饲料提取物对食窦魏斯氏菌耐酸性的影响.pdf

第4 5卷 第3期2 0 2 3年9月 延 边 大 学 农 学 学 报A g r i c u l t u r a lS c i e n c eJ o u r n a l o fY a n b i a nU n i v e r s i t y V o l.4 5 N o.3 S e p.2 0 2 3收稿日期:2 0 2 3-0 6-2 2 基金项目:吉林省科技发展计划技术创新引导项目(2 0 2 2 0 4 0 2 0 5 3 GH);国家自然科学基金项目(3 1 6 6 0 4 5 2)作者简介:文宇萍(1 9 9 5),女(朝鲜族),吉林敦化人,硕士,助理实验师,研究方向为微生物发酵,E-m a i l:2 8 4 2 9 3 3 3 4 6 q q.c o m通信作者:金清(1 9 7 1),女(朝鲜族),吉林延吉人,博士,教授,E-m a i l:j i n q i n g y b u.e d u.c n文章编号:1 0 0 4-7 9 9 9(2 0 2 3)0 3-0 0 4 5-0 6 D O I:1 0.1 3 4 7 8/j.c n k i.j a s y u.2 0 2 3.0 3.0 0 7饲料提取物对食窦魏斯氏菌耐酸性的影响文宇萍,金 清*(延边大学 农学院,吉林 延吉1 3 3 0 0 2)摘要:微生物发酵饲料以其诸多优势成为近几年饲料行业的研究热点,为了筛选更适合动物胃肠消化道的菌种,将耐酸性食窦魏斯氏菌W 2 5、F 6、E 3 7置于酸化的生理盐水缓冲溶液中,研究麦麸、豆粕和玉米提取物及其所含的膳食组分(还原糖和游离氨基氮)对其耐酸性的影响,以确定提高菌株存活能力的理化因素,为日后生物发酵饲料菌种筛选提供依据。结果表明:麦麸、豆粕和玉米提取物对菌株的耐酸能力都具有保护作用,在同一浓度饲料原料提取物对菌株在酸环境下耐受性均W 2 5F 6E 3 7;进一步的单因子分析表明,葡萄糖对菌株的耐酸能力具有保护作用,并随着浓度的增加而增强,酵母膏对菌株的耐酸能力无影响。关键词:食窦魏斯氏菌;耐酸性;细胞存活率;饲料提取物;膳食组分中图分类号:T S 2 0 1.3 文献标志码:A E f f e c t o f f e e de x t r a c t o na c i dr e s i s t a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i aWE NY u p i n g,J I NQ i n g*(A g r i c u l t u r a l C o l l e g eo fY a n b i a nU n i v e r s i t y,Y a n j iJ i l i n1 3 3 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:M i c r o b i a l f e r m e n t e d f e e dh a sb e c o m e a r e s e a r c hh o t s p o t i n f e e d i n d u s t r y i n r e c e n t y e a r sd u e t o i t sm a n ya d v a n t a g e s.I no r d e r t os c r e e ns t r a i n s t h a t a r em o r e s u i t a b l e f o r t h eg a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t o f a n i m a l s,a c i d-r e s i s t a n tW e i s s e l l ac i b a r i aW 2 5,F 6,E 3 7 w e r ep l a c e d i na na c i d i f i e dp h y s i o l o g i c a l s a l i n eb u f f e r s o l u t i o nt os t u d yt h ee f f e c t so fw h e a tb r a n,s o y b e a nm e a l,a n dc o r ne x t r a c t s,a sw e l