科罗索酸抑制人卵巢癌细胞SKOV-3过度增殖和诱导细胞凋亡.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(1):045-050 J Med Mol Biol,2024,21(1):045-050DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.01.007资助项目:黑龙江省卫生健康委科研课题(No.2018335)通讯作者:姚慧欣(电话:[phone],E-mail:yaohuixinxinlang )This work was supported by a grant from the Research Project of Heilongjiang Provincial Health Commission(No.2018335)Corresponding author:YAO Huixin(Tel:[phone],E-mail:yaohuixinxinlang )科罗索酸抑制人卵巢癌细胞 SKOV-3 过度增殖和诱导细胞凋亡孙喆1,王钧峰2,李会影1,姚慧欣3牡丹江医学院附属红旗医院1妇产科,2骨科,3医务科 黑龙江省牡丹江市,157011【摘要】目的 探究科罗索酸(corosolic acid,CRA)对人卵巢癌细胞 SKOV-3 增殖和凋亡的作用及机制。方法 将细胞分为空白对照(Ctrl)组、CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50 mol/L)组,使用相应浓度的 CRA 处理细胞,CCK-8 检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹检测抗原Ki67(Ki67)、周期蛋白 D1(cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinases 6,CDK6)、B 细胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、活化型半胱天冬酶 3(cleavedcaspase-3)、cleaved caspase-9、磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶 B(proteinkinase B,AKT)、p-AKT 蛋白表达,构建 SKOV-3 裸鼠移植瘤模型并记录肿瘤体积,免疫组化检测 Ki67 和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)阳性细胞率。结果在细胞实验中,与 Ctrl组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50 mol/L)组细胞增殖水平显著降低,Bcl-2/Bax、p-AKT/AKT 比率降低,Ki67、Cyclin D1、CDK6、PI3K 蛋白表达水平降低,同时细胞凋亡水平显著升高,cl-caspase-3 和 cl-caspase-9 蛋白表达水平升高。在动物实验中,与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50 mol/L)组肿瘤体积显著降低,Ki67 和 VEGF 阳性细胞率显著降低。结论科罗索酸可抑制人卵巢癌细胞 SKOV-3 的过度增殖,并诱导细胞凋亡,起作用机制可能与抑制 PI3K/AKT信号通路有关。【关键词】科罗索酸;卵巢癌;细胞增殖;细胞凋亡;PI3K/AKT【中图分类号】R737.31Corosolic Acid Inhibits Excess Proliferation and Induces Apoptosis ofHuman Ovarian Cancer Cells SKOV-3SUN Zhe1,WANG Junfeng2,LI Huiying1,YAO Huixin31Department of Obstetrics and Gynecology,2Department of Orthopedics,3Medical Department,Red FlagHospital Affiliated to Mudanjiang Medical College,Mudanjiang,Heilongjiang,157011,China【Abstract】Objective To investigate the effect of corosolic acid(CRA)on the proliferationand apoptosis of human ovarian cancer cells SKOV-3 and its mechanism.Methods Cells were di-vided into 4 groups:Ctrl group,CRA-10 mol/L group,CRA-20 mol/L group,and CRA-50mol/L groups,each group was treated with corresponding concentration of CRA.CCK-8 assay wasused to measure cell growth.Flow cytometry was used to detect cell apoptosis.The protein expressionlevels of Ki67,Cyclin D1,CDK6,Bcl-2,Bax,cleaved-caspase-3,cleaved-caspase-9,PI3K,AKT,p-AKT