咪喹莫特诱导血热型银屑病模型体内微环境变化观察.pdf

DOI：10.19893/ki.ydyxb.2023-0302第 22 卷第 1 期2024 年 3 月延安大学学报（医学科学版）Journal of Yanan University(Medical Science Edition)Vol.22 No.1Mar.2024咪喹莫特诱导血热型银屑病模型体内微环境变化观察段亚倩，王宇航，张玉桐，马佳蕊，赵忻未，曹朵，赵菊梅，张正祥*（延安大学医学院，陕西 延安 716000）摘要：目的评价采用干姜、肉桂灌胃结合咪喹莫特乳膏涂抹，建立血热型银屑病动物模型的皮损和体内微环境变化情况。方法48只8周龄健康BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为正常对照组和银屑病模型组。第1天起，模型组给予0.9 g/mL干姜、肉桂水煎液，按0.1 mL/10 gd剂量灌胃，对照组给予生理盐水0.1 mL/10 gd剂量灌胃，持续12 d。灌胃第6天起，模型组背部涂抹咪喹莫特乳膏42 mg，对照组背部涂抹等量凡士林乳膏，每天观察皮损情况，持续7 d。第13天，小动物麻醉机麻醉后，采集两组小鼠血液，ELISA法检测两组小鼠血清中肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）、干扰素-（interferon-，IFN-）、白细胞介素21（interleukin-21，IL-21）、白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）含量变化；取两组小鼠背部涂抹处皮肤，制作病理学组织切片观察皮损情况。结果模型组小鼠涂抹部位皮肤表皮增厚，表面凹凸不平，有红斑散在分布。显微镜下显示表皮角化不全、棘层增厚、皮脂腺增多；血清中TNF-、IFN-、IL-21、IL-17水平均升高，与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）。结论BALB/c小鼠经干姜、肉桂水煎液灌胃12 d，期间第6天起背部加涂咪喹莫特乳膏，连续涂抹7d，成功构建的血热型银屑病动物模型，皮损变化和体内微环境改变符合银屑病患者特点。关键词：银屑病；BALB/c小鼠；银屑病动物模型；干姜；肉桂；咪喹莫特乳膏中图分类号：R965 文献标识码：A 文章编号：1672-2639（2024）01-0015-05Observation of microenvironmental changes in a blood heat psoriasis model induced by imiquimodDUAN Yaqian，WANG Yuhang，ZHANG Yutong，MA Jiarui，ZHAO Xinwei，CAO Duo，ZHAO Jvmei，ZHANG Zhengxiang*（Medical College of Yanan University，Yanan 716000，China）Abstract：Objective To evaluate the changes in skin lesions and in vivo microenvironment of an animal model of blood heat psoriasis using Rhizoma Zingiberis and Cinnamomum Cassia combined with imiquimod cream application.Methods 48 8-week-old healthy BALB/c mice（half male and half female）were randomly divided into a normal control group and a psoriasis model group.Starting from the 1st day，the model group was given 0.9 g/mL of Rhizoma Zingiberis and Cinnamomum Cassia decoction by gavage at a dose of 0.1 mL/10 gd，while the control group was given 0.1 mL/10 gd of physiological saline by gavage for 12 days.Starting from the 6th day of gastric lavage，the model group applied 42 mg of imiquimod cream on the back，while