la st h e i rd i e t a r yc o m p o n e n t s(r e d u c i n gs u g a r sa n df r e ea m i n on i t r o g e n)o ni t sa c i dr e s i s t a n c e,s oa st od e t e r m i n et h ep h y s i c o c h e m i c a lf a c t o r s t o i m p r o v e t h e s u r v i v a l a b i l i t yo f t h e s t r a i na n dp r o v i d e ab a s i s f o r f u t u r e s c r e e n i n go f b i o l o g i c a l f e r-m e n t a t i o nf e e ds t r a i n s.T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a tw h e a t b r a n,s o y b e a nm e a l,a n dc o r ne x t r a c t s a l l h a dp r o-t e c t i v ee f f e c t so nt h ea c i dr e s i s t a n c eo f t h es t r a i n,a t t h es a m ec o n c e n t r a t i o no f f e e dr a w m a t e r i a l e x t r a c t,t h et o l e r a n c eo f t h e s t r a i n t oa c i de n v i r o n m e n tw a sW 2 5F 6E 3 7.F u r t h e r s i n g l e f a c t o r a n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tg l u c o s eh a dt h ep r o t e c t i v ee f f e c to nt h ea c i dr e s i s t a n c eo f t h es t r a i na n d i n c r e a s e dw i t hc o n c e n t r a t i o n,w h i l ey e a s t e x t r a c th a dn oe f f e c to nt h ea c i dr e s i s t a n c eo f t h es t r a i n.K e y w o r d s:W e i s s e l l ac i b a r i a;a c i dt o l e r a n c e;c e l l s u r v i v a l r a t e;f e e de x t r a c t;d i e t a r yc o m p o n e n t s 随着2 0 2 0年7月1日我国饲用抗生素全面禁用,生物发酵饲料这类利用菌株自身发酵产生的益延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 生作用,维持动物胃肠道的微生物稳态,改善消化功能和提高机体免疫,最终促使绿色饲料被广泛使用1-4。添加菌株后的饲料原料可通过菌株的自身代谢生长改变饲料底物理化性质,分解有毒天然物质和抗营养因子的同时产生促生长因子,提高饲料的利用率,有利于营养物质的消化吸收,促进动物健康;另一方面也极大地降低了环境污染,响应了国家绿色可持续发展的号召5。2 0 1 3年农业农村部发布准许用于微生物饲料添加剂的菌种大多分为酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌和霉菌等4类6。食窦魏斯氏菌作为典型的异型发酵乳酸菌,会产生大量葡聚糖、杂多糖、果糖及其他低聚糖7-9,有效降低肠胃不适引起的生理反应,高效地增强动物机体对微量元素的吸收,因此,一直受到高度关注。研究表明,食窦魏斯氏菌能有效抑制病原菌,维持肠道生理功能,具有抗癌、抗肿瘤、抗过敏及延缓衰老等免疫调节功能1 0,其发酵产物也日渐被人们所重视,如细菌素、水溶性聚合物、过氧化氢和有机酸等,其中,细菌素对病原菌的生长具有抑制作用1 1。