were determined by Western blotting.In addition,the cell line derived xenograftmodel was established by transplanting the human ovarian cancer cells SKOV-3 in nude mice,thevolume of the tumors from the nude mice were measured,the rates of Ki67 or VEGF positive cellswere detected by immunohistochemistry.ResultsIn cytological experiments,the cell growth lev-els,the Bcl-2/Bax and p-AKT/AKT ratios,the protein expression levels of Ki67,Cyclin D1,CDK6,PI3K in the CRA groups(10,20,50 mol/L)were decreased significantly,and thecell apoptosis rate,protein expression levels of cleaved-caspase-3 and cleaved-caspase-9 were in-creased notably,when compared with those in the Ctrl group.In animal experiments,the tumor vol-ume,the rates of Ki67 or VEGF positive cells in the CRA groups(10,20,50 mol/L)were de-creased markedly,when compared with those in the Ctrl group.Conclusion Corosolic acid can in-hibit the excess proliferation of SKOV3 cells,and induce their apoptosis,the mechanism may relat-ed to the inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.【Key words】corosolic acid;ovarian cancer;cell proliferation;cell apoptosis;PI3K/AKT 卵巢癌是最为致命的妇科癌症之一,确诊后不到一半的患者可以在 5 年内存活下来。由于早期症状难以觉察,大部分患者诊断出卵巢癌时已经进入晚期,癌细胞转移到其他组织中,通常腹腔转移最为多见1-2。当前卵巢癌的治疗主要是通过手术切除肿瘤和铂/紫杉醇联合化疗,虽然80%的患者能取得良好效果,然而癌症的复发率依然很高,70%的患者在5 年内复发并产生了抗药性3。因此,寻找新的治疗手段和药物,改善目前的治疗效果是必要的。在过去的数十年中,来源于药用植物的天然提取物由于其安全性和良好的功效而受到临床研究者的青睐,尤其在癌症的治疗当中,至少 40%的抗癌药物来源于天然产物4。科罗索酸(corosolicacid,CRA)是一种五环三萜类天然提取物,可从大花紫薇、枇杷、山楂等植物中提取获得,研究表明 CRA 具有抗癌的能力,然而其分子机制十分复杂,至今仍有很多尚待阐明的地方5。本研究通过培养人卵巢癌 SKOV-3 细胞,用 CRA 处理细胞,旨在探究了 CRA 对卵巢癌细胞 SKOV-3 的抑制增殖和诱导凋亡的作用及其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 主要试剂CRA 购自 Sigma 公司,RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自美国 Invitrogen 公司,青霉素、链霉素、CCK-8 试剂盒、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 试剂盒、免疫组化试剂盒、Ecl显色液购自北京索莱宝生物公司,GAPDH、抗原Ki67(Ki67)、周期蛋白 D1(cyclin D1)、周期蛋白 依 赖 性 激 酶(cyclin-dependentkinases6,CDK6)、B 细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、活化型半胱天冬酶 3(cleaved caspase-3)、cleaved caspase-9、磷 脂 酰 肌 醇 3-激 酶(phos-phoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶 B(proteinkinase B,AKT)、p-AKT、血 管 内 皮 生 长 因 子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗体购自英国 Abcam 公司。1.2 细胞培养及分组处理人卵巢癌细胞 SKOV-3 购自美国 ATCC 公司,培养于含有 10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 单位青-链霉素的 RPMI-1640 培养基中,培养箱条件为 5%CO237。