NY∕T 4189-2022 化学农药 两栖类动物变态发育试验准则.pdf

2022?11?11发布2023?03?01实施化学农药两栖类动物变态发育试验准则17中华人民共和国农业行业标准备案号：XXXX-XXXX65.020CCS B41892022Chemical pesticide-test guideline on the amphibianmetamorphosis assay中华人民共和国农业农村部发 布N Y/T 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口.本文件起草单位:农业农村部农药检定所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所.本文件主要起草人:陈丽萍、尹晓辉、袁善奎、孙健、宋雯、曹玲、吴长兴、程涵智、周欣欣、王胜翔、赵秀振.N Y/T 化学农药两栖类动物变态发育试验准则范围本文件规定了化学农药对两栖类动物变态发育试验的材料、条件、操作、质量控制、数据处理、试验报告等的基本要求.本文件适用于测试和评价化学农药对两栖类动物变态发育的影响,其他类型的农药可参照使用.本文件不适用于易挥发和难溶解的化学农药.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.NY/T 难处理农药水生生物毒性试验指南.术语和定义下列术语和定义适用于本文件.吻泄距 s n o u t t ov e n t l e n g t h,S V L口至肛门的长度.注:单位为毫米(mm).不同步性发育d e v e l o p m e n t a l a s y n c h r o n i z a t i o n特定组织与其他组织在发育过程中出现了偏差的现象.N i e u w k o o p/F a b e r的分期标准 t h e s t a g i n gc r i t e r i ao fN i e u w k o o pa n dF a b e r 年P i e t e rD N i e u w k o o p和J F a b e r将非洲爪蟾生长发育时期(在 的温度下)的不同阶段进行拍照记录,并形成一套标准的发育数据表.该分期标准将非洲爪蟾从胚胎发育至成蛙共历经的 d,根据显著形态学标志分成 期发育阶段.试验概述采用流水式或半静态法,将处于 期(蝌蚪腿芽刚刚出现的发育阶段)的非洲爪蟾蝌蚪暴露于系列浓度的被试物溶液中 d,测定和观察后肢长度(HL L)、吻泄距(S V L)、湿重、日死亡数、发育阶段、甲状腺组织学,评估被试物是否干扰了蝌蚪变态发育进程和甲状腺组织形态.试验方法 材料和条件 供试生物 供试生物的选择供试生物为非洲爪蟾(X e n o p u s l a e v i s)蝌蚪.选择受精后 d内,发育至 期的健康的、表观正常的蝌蚪.成体爪蟾的繁殖与管理N Y/T 在实验室条件下,成体爪蟾可自然产卵,也可通过注射人绒毛膜促性腺激素(HC G)促进产卵以获得试验蝌蚪.选择对对成体爪蟾注射h C G(由 生理盐水溶解)催产,雌性注射 I U I U,雄性注射 I U I U.将配对爪蟾置于单独的水缸中,避免干扰以促其抱对.容器底部应具有不锈钢或塑料材质的网筛假底,蛙卵应能通过网筛落至缸底.产卵结束并完成受精后,应立即移走成体爪蟾.蝌蚪选择收集受精卵并从每窝受精卵中取样评估其质量.选用最佳的窝窝受精卵(总数量至少 个用于培养蝌蚪),分别转移至一个大的平盘或碟中孵化,并用吸管移除死亡或不正常受精卵.d后,将健康的蝌蚪移至合适数量的饲养容器中(),同一个试验中用到的全部蝌蚪应来源自同一批次受精卵.此外,还需准备额外的蝌蚪以替换首周饲养期间可能死亡的蝌蚪,保持蝌蚪的饲养密度一致.