水溶性聚合物可有效减少牙菌斑的形成并抑制变异链球菌形成生物膜;过氧化氢可有效抑制牙周疾病,从而缓解口臭。该研究通过模拟胃肠道酸性环境,分析麦麸、豆粕和玉米提取物及其所含的膳食组分(还原糖和游离氨基氮)对食窦魏斯氏菌耐酸性的影响,以期为食窦魏斯氏菌制剂更好地以活菌形式到达肠道发挥功能提供试验依据,也为生物发酵饲料开发应用奠定理论基础。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 材料1)食窦魏斯氏菌W 2 5、E 3 7和F 6,由延边大学农学院食品与生物科学系生化实验室提供,分离自朝鲜族传统泡菜中,具有一定的耐酸能力。2)麦麸、豆粕和玉米,由延边大学动物科学系动物遗传与繁殖实验室提供。1.1.2 试剂MR S琼脂培养基、MR S肉汤培养基(购于青岛高科园海博生物技术有限公司),丙三醇(购于北京奥博星生物技术有限公司);氯化钠、盐酸、葡萄糖、酵母膏(购于上海阿拉丁试剂公司);胃蛋白酶(购于天津科密欧化学试剂有限公司)。1.2 仪器与设备Z 4 0 0 K冷冻离心机,莱比信(中国)科技发展有限公司;D N P-9 0 8 2 B S-型电热恒温培养箱,上海新苗医疗设备有限公司;P H S-3 C数字酸度计,上海鹏顺科学仪器有限公司;HHS型电热恒温水浴锅,江苏省医疗机械厂;F A 1 1 0 4型分析天平,上海天平仪器厂。1.3 方法1.3.1 饲料原料提取物的制备参考李冬梅1 2的方法,取玉米、豆粕和麦麸各1 0 0g,用0.5 mm筛的研磨机分别磨碎,取粉末1 0.0g加入9 0m L蒸馏水混匀,在8 0 的水浴锅中加热2 0m i n后离心8m i n(70 0 0r/m i n),取上清液,1 2 1灭菌2 0m i n,冷藏备用。1.3.2 饲料原料提取物化学组分分析采用甲醛滴定法1 3测定游离氨基酸;3,5-二硝基水杨酸法1 4测定还原糖含量;苯酚硫酸法1 5测总糖含量;缓冲能力测定采用1m o l/L的HC l滴定1 0 0m L提取物,结果表示为使1L提取物p H值下降1个 单 位 所 需HC l量,即 为 该 提 取 物 的 缓 冲能力。1.3.3 菌悬液的制备分别取1 0 m L培养至对数生长 中后期的菌液1 2(食窦魏斯氏菌W 2 5、E 3 7和F 6),于4环境下离心5m i n(70 0 0r/m i n),用灭菌生理盐水洗涤2次,细菌悬浮原培养体积的生理盐水中。1.3.4 p H值2.5模拟胃液的制备取胃蛋白酶0.3g,用1 0 0m L灭菌的生理盐水溶解后,用5m o l/L盐酸溶液调胃蛋白酶溶液的p H值到2.5后,过滤除菌,置于4冰箱当天使用。1.3.5 不同饲料原料提取物对菌株耐酸能力的影响取0.2m L菌悬液,1.0m Lp H值2.5的模拟胃液和0.3m L的3种饲料原料提取物混悬于2m L离心管,3 0恒温培养,分别在0、3 0、6 0、9 0、1 8 0m i n取出,按照平板稀释法,取0.1m L涂布于MR S固体培养基平板中,置于3 0培养箱中培养2 4h,以菌落为单位用人工计数法进行计数。用0.3m L灭菌的生理盐水代替饲料原料提取物作为对照组。1.3.6 葡萄糖、酵母膏溶液的制备分别称取0、0.0 4、0.0 8、0.1 6、0.3 2g葡萄糖,定溶于1 0m L蒸馏水中,制备成质量浓度为0、4、8、1 6、3 2g/L的葡萄糖溶液,1 2 1 灭菌2 0 m i n后备用。分别称取0.0 0 8、0.0 2 0、0.0 7 0、0.1 0 7g酵母64 第3期文宇萍,等:饲料提取物对食窦魏斯氏菌耐酸性的影响膏,定溶于1 0 0m L的蒸馏水中,制备成浓度为0、6、2 0、5 0、7 5m g/L酵母膏溶液,1 2 1灭菌2 0m i n后备用。1.3.7 不同浓度葡萄糖、酵母膏对菌株耐酸性的影响取0.2m L菌悬液,1.0m Lp H值2.5模拟胃液和0.3m L不同浓度的葡萄糖、酵母膏溶液混悬于2m L离心管中,3 0 恒温培养,分别在0和3h取出,按照平板稀释法,取0.1m L涂布于MR S固体培养基平板中,3 0 恒温培养2 4h,以菌落为单位用人工计数法进行计数。用0.3m L灭菌的生理盐水代替葡萄糖和酵母膏溶液作为对照组。