the control group applied an equal amount of vaseline cream on the back.The skin lesions were observed daily for 7 days.On the 13th day，after anesthesia with a small animal anesthesia machine，blood was collected from two groups of mice，and ELISA was used to detect the levels of serum in both groups of tumor necrosis factor-（TNF-），interferon-（IFN-），基金项目：延安大学科研计划项目（YDY2020-21）；陕西省大学生创新创业训练计划项目（S202110719103）作者简介：段亚倩（1997），女，陕西渭南人，在读硕士研究生。研究方向：中药药理学。通信作者：张正祥（1973），男，山东鄄城人，硕士，副教授。研究方向：中药药理学。E-mail：15第 22 卷 延安大学学报（医学科学版）第 1 期interleukin-21（IL-21）and interleukin-17（IL-17）.Skin samples were taken from the back of two groups of mice for pathological tissue sectioning to observe the condition of skin lesions.Results The skin epidermis at the application site of the model group mice thickened，with uneven surface and scattered erythema.Under the microscope，it showed incomplete keratinization of the epidermis，thickening of the spinous layer，and increased sebaceous glands；The levels of TNF-，IFN-，IL-21 and IL-17 in serum both increased，and compared with the control group，the difference was statistically significant（P0.05）.Conclusion BALB/c mice were orally administered a decoction of Rhizoma Zingiberis and Cinnamomum Cassia for 12 days，and from the 6th day onwards，imiquimod cream was added to the back for 7 consecutive days.A blood heat psoriasis animal model was successfully constructed，and the changes in skin lesions and internal microenvironment were consistent with the characteristics of psoriasis patients.Key words：Psoriasis；BALB/c mice；Animal model of psoriasis；Rhizoma Zingiberis；Cinnamomum cassia；Imiquimod cream银屑病是一种常见的人类慢性免疫原性炎症性皮肤病，尚无有效治疗药物，成为当今皮肤病的防治难题。目前，有30多个国家报道了银屑病发病率、患病率等流行病学信息。患病率东亚最低为0.14%，大洋洲最高为 1.99%，全球成人中的患病率为0.51%11.43%，儿童中的患病率最高为1.37%1。2017年我国患病率已达0.69%2。银屑病患者除有典型皮疹累及受损器官、伴有其他炎症性疾病，还有抑郁、焦虑等心理性疾病，严重影响患者的生活质量和身心健康3。近年来研究4发现，银屑病患者血清肿瘤坏死因子-（Tumor necrosis factor-，TNF-）、白细胞介素 17（Interleukin-17，IL-17）等炎症因子显著升高，并可能参与了银屑病的发病，且与病情活动度及严重程度有关。咪喹莫特乳膏诱导 BALB/c小鼠建立的血热型银屑病动物模型，被用来研究银屑病发病机制或评价药物疗效，而该模型小鼠皮损变化和体内细胞因子变化是否与银屑病患者相似鲜有报道。