蝌蚪培养与饲喂在驯养和试验周期内均用合适的饵料(如丰年虾、草履虫及商用饲料等)饲喂蝌蚪.每天应多次少量(至少次),并记录饲喂频率.投饵量在确保蝌蚪吃饱的同时应尽量减少残饵量,用虹吸法及时清除残饵和粪便.驯养过程若使用静水系统,培养液至少每周完全更换次,驯养密度每升水不超过只;若使用流水系统,则每升水不超过 只(流速为 mL/m i n).在移动、清理以及处理蝌蚪的过程中,降低干扰.饲养期间,避免噪声、震动饲养容器、环境条件的急剧变化(如光照、温度、p H、溶解氧、水流速等).受精卵发育到蝌蚪 期应不超过 d.发育过程中每日都要进行观察,以便确定试验开始的时间.被试物试验前应收集被试物的基本信息,如C A S号、分子式、结构式、相对分子量、水溶解度、稳定性及蒸气压等,并建立可靠的定量分析方法(包括添加回收率、仪器检测限等)和暴露方式.主要仪器设备 玻璃或不锈钢水系统装置.繁殖缸.控温装置.双目解剖显微镜.数码相机.图像数字化软件.天平.温度计.溶解氧仪.p H计.硬度仪.照度计.各种实验室常用玻璃器皿及工具.移液器.分析仪器等.试验用水试验用水应适合非洲爪蟾蝌蚪正常生长和发育,可采用泉水或活性炭过滤的自来水等.试验开始前应检测水质,水中不应含铜、氯、氯胺、氟化物、高氯酸盐和氯酸盐等物质.试验用水的碘离子(I)浓度应在 g/L g/L.若试验用水碘离子未达到最低值,需通过加碘至最低浓度 g/L,并记录试验用水中碘或其他盐类的添加情况.试验容器试验容器应采用玻璃、不锈钢或其他化学惰性材质.容量为L L,水深 c m c m,流水装N Y/T 置的流速应恒定.试验条件使用荧光灯照明,光照度 l x l x,光暗周期为 h光照/h黑暗.水温(),p H ,溶解氧(DO)m g/L(空气饱和值的).试验条件应符合附录A的要求.试验步骤 暴露方法的选择根据被试农药的特性、稳定性或预备试验结果选择半静态法或流水式方法,优先选择流水式.对于难处理农药(难溶或略溶于水、易挥发、易降解、易被吸收、易被吸附、疏水性、离子型或多组分农药等),按照NY/T 选择试验方法执行.采用半静态法时,蝌蚪在试验前及试验过程都应使用同一种水,试验药液的浓度应保持在设计浓度.采用流水式试验时,应定期检查储备液与稀释用水的流量,以确保试验液的变化范围控制在 以内,流量应为 mL/m i n.溶液制备过程应优先采用简单方法,如搅拌或超声.不推荐使用溶剂或分散剂(助溶剂),如需使用,其用量应小于 mL(g)/L,且各试验容器中的用量应保持一致.试验浓度从最大溶解度、急性毒性试验的最大耐受浓度(m a x i m u mt o l e r a t e dc o n c e n t r a t i o n,急性毒性死亡率低于 时被试物的最高浓度)和 m g/L三者中选取最低的浓度作为蝌蚪变态发育试验(AMA)的最高浓度.浓度梯度按倍 倍设置至少个浓度组及一个空白对照组.最大试验浓度和最小试验浓度之间的差异至少为个数量级.若使用溶剂,应同时设置溶剂对照组.每个处理组和对照组(包括空白对照和溶剂对照)均应设至少个重复.试验周期蝌蚪发育至 期开始试验,持续染毒 d结束试验.承载量 只/L.染毒试验开始时(d),将满足发育标准的 期蝌蚪随机分发到每一暴露容器中,每处理至少个重复,每重复 只.然后观察是否存在异常(受伤、异常游动行为等),移除表观异常的蝌蚪并及时补充正常的蝌蚪.期蝌蚪的选择具体要求见附录B.水质测定试验期间,至少每周测定次所有试验容器中的溶解氧、p H和温度.同时,对试验温度进行连续监测(至少监测其中个试验容器).浓度分析试验开始前,应建立被试物在试验溶液中的分析方法及其定量限(L OQ)、标准曲线和回收率等,并进行方法验证,以确认被试物在试验溶液中的稳定性.半静态法试验期间,每周至少取样次(至少个样品)进行分析.