1.4 数据处理采用S P S S2 2软件对数据进行统计学分析,所有实验设置3组平行,用单因素分析程序进行分析。2 结果与分析2.1 饲料原料提取物的化学成分玉米、豆粕和麦麸3种饲料提取物的p H值均呈弱酸性,其化学组分分析如表1所示,豆粕饲料提取物中总糖含量远高于玉米和麦麸提取物,且总糖含量可达还原糖含量的41 5倍;豆粕缓冲能力远高于麦麸和玉米提取物。表1 饲料原料提取物中化学成分的含量T a b l e1 C o n t e n t o f c h e m i c a l c o m p o n e n t s i nf e e dr a wm a t e r i a l e x t r a c t s项目玉米豆粕麦麸p H值5.9 46.46.3 7总糖含量/(gL-1)4.3 16.6 44.2 3还原糖含量/(gL-1)1.0 70.4 51.3 5缓冲能力/(mm o lp H-1)3.1 21 1.2 96.6 22.2 同一浓度饲料原料提取物对菌株耐酸能力的影响由图1可知,3种菌株在p H值2.5的酸性环境中培养1 8 0m i n后,对酸环境均存在耐受性,菌株W 2 5和F 6活菌数略有所下降,W 2 5下降了0.8 3 l gC F U/m L,F 6下降了1.4 1l gC F U/m L;而菌株E 3 7出现大量死亡现象,下降了6.1 5l gC F U/m L,酸性环境中存活率低;对酸环境耐受性大小为W 2 5F 6E 3 7。图1 p H值2.5的酸性环境不同培养时间下对食窦魏斯氏菌的耐酸性影响F i g.1 E f f e c t o fd i f f e r e n t c u l t i v a t i o nt i m e i na na c i d i c e n v i r o n m e n tw i t hp H2.5o nt h ea c i dt o l e r a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i a由图2可知,3种菌株在p H值2.5的麦麸提取物环境中培养1 8 0m i n后,对酸环境均存在耐受性,其中,菌株W 2 5活菌数呈先增加后趋于平缓的趋势,增长了0.2 8l gC F U/m L,可能是麦麸中含有的营养物质被菌株吸收促使菌数增加;菌株E 3 7处于平稳生长状态,下降了0.2 1 3l gC F U/m L;菌株F 6稍有死亡,下降了0.1 3 01 l gC F U/m L;对麦麸提取物耐受性大小为W 2 5F 6E 3 7。图2 同一浓度麦麸提取物不同培养时间对食窦魏斯氏菌的耐酸性影响F i g.2 E f f e c t o f t h e s a m ec o n c e n t r a t i o no fw h e a tb r a ne x t r a c t o nt h ea c i dr e s i s t a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i au n d e rd i f f e r e n t c u l t i v a t i o nt i m e由图3可知,3种菌株在p H值2.5的豆粕提取物环境中培养1 8 0m i n,菌株W 2 5呈先增加后稍有下降的趋势,增加了0.0 4l gC F U/m L,菌数增加可74延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 能与豆粕中含有的营养物质被菌株利用而生长有关;菌株E 3 7菌数依然处于稳定生长状态,降低了0.1 9 48l gC F U/m L;菌株F 6稳定生长,仅降低了0.0 6l gC F U/m L;对 豆 粕 提 取 物 耐 受 性 大 小 为W 2 5F 6E 3 7。图3 同一浓度豆粕提取物不同培养时间对食窦魏斯氏菌的耐酸性影响F i g.3 E f f e c t o f t h e s a m ec o n c e n t r a t i o no fs o y b e a nm e a l e x t r a c t o nt h ea c i dr e s i s t a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i au n d e rd i f f e r e n t c u l t i v a t i o nt i m e由图4可知,3种菌株在p H2.5的玉米提取物环境中培养1 8 0m i n,菌株W 2 5处于稳定增长,仅降低减 少 了0.0 5l gC F U/m L;菌 株E 3 7在03 0m i n与6 09 0 m i n处于快速下降,出现较多死亡,菌数下降0.8 8l gC F U/m L;菌株F 6出现缓慢死亡的情况,菌数下降0.2 5l gC F U/m L;对玉米提取物耐受性大小为W 2 5F 6E 3 7。