本研究拟采用干姜、肉桂灌胃结合咪喹莫特乳膏背部涂抹，建立血热型银屑病动物模型，检测该银屑病模型小鼠皮损和血清细胞因子变化，判断其能否模拟银屑病患者发病情况，并反映银屑病患者体内微环境变化，为该模型在银屑病发病机制和药物治疗探索方面的应用提供前期实验基础。1材料与方法1.1实验动物SPF级BALB/c小鼠48只，8周龄，雌雄各半（雄性体重2025 g，雌性体重1520 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2021-0006）。SPF级环境下（西安交通大学医学部实验动物中心）饲养，相对温度2023，相对湿度50%70，通风条件良好，自由饮水饮食。1.2药物与试剂干姜（产自四川犍为）、肉桂（产自广西防城港），咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，国药准字H20030128，规格：3 g/支）。凡士林乳膏（山东赤兔马医疗科技有限公司，规格：50 mL），薇婷脱毛膏（法国薇婷，规格：200 mL），异氟烷（瑞沃德，货号R510-22，规格：100 mL）。HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号G1120，规格：100 mL）。小鼠血清TNF-、IFN-、IL-17、IL-21的ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司，货号 MM-0132M1、MM-0182M1、MM-0170M1、MM-0688M1）。1.3仪器电子天平（梅勒特-托利多仪器有限公司，型号：ME204E），小 动 物 麻 醉 机（瑞 沃 德，型 号：R583S），显微镜（Nikon，型号80i）、显微数码摄像头（Nikon，型号DS-Ri1），酶标仪（瑞士帝肯，型号Infinite M200）等。1.4干姜肉桂煎液制备将干姜、肉桂按1 1称量后，凉水浸泡30 min，随后放于砂锅中先用大火煮沸，最后小火煎煮15 min，制成浓度为0.9 g/mL的水煎液。1.5动物分组与处理8周龄BALB/c小鼠称重后，放入小动物麻醉机的诱导麻醉盒预麻醉。待小鼠麻醉后，将其仰卧位固定，持续面罩吸入麻醉（麻醉剂为异氟烷）。薇婷脱毛膏进行背部脱毛，裸露皮肤22 cm2。然后以随机数字表法将48只小鼠分为2组，每组24只。空16咪喹莫特诱导血热型银屑病模型体内微环境变化观察白组（control）：生理盐水灌胃，第6 d开始背部均匀涂抹凡士林乳膏，持续7 d；模型组（model）：0.9 g/mL的干姜、肉桂煎液灌胃，第6 d开始背部均匀涂抹咪喹莫特乳膏，持续7 d。灌胃液体体积为0.1 mL/10 gd，涂抹乳膏质量均为42 mg/d。第6 d12 d观察小鼠一般情况、皮损肥厚、红斑和鳞屑情况。第13天，用麻醉机将小鼠麻醉后，压迫小鼠一侧眼球并用镊子迅速摘除，Eppendorf试管收集血液。之后，安乐死处死小鼠，取涂抹处皮肤，病理切片HE染色，显微镜下观察，ELISA 法检测血清中 TNF-、-干扰素（Interferon-，IFN-）、IL-21、IL-17含量变化。1.6统计学方法采用 SPSS 24.0 和 GraphPad Prism 8.2 软件进行统计分析和作图，计量资料以（x s）表示，通过t检验进行分析，检验水准为双侧=0.05。2结果2.1小鼠背部皮损肉眼变化空白组凡士林涂抹7 d后，小鼠涂抹部位皮肤颜色、形态正常，表面平整（图1A）；模型组咪喹莫特涂抹7 d后，小鼠背部皮损隆起明显，边缘清晰，有白色鳞屑成片附着，红色、紫红色斑块散在分布（图1B）。建模期间，两组动物无死亡，精神状态良好，活动适中，反应敏捷，食量、粪尿正常。2.2HE染色观察小鼠背部皮损组织显微镜下空白组小鼠表皮较薄，角质层、棘层和基底层细胞完整，未见炎性细胞浸润（图2A）。模型组小鼠皮肤组织镜下结构角化不全（图2Ba）、棘层增厚，向下形成突起（图 2Bb）、皮脂腺增多（图2Bc）。结合咪喹莫特乳膏诱导小鼠皮肤组织变化和血清检测结果，确定咪喹莫特乳膏涂抹能够诱导小鼠发生银屑病样变化。2.3ELISA检测小鼠血清中相关细胞因子变化ELISA法检测发现，模型组小鼠血清中IL-21、IL-17、TNF-、IFN-含量均升高，与对照组比较差异具有统计学意义（P0.05，图3）。3讨论银屑病，又名“干癣”“牛皮癣”，中医学称之为“白疕”，以寻常型银屑病为主5，主要特征为白色鳞片覆盖的红斑斑块、皮损和瘙痒。普遍认为与遗传、过敏、感染、精神和免疫紊乱等因素相关，其中炎症因子造成的免疫紊乱是主要原因6。