若采用流水系统,更换储备液时需进行浓度分析,若处理组全部浓度中均检测不到被试物时,应测定储备液浓度并记录系统流速以便计算理论浓度.若测定浓度超出设定浓度的 ,流水式试验中采用测定浓度的算术平均值表示有效浓度,半静态试验中以测定浓度的几何平均值来表示有效浓度.观察与指标测量 第d测量于试验第 d从每一重复中随机抽取只蝌蚪,用 m g/L m g/L的MS (以碳酸氢钠缓冲调节p H至 )进行麻醉,并用水漂洗且吸干,测量每只蝌蚪的HL L和S V L,并称重(精确至毫克级),宜在双目解剖镜下观察发育阶段.处理后的蝌蚪不再放回试验体系.第 d测量N Y/T 试验结束时(第 d),按上述方法麻醉各重复蝌蚪,用水漂洗且吸干,测量每只蝌蚪的HL L和S V L,并称重(精确至毫克级).将所有蝌蚪的全身或包含下颚的头部组织样本置于D a v i d s o n s固定液中固定 h或 h,选其中只蝌蚪单独固定,用于组织病理学分析.单独固定的只蝌蚪依据空白对照组发育期中位数进行选择.a)若一个重复中合适发育期的蝌蚪大于只,则从中随机选择.b)若一个重复中合适发育期的蝌蚪小于只:)暴露组延缓了发育程度,则从发育期略低于对照组中位数的蝌蚪中选择补充;)暴露组加速了发育程度,则从发育期略高于对照组中位数的蝌蚪中选择补充.若处理组蝌蚪的所有发育期与对照组的中位数没有交集,则选择与对照组中位数发育期不同,但符合本重复发育期的蝌蚪样本,用于甲状腺组织病理学分析.此外,若发育阶段不明确(如各部位发育不同步),则从每个重复随机选择只蝌蚪用于组织病理学分析.应在报告中说明不依据对照中位数发育期进行蝌蚪取样的理由.终点指标 终点指标观察时期于试验第d和第 d测量主要终点值,同时d d每天观察死亡数.按表要求的时间点,进行AMA试验各指标调查测量,其中,发育阶段、HL L、S V L和湿重是AMA试验的终点指标.表A M A试验主要终点观察时间终点指标d d(每天)第 d第 d死亡数发育阶段后肢长(HL L)吻泄距(S V L)湿重甲状腺组织 蝌蚪发育阶段采用表中N i e u w k o o p/F a b e r的分期标准方法,确定蝌蚪的发育期,具体蝌蚪发育分期标志图见附录C.根据发育期数据可确定蝌蚪发育加快、不同步、延缓或无影响.比较处理组与对照组蝌蚪的中位数发育期,判断发育过程的加快或延缓.在组织检验没有畸形或异常而出现发育不同步的状况应写入报告,但不需记录个别蝌蚪的形态形成时间差异或组织发育干扰.表N i e u w k o o p/F a b e r分期标准方法的显著形态学分期标志显著形态学标志发育阶段(期)后肢前肢颅面结构嗅觉神经形态学尾长 体长与湿重应在试验的第d、第 d分别测量S V L与湿重.通过与对照组的比较,这个指标的变化可以评估被试物对蝌蚪生长速度的影响.S V L测量方法见图.后肢长度应在试验的第d、第 d分别测量左后肢的长度,见图,第d可直接测量HL L.第 d时应将后肢贴于身体并沿其中线测量.长度的测量可通过图像分析软件获得.若HL L在第d出现明显变化,即使 d变化不明显,仍视为甲状腺活动受影响.N Y/T 图蝌蚪长度测量 甲状腺组织学a)第一步,进行甲状腺病理学诊断.)若发育加速或不同步性发育的作用终点变化显著时,不必分析甲状腺作组织病理学;)若缺少明显的形态学变化或发育延缓的证据时,需进行病理学分析.b)若需进行病理学分析,则需开展甲状腺病理切片的制作,详细步骤见附录D,甲状腺组织学制备指南.c)对组织切片的分析和诊断,详细诊断标准、严重程度分级和图谱见附录E.病理学诊断的标准包括:)甲状腺肿大或萎缩;)滤泡细胞肥大或增生;)其他定性标准:滤泡内腔面积、胶体质量及滤泡细胞高度或形状,还需记录严重性分级(级),甲状腺病理学分级标准按附录E执行.