综上所述,同一浓度饲料原料提取物对菌株耐受性大小为W 2 5F 6E 3 7。图4 同一浓度玉米提取物不同培养时间 对食窦魏斯氏菌的耐酸性影响F i g.4 E f f e c t o f c o r ne x t r a c t o ft h e s a m ec o n c e n t r a t i o no nt h ea c i dr e s i s t a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i au n d e rd i f f e r e n t c u l t i v a t i o nt i m e2.3 不同质量浓度葡萄糖溶液对菌株耐酸能力的影响用不同浓度的葡萄糖溶液对W 2 5、E 3 7和F 63菌株在p H值2.5的模拟胃液中培养3h。由图57可以看出,随着葡萄糖质量浓度的增加,3菌株活菌数逐渐增多;在葡萄糖质量浓度为0g/L时,W 2 5、E 3 7和F 6活 菌 数 的 对 数 值 分 别 减 少 了0.5 8 05、4.5 6 77和4.0 6 64个 单 位;在 浓 度 为3 2g/L时,分别减少了0.1 0 13、0.1 2 97和0.1 6 19个单位。说明葡萄糖对3菌株的耐酸能力具有保护作用,且随着质量浓度的增加保护作用逐渐增强,并具有浓度效应。图5 不同质量浓度葡萄糖对食窦魏斯氏菌W 2 5的耐酸性影响F i g.5 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f g l u c o s eo n t h ea c i dt o l e r a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i aW 2 5图6 不同质量浓度葡萄糖对食窦魏斯氏菌E 3 7的耐酸性影响F i g.6 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f g l u c o s eo n t h ea c i dt o l e r a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i aE 3 784 第3期文宇萍,等:饲料提取物对食窦魏斯氏菌耐酸性的影响图7 不同质量浓度葡萄糖对食窦魏斯氏菌F 6的耐酸性影响F i g.7 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f g l u c o s e o n t h ea c i d t o l e r a n c e o fW e i s s e l l ac i b a r i aF 62.4 不同质量浓度酵母膏溶液对菌株耐酸能力的影响用不同质量浓度的酵母膏溶液对W 2 5、E 3 7和F 63菌株在p H值2.5的模拟胃液中培养3h。由图81 0可以看出,在加入酵母膏溶液3h后,W 2 5的活菌数没有变化,酵母膏溶液质量浓度为0m g/L时,活菌 数 减 少 了1.8 2 04个 单 位,质 量 浓 度 为7 5m g/L时,活菌数减少了1.8 4 94个单位;E 3 7的活菌数随着酵母膏质量浓度的增加先增加后减少,质量浓度为0m g/L时,活菌数减少了4.5 6 77个单位,质量浓度为5 0m g/L时,活菌数减少了0.4 0 37个单位,质量浓度为7 5 m g/L时,活菌数减少 了0.6 2 84个单位;F 6的活菌数没有变化,酵母膏溶液质量浓度为0m g/L时,活菌数减少了4.0 6 64个单位,质量浓度为7 5m g/L时,活菌数减少了4.7 2 70个单位。说明酵母膏对食窦魏斯氏菌W 2 5和E 3 7的耐酸能力无影响,对F 6的耐酸能力具有一定的保护作用。