将细胞分为空白对照(Ctrl)、CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50 mol/L)组,除 Ctrl 组外,每组分别定容至对应浓度的 CRA 进行处理。1.3 CCK-8 检测细胞增殖将处理后的细胞继续在 5%CO2,37 环境条件下培养,每隔 1 天使用 CCK-8 法测定细胞增殖倍数,持续 4 d。测定时将细胞接种于 96 孔板,5%CO2,37 环境下预培养24 h,在培养板里加入 10 L/孔的 CCK-8 溶液继续培养4 h,使用酶标仪检测 450 nm 吸光度。1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡用不含 EDTA 的胰蛋白酶将细胞消化成单细胞,并用冰的 PBS 洗涤 2 次。根据制造商的说明,使用细胞凋亡检测试剂盒进行 Annexin V 染色。在4 暗室中孵育 15 min 后,加入 PI 染色液,轻轻混合,4 孵育 5 min,用流式细胞仪分析细胞凋亡率。1.5 蛋白质印迹检测蛋白表达收集细胞并裂解在 RIPA 裂解液中,使用 BCA蛋白测定试剂盒测量各组细胞蛋白浓度。根据测定浓度,每组 40 g 的蛋白质样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上进行,并转移到硝化纤维膜上。将膜在 4 的 5%脱脂乳中孵育 8 h,并与一抗反应过夜。随后,将它们暴露于过氧化物酶偶联的二抗 1 h。最后,使用增强化学发光检测试剂盒进行条带检测。1.6 裸鼠皮下移植瘤模型建立40 只鼠龄6 8 周,体重18 20 g 的 SPF 雌性BALB/c 裸 鼠 购 自 牡 丹 江 医 学 院,许 可 证 号:SYXK(黑)2019-006,在指定的动物房中饲养 48h,所接触的器具、水和食物均需无菌。本实验获牡丹江医学院附属红旗医院伦理审查委员会批准。将 SKOV-3 细胞株以浓度 1 106个/只经左腋皮下接种于裸鼠中。每隔 1 天记录一次肿瘤体积,当肿64孙喆,等.科罗索酸抑制人卵巢癌细胞 SKOV-3 过度增殖和诱导细胞凋亡瘤体积约为 100 mm3时,将裸鼠分为 Ctrl 组、CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50mol/L)组,每 组 10 只,CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50 mol/L)组灌胃相应浓度的 CRA,Ctrl 组灌胃生理盐水。所有裸鼠每天给药 1 次,每隔 7 天记录一次肿瘤体积,连续给药 35 d 后处死裸鼠,取出肿瘤组织用于后续实验。1.7 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测组织 Ki67、VEGF 阳性细胞率 移植瘤样品在4%甲醛中固定过夜,并用梯度浓度的乙醇脱水。将组织切成 5 m 厚的切片,然后将切片干燥、脱蜡,并用柠檬酸盐修复抗原 15min。切片用 1%BSA 封闭 30 min,然后分别与Ki67,VEGF 一抗和用 HRP 标记的二抗孵育。切片与 DAB 显色液反应,并用苏木精复染,在光学显微镜下拍照获取图片进行后续分析。1.8 统计学分析本研究数据表示为平均值 标准差。所有的统计分析使用 GraphPad Prism 5.0。采用单因素方差分析和 t 检验进行分析数据,以确定所有实验组之间的差异。2 结果2.1 CRA 抑制 SKOV-3 细胞增殖与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20mol/L)、CRA(50 mol/L)组 SKOV-3 细胞增殖水平显著降低(P 0.01),呈时间和浓度依赖性变化(图 1)。与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50 mol/L)组 Ki67、Cyclin D1、CDK6 蛋白表达水平显著降低(P 0.01),且呈浓度依赖性变化(图 2)。1:Ctrl 组;2:CRA 10 mol/L 组;3:CRA 20 mol/L组;4:CRA 50 mol/L 组。与 Ctrl 组比较,P0.01。图 1 CRA 对 SKOV-3 细胞增殖的影响(n=6)1:Ctrl 组;2:CRA 10 mol/L 组;3:CRA 20 mol/L 组;4:CRA 50 mol/L 组。与 Ctrl 组比较,P0.01。图 2 CRA 对细胞增殖标志蛋白表达的影响(n=6)2.2 CRA 促进 SKOV-3 细胞凋亡与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20mol/L)、CRA(50 mol/L)组 SKOV-3 细胞凋亡率显著升高(P 0.01),呈浓度依赖性变化(图3)。与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20mol/L)、CRA(50 mol/L)组 Bcl-2/Bax 比率显著降低,cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 蛋白表达水平显著升高(P 0.01),且呈浓度依赖性变化(图 4)。1:Ctrl 组;2:CRA 10 mol/L 组;3:CRA 20 mol/L 组;4:CRA 50 mol/L 组。与 Ctrl 组比较,P0.01。