死亡率应每天观察容器中蝌蚪的死亡情况,记录日期、浓度、容器编号及死亡的数量.及时清除死亡的蝌蚪.其他指标应记录蝌蚪的异常行为与可见的畸形或损伤.包括日期、浓度、容器编号等.正常行为特征:蝌蚪悬浮在水中时尾部高于头部、尾鳍有节奏的拍打、周期性的浮出水面、鳃盖正常活动、应激性等.异常行为特征:蝌蚪浮在水面、躺在容器底部、反向或不规则游动、缺少浮出水面的行为、无应激反应等.肉眼可见畸形和损伤特征:形态学异常(如肢体变形)、出血损伤、细菌或真菌感染及其他症状.这些应被视为类似于疾病/应激的临床体征,并与对照组进行比较.此外,应记录处理组间食物消耗总量的差异.若处理组比对照组产生症状的概率大,则应视为被试物有明显的毒性作用.AMA试验的判定逻辑 判定逻辑AMA试验的判定逻辑见附录F.加速发育:以下个终点的统计学分析结果可用于评价受试蝌蚪相对于对照蝌蚪发育速度是否有所加快.a)d归化值(HL L/S V L);b)d归化值(HL L/S V L);c)d发育阶段;d)d发育阶段.后肢长的统计分析应以左后肢长度为准.采用蝌蚪个体的后肢长与吻泄距比值(HL L/S V L)作为后肢长的归化值.比较每个处理归化值(HL L/S V L)的平均数,如果暴露组d或 d后肢长(归化值)的平均数显著大于对照组,则说明被试物显著加速了蝌蚪的发育.N Y/T 发育阶段的统计分析应依据N i e u w k o o p和F a b e r的形态学标准判定.如果分析显示暴露组d或 d发育阶段与对照组相比有显著增加,则表明被试物加速了蝌蚪的发育.AMA试验方法中,以上个终点中任何一个有显著效应都可认为加快了发育速度.不同步发育(由发育阶段标准判定)当d或 d出现不同步发育典型的症状:前腿缺失(或出现延缓)而后腿与尾部正常(或加速发育),或鳃部吸收早于后腿出现与尾部吸收(特别是尾鳍吸收),或前肢变形、头部变形(鳃的大小与鳃吸收的程度、下颚变形、M e c k e ls软骨突出等).对不同步发育个体的各类形态学特征进行量化评估并记录.前肢、尾和头部等形态发育正常,但后肢发育延缓,出现缺少后肢、异常脚趾现象(缺趾、多趾)或其他明显的畸形肢,不应判定为不同步发育.组织病理学若被试物没有明显的毒性效应,且没有加速发育、引起不同步发育或没有出现发育延缓,均应进行甲状腺的组织病理学分析.若甲状腺出现组织病理学改变,则可认为该被试物具有甲状腺活性;若未发现发育延缓或甲状腺组织损伤,则认为该被试物不具有甲状腺活性.组织病理学终点不能进行统计分析,应由病理学家判断相关效应是否与被试物的暴露有关.延缓发育(根据发育阶段、H L L、湿重和S V L判定)应排除试验的非甲状腺毒性,需结合发育阶段和甲状腺病理学,还需要考虑其他观察终点,包括水肿、出血损伤、游动减少、食物消耗量降低、异常游动行为等.若所有试验浓度都具有明显的毒性作用,应设计较低浓度以重新评价被试物是否具有潜在的甲状腺活性.统计结果显示明显的发育延缓,且无其他明显毒性效应的症状,则表明被试物具有甲状腺活性(拮抗作用).若差异无统计学意义,应在甲状腺病理学分析中进一步验证.数据处理 统计分析以至少个重复为分析单元,选用合适的统计方法对处理组与对照组之间的差异进行比较.在做J o n c k h e e r e T e r p s t r a或M a n n Wh i t n e yU检验时,使用中位数;做方差分析(D u n n e t t法或T a m h a n es T 法或D u n n e t tsT 法检验)时,使用平均数.剂量效应关系的单调性可以通过对重复和处理组的平均值或中位值直观判断.对照组或处理组的重复少于时,需采用J o n c k h e e r e T e r p s t r a和M a n n Wh i t n e y精确检验.