腥草破壁饮片各组、均未见异常给药末期结果见表 表 大鼠肝脏、肾脏的脏器重量、脏体系数、脏脑系数结果(给药末期)试验时间组别脏器重量/脏体系数()脏脑系数()肝脏肾脏肝脏肾脏肝脏肾脏雌性雄性阴性对照组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.阴性对照组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.注:与阴性对照组比较.脏体系数脏器湿重/动物体重脏脑系数脏器湿重/动物脑湿重表 大鼠、结果(给药末期)性别组别/雌性雄性阴性对照组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.阴性对照组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草破壁饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.鱼腥草饮片.()组.尿常规 给药末期及恢复期鱼腥草破壁饮片及鱼腥草破壁饮片各组尿常规指标均未见异常.免疫球蛋白 给药末期及恢复期各剂量组动物的、均未发现异常改变.病理学检查以.()剂量鱼腥草破壁饮片和.剂量鱼腥草饮片对 大鼠连续 个月灌胃重复给药后均未引起大鼠器官组织异常变化 结论与讨论鱼腥草多产于我国中部、东南与西南部各省于古籍中常称之为蕺是我国使用数千年的传统中药鱼腥草得到广泛应用除传统饮片外其现代制剂涵盖多种剂型口服制剂和外用制剂在临床上使用出现的不良反应较少鱼腥草注射剂临床上的不良 反 应 较 多主 要 为 过 敏 性 皮 炎、过 敏 性 休克诱发过敏的原因可能与不定量成分、不溶性微粒、原料药材、制备工艺等相关 关于鱼腥草各类制剂的动物毒性实验文献资料数量有限汤杰等采用鱼腥草鼻用喷雾、鱼腥草鲜汁原液、新鱼腥草素钠进行单次给药毒性试验鱼腥草煎剂腹腔注射对小鼠的 为(.)经口和鼻腔途径给药后动物均未见明显毒性反应重复给药毒性试验方面吴苑滢等取鱼腥草桔苓合剂对大鼠连续经口给药 生药、剂量组无明显不良影响但也有研究提示鱼 腥 草 醇 提 物 经口 周可引致雌性大鼠肾脏皮髓质肾小管矿化李娟等对鱼腥草药酒进行了小鼠的 试验及精子畸变分析试验试验结果未见发现异常鱼腥草地上部分及根茎醇提取物对斑马鱼胚胎发育研究存在一定的胚胎肾包膜水肿安丹等开展了过敏试验及免疫毒性试验鱼腥草注射液均引起被动皮肤过敏、全身主动性过敏反应并抑制小鼠免疫功能的作用但过敏反应与辅料吐温 相关 综上提示鱼腥草高浓度醇提物可能引致肾脏损伤但致癌相关性较小鱼腥草注射液的类过敏反应可能为多因素诱发其作用机制尚不明确故鱼腥草的安全性存在争议仍需深挖细掘药学研究 .本研究针对马兜铃酸和马兜铃内酰胺 的肾小管损伤特征设置了、认可的临床前安全性评价的生物标志物、及、能敏感和稳定的反映肾小管早期肾小管损伤和间质性疾病 在受损肾脏上皮细胞表面有高度表达、可分别定位到肾小管的溶酶体、线粒体并针对鱼腥草注射液临床上出现的过敏性反应进行了免疫球蛋白的检测 研究结果显示鱼腥草破壁饮片以最大给药量单次给药在剂量为.、.、.和传统饮片以剂量为.、.给药 个月肾损伤生物标志物、过敏指标、病理学检查等各项检查均未见异常表明鱼腥草破壁饮片的安全性较好没有出现肾脏毒性反应并与传统饮片比较无明显差异表明 据文献报道马兜铃酸的硝基是产生毒性的构效关系其硝基经过还原反应后形成酰胺键即马兜铃内酰胺两者构效一致鱼腥草中所含的含马兜铃酸内酰胺 、由于在其结构中菲环上引入了羟基或甲氧基菲环被还原开环或取代而毒性消失因此与本研究的结论吻合鱼腥草属于药食两用的中药被誉为“中药抗生素”鱼腥草破壁饮片为传统鱼腥草饮片经细胞破壁粉碎加工而成的新型饮片临床广泛应用于上呼吸道感染等疾病其还具有抗氧化、抗内毒素免疫调节等活性市场开发潜力巨大 本文进一步确证了鱼腥草破壁饮片和传统饮片安全性为其临床应用推广提供了有力的依据参考文献:.():.武营雪丁倩云刘静等.鱼腥草化学成分、药理及质量控制研究进展.药物分析杂志():.黄春华向微汪思齐等.含马兜铃酸中药的毒性与毒理学研究进展.中国司法鉴定():.姜峰岳丽君朱丹.马兜铃酸毒副作用研究概述.药物研究():.李文婷吴勉华.中药马兜铃酸的肾毒性研究.世界科学技术中医药现代化():.李彪李晓政张翠英等.马兜铃内酰胺对肾小管上皮细胞的损伤作用.中国中药杂志():.武营雪刘静戴忠等.天然马兜铃内酰胺的安全性和药理活性研究进展.中国药学杂志():.张良李霁江振洲等.马兜铃酸 和马兜铃内酰胺 对大鼠肾小管损伤机制及其对肾脏水通道蛋白 表达的影响.中药新药与临床药理():.李丹汪贤梅梁秋等.鱼腥草破壁饮片质量评价研究.评价技术与方法():.国家食品药品监督管理总局.药物单次给药毒性研究技术指导原则/.().:/./?.国家食品药品监督管理总局.药物重复给药毒性研究技术指导原则/.().:/./?.张美玉李连达.鱼腥草及其制剂研究进展.中药药理与临床():.林友平彭凌艳陈颖.复方鱼腥草滴丸治疗急性咽炎和急性卡他性扁桃体炎的临床观察.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志():.潘颖魏亚超王乐等.鱼腥草滴眼液治疗流行性角结膜炎的临床疗效及经济效益学分析.现代药物与临床():.童鑫唐燕燕帅维维等.鱼腥草滴眼液治疗流行性角结膜炎的系统评价.现代中药研究与实践():.游学俊方建国刘争等.鱼腥草滴鼻液治疗急慢性鼻炎 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