图8 不同质量浓度酵母膏对食窦魏斯氏菌W 2 5的耐酸性影响F i g.8 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fy e a s t e x t r a c t o nt h ea c i dr e s i s t a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i aW 2 5图9 不同质量浓度酵母膏对食窦魏斯氏菌E 3 7的耐酸性影响F i g.9 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fy e a s t e x t r a c t o nt h ea c i dr e s i s t a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i aE 3 7图1 0 不同质量浓度酵母膏对食窦魏斯氏菌F 6的耐酸性影响F i g.1 0 E f f e c t o fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fy e a s te x t r a c t o nt h ea c i dr e s i s t a n c eo fW e i s s e l l ac i b a r i aF 63 讨论与结论益生菌进入宿主体内后首先的生存障碍是胃内低p H值环境,所以,对具有抗酸能力的菌株或其最佳载体的筛选,可以在人工模拟胃液的条件下进行。单胃动物胃液的p H值随饮食变化波动很大,胃液p H值一般在2.0左右,进食后p H值可达3.05.0,食物被胃消化大约需要24h。该试验选择p H值2.5,并添加胃蛋白酶处理食窦魏斯氏菌3h模拟胃环境,筛选对食窦魏斯氏菌抗酸性具有保护作用的食物载体。将3株具有耐酸性的食窦魏斯氏菌进行耐酸能力比较,得出W 2 5的耐酸性最强。依据麦麸、豆粕和玉米提取物在模拟胃液中对食窦魏斯氏菌的耐酸能力,得出3种饲料原料提取物对食窦魏斯氏菌都具有保护作用,其耐酸性大小为麦麸提取物豆粕提取物玉米提取物。麦芽提取物的还原糖质量浓94延 边 大 学 农 学 学 报第4 5卷 度比其他2种提取物高,可能是其对食窦魏斯氏菌具有较好保护作用的主要原因。进一步研究麦麸、豆粕和玉米提取物中所含的膳食组分在模拟胃液中对食窦魏斯氏菌耐酸性的影响,得出葡萄糖对其具有保护作用,并随着质量浓度的增加而增强,这与倪学勤等1 6报道的植物提取物对乳酸菌耐酸性差异导致的保护效果不同的结果相似;酵母膏对其耐酸性无影响。综上所述,在该试验条件下,采用酸胁迫的方式将耐酸性食窦魏斯氏菌应用于饲料提取物上,有利于进一步应用于单胃动物肠道内的益生特性研究,评估不同的饲料原料对食窦魏斯氏菌的保护作用从而提高食窦魏斯氏菌的使用效果,以期为食窦魏斯氏菌制剂更好地发挥其益生特性提供试验依据,并为绿色、环保型饲料的研发提供新的优良菌株。参考文献:1 李广超.绿色饲料添加剂在畜牧生产中的使用J.畜禽业,2 0 2 2,3 3(1 0):2 2-2 4.2 呙于明.家禽绿色养殖饲料饲养技术思路J.北方牧业,2 0 2 2(1 9):1 8.3 曾 建 国.植 物 提 取 物 及 其 饲 料 添 加 剂 注 册 开 发 建议J.饲料工业,2 0 2 0,4 1(1 0):1-8.4 王晓杰,黄立新,张彩虹,等.植物提取物饲料添加剂的研究进展J.生物质化学工程,2 0 1 8,5 2(0 3):5 0-5 8.5 刘华,刘秀斌,吴俊,等.饲用植物及其提取物在饲料替抗中的应用J.饲料工业,2 0 2 0,4 1(1 2):2 0-2 4.6 李悦.微生物饲料添加剂在养猪业中的应用J.粮油与饲料科技,2 0 2 1,1 8 1(0 3):3 0-3 2.7 陈媛,贾斯斯,胡露,等.食窦魏斯氏菌S J-0 2产胞外多糖发酵工艺优化J.食品与机械,2 0 1 8,3 4(0 7):1 9 4-1 9 9.8 陈之阳.乳酸菌W e i s s e l l ac i b a r i a2 7胞外多糖的生产优化和特性分析D.厦门:厦门大学,2 0 1 7.9 张楠笛,祝林,许琴,等.食窦魏斯氏菌协同植物乳杆菌改善四川泡菜风味J.食品科学,2 0 2 0,4 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