上述所有检验方法所选用的统计学显著性水平均为 .连续性数值变量(H L L、S V L、湿重)连续性数值变量统计流程见附录G.如剂量效应关系符合单调性,用J o n c k h e e r e T e r p s t r a检验分析差异显著性,用s t e p d o w n法进行多重比较.如剂量效应关系不符合单调性,首先进行正态性检验(推荐用S h a p i r o W i l k或A n d e r s o n D a r l i n检验)和方差齐性检验(推荐用L e v e n e方法检验).也可根据专家经验判断,但只作为备选方案.如发现数据非正态或方差不齐时,应尝试进行数据转换.a)如数据(或转化后的数据)满足正态性和方差齐性,采用D u n n e t t检验分析处理效应的显著性.b)如数据(或转化后的数据)具有正态性,但方差不齐性,采用T a m h a n esT 或D u n n e t tsT 检验分析处理效应的显著性;也可用M a n n Wh i t n e y W i l c o x o nU检验.c)如数据不能进行正态转换,用M a n n Wh i t n e y W i l c o x o nU检验处理效应的显著性,并用B o n f e r r o n i H o l m法校正p值.死亡率试验中不宜出现显著的死亡率,但如果出现,则进行以下分析.a)如剂量效应关系符合单调性,采用C o c h r a n A r m i t a g e(s t e p d o w n法)或趋势卡方检验(L i n e a r b y L i n e a rA s s o c i a t i o n法)分析差异显著性.b)如剂量效应关系不符合单调性,采用经B o n f e r r o n i H o l m校正的F i s h e r精确检验法分析差异显著性.N Y/T 发育阶段数据用J o n c k h e e r e T e r p s t r a检验分析差异显著性,用s t e p d o w n法进行多重比较.分析优先选用第 百分位至第 百分位数据,也可用中位数.特殊数据的分析 缺陷处理的使用将具有明显毒性作用的重复或整个处理组作为缺陷处理,并从分析中剔除.判断重复或处理组是否具有明显毒性,应考虑多种因素.a)重复中蝌蚪死亡数大于只,其死亡是由被试物毒性引起的而非技术失误造成.b)其他明显毒性表现还包括出血、异常行为、异常游动姿势、厌食和其他疾病的症状.c)对于亚致死的毒性标志,需要进行量化评估(仅参照空白对照组).溶剂对照当使用了助溶剂,应同时设置溶剂对照组.试验结束时,通过溶剂对照与空白对照的统计学比较(如发育阶段、S V L、湿重)评价溶剂的潜在效应.若空白对照与溶剂对照出现了明显的差异,则在判断毒性效应试验终点时应用溶剂对照.若无明显差异,判断毒性效应试验终点时则采用空白对照和溶剂对照的数据合并分析.处理组发育超过 期蝌蚪 期后,蝌蚪组织开始吸收,引起形体大小与体重下降.因此,蝌蚪的湿重与S V L数据不能用于生长速率差异的统计分析.在计算重复平均值和中位数时,剔除大于 期蝌蚪的湿重和体长数据.使用以下种方法分析这类生长相关的参数.a)只有少部分蝌蚪()超过 期时,统计分析湿重或S V L数据,只考虑发育期 期蝌蚪的数据.b)一个或多个处理中存在较多数量蝌蚪()发育超过 期,运用双因素嵌套方差分析,充分利用全部数据评估被试物对蝌蚪的生长效应,同时考虑超期发育对生长的影响.双因素嵌套方差分析方法见附录H.质量控制质量控制应满足以下条件:无明显毒性的试验浓度个;试验结束时,对照组发育阶段分布的第 百分位与第 百分位的差异不得超过期,且发育阶段(中位数)期;半静态法时,试验液更新间隔不得超过 h;甲状腺效应为阴性的有效试验,任一处理(包括对照)死亡率,每个重复死亡蝌蚪不得超过只,否则作为缺陷重复;至少组处理的所有个重复不存在缺陷重复,至少具有组处理没有明显毒性.