图 3 CRA 对 SKOV-3 细胞凋亡的影响(n=6)74医学分子生物学杂志,2024,21(1):045-050 J Med Mol Biol,2024,21(1):045-0501:Ctrl 组;2:CRA 10 mol/L 组;3:CRA 20 mol/L 组;4:CRA 50 mol/L 组。与 Ctrl 组比较,P0.01。图 4 CRA 对凋亡相关蛋白表达的影响(n=6)2.3 CRA 对 PI3K/AKT 信号通路的抑制作用与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20mol/L)、CRA(50 mol/L)组 PI3K/AKT 信号通路关键蛋白 PI3K 表达水平和 p-AKT/AKT 比率显著降低(P 0.01),且呈浓度依赖性变化(图5)。1:Ctrl 组;2 4:分别为 CRA 10、20、50 mol/L 组。与 Ctrl 组比较,P0.01。图 5 CRA 对 PI3K/AKT 信号通路的调控作用(n=6)2.4 CRA 抑制皮下移植瘤组织生长与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20mol/L)、CRA(50 mol/L)组肿瘤体积显著受到抑制(P 0.01),呈时间和剂量依赖性变化(图 6);同时,与 Ctrl 组比较,CRA(10 mol/L)、CRA(20 mol/L)、CRA(50 mol/L)组Ki67、VEGF 阳性细胞率显著降低(P0.01),且呈剂量依赖性变化(图 7)。1:Ctrl 组;2:CRA 10 mol/L 组;3:CRA 20 mol/L组;4:CRA 50 mol/L 组。与 Ctrl 组比较,P0.01。图 6 CRA 对皮下移植瘤组织生长的影响(n=6)1:Ctrl 组;2:CRA 10 mol/L 组;3:CRA 20 mol/L 组;4:CRA 50 mol/L 组。与 Ctrl 组比较,P0.01。图 7 CRA 对 Ki67 和 VEGF 表达的影响(n=6,200)3 讨论CRA 具有非常广泛的药用价值,在抗高血糖、抗高血脂、抗氧化和消炎上均发挥着作用6。在抗癌方面,CRA 在诸如胃癌、肝癌和前列腺癌等癌症中均具有显著的抗癌作用,并有着不一样的作用机制7-9。在 Fujiwara 等10的研究中,通过细胞增殖和毒理检测,确立 CRA 在 30 mol/L 左右时可显著抑制卵巢癌细胞的增殖。本研究发现 CRA可显著抑制 SKOV-3 细胞的增殖,并且呈浓度依赖84孙喆,等.科罗索酸抑制人卵巢癌细胞 SKOV-3 过度增殖和诱导细胞凋亡性变化 关 系。与 之 前 研 究 不 同,本 研 究 中 10mol/L 的 CRA 就表现出显著的增殖抑制作用,这种差异可能与细胞生长环境以及检测方法不同有关。同时,本研究对增殖相关蛋白 Ki67、CyclinD1、CDK6 表达水平进行了检测,发现 CRA 可抑制 Ki67、Cyclin D1 和 CDK6 的表达。Ki67 是一种与细胞增殖紧密相关的核蛋白,近年来被认为是一种与化疗敏感性和肿瘤复发相关的重要诊断因子11。Cyclin D1 是一种调控细胞周期的原癌基因,其过度表达会缩短 G1/S 转换时间,在多种癌症中均发现了 Cyclin D1 的过度表达,致细胞增殖失控而恶性化12。CDK6 是一个关键细胞周期促进因子,参与到多种肿瘤细胞的增殖过程中13。本研究通过构建皮下移植瘤模型,发现 CRA 可显著抑制裸鼠体内的卵巢癌肿瘤组织生长,并降低肿瘤组织中 Ki67 和 VEGF 的表达,VEGF 在肿瘤中诱导血管增生14。这些结果表明 CRA 可显著抑制 SK-OV-3 细胞及组织的过度增殖。为了进一步探究 CRA 对 SKOV-3 细胞的生长调控作用,本研究对其细胞凋亡水平进行了检测,结果表明 CRA 可显著增加 SKOV-3 细胞凋亡率。同时,CRA 可降低 Bcl-2/Bax 比率,提高 cleavedcaspase-3 和 cleaved caspase-9 蛋白表达水平,抗凋亡基因 Bcl-2 和促凋亡基因 Bax 是一对重要的正负调控因子,Bcl-2 可阻止 Bax 形成同源二聚体促进凋亡发生15。cleaved caspase-9 参与了内源性凋亡途径的起始,cleaved caspase-3 是细胞凋亡的主要效应因子16。结合实验结果表明 CRA 可诱导 SK-OV-3 细胞凋亡。PI3K/AKT 信号通路在细胞生存、细胞周期、细胞增殖等方面均发挥着重要的作用,其异常激活常与包括卵巢癌在内的各种癌症有关17。PI3K 可将 PIP2 磷酸化为 PIP3,并在膜上积累,从而激活下游的 AKT 蛋白18,激活的 AKT 可磷酸化下游多种靶蛋白,从而促进肿瘤的发生、增殖与生存19。本研究发现 CRA 可抑制 PI3K 的蛋白表达,并降低p-AKT/AKT 的比率,表明 CRP 可通过抑制 PI3K/AKT 信号通路抑制 SKOV-3 细胞的增殖并诱导其凋亡。综上所述,CRA 可抑制卵巢癌细胞增殖相,并降低 Bcl-2/Bax 比率,促进 cleaved caspase-3 和cleaved caspase-9 表达,从而诱导细胞凋亡,其机制可能与 PI3K/AKT 信号通路失活有关。同时,CRA 可在体内抑制裸鼠体内移植瘤的生长,这为卵巢癌的临床治疗提供了新的药物候选。下一步计划对 CRA 在卵巢癌其他方面的作用作进一步探究。参考文献1 DOUBENI C A,DOUBENI A R,MYERS A E.Diagnosisand 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