外界刺激激活浆细胞来源的树突状细胞（dendritic cells，DC），产生 I 型干扰素（interferon-，IFN-；interferon-，IFN-）、IL-6、TNF-等炎症因子，活化髓A.空白组；B.模型组。图1BALB/c小鼠皮损外形变化（放大倍数：43）A.空白组；B.模型组。图2BALB/c小鼠皮损组织HE染色镜下结构（放大倍数：1010）*表示与对照组比较P0.05。图3模型组和对照组BALB/c小鼠血清银屑病相关细胞因子含量17第 22 卷 延安大学学报（医学科学版）第 1 期细胞来源的真皮成熟树突状细胞（mature dendritic cells，mDC），从而释放IL-237。IL-23进一步诱导Th1、Th17细胞活化，通过分泌产生 IFN-、IL-17、IL-21等细胞因子作用于真皮血管内皮细胞与表皮角质形成细胞产生银屑病样皮损8。临床研究 9-11 发现，银屑病患者血清中的TNF-、IFN-、IL-17、IL-21水平均高于正常对照组。TNF-、IFN-一直被认为是银屑病的经典炎症因子，在银屑病患者中高表达。自从Th17细胞被发现后，目前临床相关研究12认为Th17细胞分泌的IL-17是造成银屑病的最主要最直接的炎症因子，IL-23/IL-17轴是银屑病发病的关键环节。IL-17可以通过与其他因子协同刺激角质形成细胞增生，促进和延长炎症反应，还可以吸引其他炎症细胞释放炎症因子促进T细胞转化为Th17细胞，加重病情13。临床对照试验14发现，银屑病患者的IL-17 mRNA相比正常人高表达且与患者性别、年龄无明显关系。Th17细胞除分泌IL-17外，还同时产生IL-21。IL-21是近年来新发现的滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cell，Tfh）分泌的主要功能性分子，通过JAK/STAT、MAPK、PI3K/AKT等信号通路作用于T淋巴细胞及角质形成细胞上IL-21R，促进Thl7细胞分化并抑制Treg 细胞的分化，进而促进角质形成细胞的增殖15-17。相比健康人，银屑病患者IL-21和IL-21R在CD4+T淋巴细胞中高表达；从银屑病患者和健康人 的 外 周 血 单 个 核 细 胞（Peripheral blood mononuclear cel，PBMC）分离出CD4+T淋巴细胞，通过加或不加入IL-21处理，流式细胞术检测发现加入IL-21的CD4+T淋巴细胞增殖过多且通过上调维甲酸相关核孤儿受体 t（retinoic acid-related orphan receptor t，RORt）促进Th17细胞分化同时下调叉头盒蛋白 P3（forkhead box P3，Foxp3）抑制调节性 T 细胞（regulatory T cells，Treg）分化15。本研究采用干姜、肉桂水煎液灌胃，结合咪喹莫特乳膏涂抹方法，发现模型组出现银屑病样皮损变化，小鼠背部皮损隆起明显，边缘清晰，有白色鳞屑成片附着，红色甚至紫红色斑块散在分布；HE染色也发现典型银屑病皮损镜下结构，表皮角化不全、棘层增厚，向下突起延伸至真皮下、皮脂腺增多。以上结果与银屑病患者皮肤皮损表现、病理组织学检查结果高度相似，表明血热型银屑病模型能够反映银屑病患者皮损改变。ELISA法检测发现银屑病动物模型小鼠血清中 TNF-、INF-、IL-17、IL-21水平均明显升高，与银屑病患者血清微环境变化高度相似。因此，干姜、肉桂水煎液灌胃结合咪喹莫特乳膏涂抹方法建立的银屑病动物模型可用于银屑病发病机制和抗银屑病药物治疗研究。临床上银屑病患者体内微环境变化复杂，本研究仅观察了临床常见的IL-21、IL-17、TNF-、INF-变化，对该相关因子变化引起的银屑病研究具有一定意义，若需构建全面反映银屑病患者体内微环境变化的动物模型，还需进一步探索。参考文献：1 张红霞，王丽新.银屑病流行病学及危险因素研究进展 J.宁夏医学杂志，2023，45（7）：670-672.2 李慧贤，胡丽，郑焱，等基于全球疾病负担（GBD）大数据的中国银屑病流行病学负担分析 J 中国皮肤性病学杂志，2021，35（4）：386-3923 蔡晓萱，乔建军，方红.关节病型银屑病治疗进展国际国内最新治疗建议与诊疗共识解读 J.中国皮肤性病学杂志，2023，37（05）：489-495.4 苏晓翠寻常型银屑病患者血清Th1、Th17细胞相关细胞因子的表达及临床意义 D 南充：川北医学院，20195 SHAO F，ZHENG P L，YU D，et alFollicular helper T cells in type 1 diabetes J FASEB 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