对于测定甲状腺活性为阳性的有效试验,对照组蝌蚪每个重复死亡数不得超过只.试验报告试验报告应至少包括以下内容.a)被试物)被试物特性:物理化学性质、稳定性和生物降解性的相关信息;)溶剂(非水溶剂):选择溶剂的合理性、溶剂的特性(性质与使用的浓度).b)供试蝌蚪名称、品系、大小、来源,受精卵的收集及其后续处理方法.c)试验条件)试验程序,如半静态法或流水式法,承载量等;N Y/T )光照周期;)试验设计(如处理组的数量,每个处理组的重复数,每个重复中的数量,试验容器的材质和尺寸、每个容器中水的体积等);)储备液制备方法,试验液更新频率(如使用了助溶剂,还须给出其名称及浓度);)被试物暴露装置(如泵、循环计数、压力);)分析方法:定量限、检测限、添加回收样品的添加水平及其回收率、实测浓度平均值及其标准偏差等;)试验浓度、平均实测值及其标准偏差;)试验用水特性:p H、温度、溶解氧、总碘以及其他测量指标(包括铜、氯、氯胺、氟化物、高氯酸盐和氯酸盐等);)试验期间水质情况:p H、硬度、温度和溶解氧等;)饲喂信息:饲料种类、来源、饲喂量和饲喂频率.d)结果)生物学观察结果与数据:每日死亡数、食物消耗量、异常游动行为、游动减少、游动失调、畸形、损伤等,定期观察症状并记录,包括发育阶段、HL L、S V L、湿重;)统计分析方法:统计分析结果(推荐以表格形式呈现);)组织学数据:包括叙述性的描述、严重度分级以及特定观察现象发生的概率;)附加的观察:包括上面观察范围之外的叙述性的描述;)试验偏离;)结果讨论,通过终点指标的统计分析结果以及组织学数据的分析,运用AMA试验的判定逻辑评价被试物对两栖类动物是否具有甲状腺活性.N Y/T 附录A(规范性)AMA d试验条件AMA d试验条件见表A .表A AMA d试验条件项目要求试验动物非洲爪蟾蝌蚪初始蝌蚪发育阶段N F 期暴露周期 d蝌蚪选择标准发育阶段与全体长(可选)试验浓度个数量级至少个浓度梯度暴露条件流水式(建议用)或半静态系统试验系统流速 m L/m i n(大概 h可完全更新原溶液)主要终点死亡率每天发育阶段d、dHL Ld、dS V Ld、d湿重d、d甲状腺组织学 d稀释水/实验室控制去氯自来水(活性炭过滤)或实验室的同等资源蝌蚪密度 只/L试验溶液/试验容器L L(水深 c m c m)/玻璃或不锈钢容器重复设置至少个重复对照组可接受的死亡率每容器 甲状腺固定固定数目全部蝌蚪(初始评价只/重复)部位头部或整个身体固定液D a v i d s o n s固定液饲喂食物丰年虾、草履虫、商用饲料等数量/频率至少次/天光照光周期 h光/h暗光照 l x l x(在水表面测量)水温()p H (重复间差异不超过 )溶解氧 m g/L(空气饱和值)样品分析频率至少每周次(样品/试验)N Y/T 附录B(资料性)期蝌蚪的选择B 将健康、表观正常的蝌蚪集中至一个容器.进行发育期判定时,将蝌蚪单独转移到盛有培养水的容器中(如培养皿)观察.必要时,可使用 m g/L三卡因间氨苯酸乙酯甲磺酸(M S ,使用前用p H 的碳酸氢钠稀释)进行麻醉后观察判定.可用双目解剖显微镜观察,选择 期蝌蚪,其最显著的特征是出现后肢芽,见图B .图B 非洲爪蟾蝌蚪 期后肢形态学特征B 除 期发育特征外,选择试验蝌蚪还应考虑蝌蚪体长因素.在d染毒前随机测量 只 期蝌蚪的全体长(全体长测量方法见图),选取长度为平均值mm范围内的蝌蚪(正常发育 期的蝌蚪全体长平均值为 mm mm).将筛选出的试验蝌蚪放入同一容器.N Y/T 附录C(资料性)蝌蚪发育分期标志图C 蝌蚪 期 期发育分期标志见图C .注:小图表示后肢形态,S t 代表发育期,L a t 代表侧面图,V e n t r 代表腹面图.图C 期 期蝌蚪发育分期标志图N Y/T C 蝌蚪 期 期发育分期标志见图C .注:F L 代表前肢,S t 代表发育期,L a t 代表侧面图,D o r s 代表背面图,V e n t r 代表腹面图.图C 期 期蝌蚪发育分期标志图N Y/T C 蝌蚪 期 期发育分期标志见图C .注:S t 代表发育期,L a t 代表侧面图,D o r s 代表背面图,V e n t r 代表腹面图.图C 期 期蝌蚪发育分期标志图N Y/T 附录D(资料性)非洲爪蟾蝌蚪取样和甲状腺切片制作指南D 蝌蚪选择 d试验结束时,选择中位数为 期 期蝌蚪进行甲状腺切片制作.D 甲状腺切片制作的主要步骤切片步骤主要分为个部分:前处理、包埋、切片、染色.D 前处理D 固定试验结束后将蝌蚪放入 m g/L的M S 中m i n(时间视M S 的情况而定,直到样本死亡即可)安乐死,之后将样本放入福尔马林固定液中固定过夜(或长期存).(固定液:福尔马林 m l、硫酸氢二钠 g、磷酸二氢钠 g、蒸馏水 m l)D 剪切将蝌蚪头部切下,同时去除粘连的内脏,只留透明的头部,见图D .图D 蝌蚪头部剪切图D 脱水和透明将已切下的样本按不同浓度组放入不同小盒中,用标签编号(铅笔),每只小盒中所放样品不宜过多,依样品大小而定,每盒放个个样品.将编好号的小盒依次放入酒精中,每放组记录次时间,保证在每个溶液中停留规定的时间.按以下顺序依次脱水和透明样本:a)酒精,m i n,室温;b)酒精,m i n,室温;c)酒精,m i n,室温;d)酒精,m i n,室温;e)酒精,m i n,室温;f)酒精,m i n,室温;g)酒精,m i n,室温;h)酒精,m i n,室温;i)二甲苯,m i n,室温(通风橱);N Y/T j)二甲苯,m i n,室温(通风橱);k)石蜡,m i n,水浴(水浴锅设置为);l)石蜡,m i n,水浴(水浴锅设置为).D 包埋包埋前提前准备好工具和材料,包括包埋盒、镊子、酒精灯以及浇注用石蜡(提前熔融).选择平整水平的台面操作,最好在台面上铺层报纸.先将包埋盒放在酒精灯上烘烤几秒,防止石蜡倒入后就凝固.按以下步骤进行包埋.a)向包埋盒中倒一层石蜡,高度不超过包埋盒的/(过高会使样本漂浮,无法固定),将样本轻轻放入包埋盒,待石蜡快凝固时,用镊子小心调整样本姿势直至石蜡半凝固(晃动包埋盒样本不移动).b)之后用石蜡将包埋盒注满,扣上小盒子,盒子中再注入层石蜡固定.c)将包埋好的石蜡盒先室温冷却,待触摸包埋盒外壁不烫手后,再整个放入冷水中冷却,最后可放入冰柜中,冷却m i n m i n可直接取出包埋好的蜡块.D 切片切片前先调整夹子的位置,要尽量使夹子的平面与台面垂直.取刀片卡入刀口 每片刀可使用次,(左半边右半边)正反面.按以下步骤进行切片.a)将蜡块卡在夹子上(一定要顶到底,与夹子间不留空隙),先以 m m的厚度粗切,直至切到有组织出现为止.b)将粗切好的蜡块倒置于冰块上冷却m i n m i n,再夹住,以 m的厚度重新进刀,直到切出完整蜡带.c)厚度调整为mm切片.每切片 片后,以 m向前进几刀,再调到mm切片.如此反复直至将蝌蚪的眼睛切到不可见为止.d)切好的蜡片用毛笔或镊子轻轻地放入冷水中展片,展开后用载玻片捞起,放入 水浴锅中再展片.e)展好的切片放在水浴锅边预干燥,放入切片架后,在烘箱()中过夜干燥(或h以上).此时可在强光下粗略观察下是否已经切到甲状腺部位,即不是“Y”型而是饱满的“U”型,且内部纹理比较清晰,有镂空,不是一整块.D 染色切片过夜干燥,从烘箱中取出后,依次放入以下溶液中染色:a)二甲苯,m i n;b)二甲苯,m i n;c)酒精,m i n;d)酒精,m i n;e)酒精,m i n;f)酒精,m i n;g)温水,m i n;h)苏木精,m i n(滴染),m i n(侵染);i)流水,m i n;j)伊红,m i n(滴染),m i n(侵染);k)冷水,m i n;l)酒精,s;m)酒精,s;n)酒精,s;o)酒精,m i n;p)酒精,m i n;N Y/T q)二甲苯,m i n;r)二甲苯,m i n.从二甲苯中取出切片后,在组织上滴一滴树脂,用盖玻片盖住即可镜检.滴染要将载玻片放置在平整水平的台面上(暗色底),将染色剂覆盖所有样本后静置.静置结束后将载玻片放入切片架,放入水中清洗.苏木精和伊红操作都如此.苏木精和伊红在清洗完后可直接拿去镜检,检查染色是否充分(颜色要略重一些,在之后的脱水过程中可能会褪去一点颜色).如盖玻片很脏,需要先用酒精浸泡然后擦干.以上所用的所有试剂都要保证其中没有悬浮的杂质,包括展片时和冲洗染色剂时使用到的水.N Y/T 附录E(规范性)甲状腺病理学分级标准E 核心标准E 甲状腺肥大或萎缩:由于滤泡细胞数目或尺寸变化引起的甲状腺肥大或者萎缩.E 滤泡细胞的肥大:滤泡细胞肥大是指基于高柱状细胞变异的百分率进行分级的,正常两栖动物的甲状腺滤泡细胞形状是在鳞状细胞到柱状细胞之间变化,即由柱状细胞排列的.E 滤泡细胞的增生:出现滤泡细胞拥挤、分层、单个或多个乳头状滤泡细胞内折.E 核心标准严重度分级甲状腺病理学严重度分级标准见表D .表D 甲状腺病理学严重度分级标准等级描述甲状腺肥大严重程度分级标准甲状腺萎缩严重程度分级标准滤泡细胞肥大严重程度分级标准滤泡细胞增生严重程度分级标准不显著与对照相比腺体肥大小于 与对照相比腺体萎缩小于 小 于 的 滤 泡 细胞出现肥大小于 的滤泡细胞局灶性或弥漫性增生轻度与对照相比腺体肥大 与对照相比腺体萎缩 的滤泡细胞出现肥大 滤泡细胞局灶性或弥漫性增生,和或单个或多个乳头状滤泡细胞层中度与对照相比腺体肥大 与对照相比腺体萎缩 的滤泡细胞出现肥大 的滤泡细胞局灶增生,假分层或滤泡上皮细胞分层(可能存在乳头内折)重度与对照相比腺体肥大超过,两个腺体中间已连接,超出正常值,并进入周围组织的空间与对照相比腺体萎缩超过 超 过 的 滤 泡 细胞出现肥大超过 的滤泡细胞广泛增生,分层层(乳头内折现象)E 附加标准E 滤泡腔面积增加或减少:使用上述分级标准记录相关变化.E 滤泡胶体质量:记录胶体质量的变化,如均质、非均质、网眼状或颗粒状.也可由病理学家判定胶体的着色质量.E 滤泡细胞高度或形状:滤泡细胞高度或形状可以从鳞状到立方形,从低柱状到高柱状.滤泡上皮细胞高度增加(从立方体向柱状发展)可导致腺体肥大.如有必要,可记录主要细胞的形状(鳞状、立方体、低柱状、高柱状).N Y/T 附录F(资料性)AMA试验的判定逻辑AMA试验的判定逻辑见图F .a 表示尽管加速发育与不同步发育发生了显著的变化,但是某些权威机构还要求进行组织学分析.试验人员应咨询相应的管理部门以确定哪些试验终点是必需的.图F AMA的判定逻辑流程图N Y/T 附录G(资料性)连续性数值变量统计流程图连续性数值变量统计流程见图G .图G 连续性数值变量统计流程图N Y/T 附录H(资料性)双因素嵌套方差分析H 双因素嵌套方差分析:如发育阶段 期,定义L a t e S t a g e Y e s,反之为N o.以浓度水平和蝌蚪为随机效应,对试验浓度和超期发育个因素,及二者间的交互作用进行方差分析.对“重复L a t e S t a g e”均值做加权(以每一均值的蝌蚪数量为权重),以重复为单元进行分析.若数据分布不满足方差分析对于正态性或方差齐性的要求,则需将数据转化成正态分布.H 对试验浓度和L a t e S t a g e二者间交互作用的检验,除了上述标准的方差分析,还可以用个方差分析进行,一个针对L a t e S t a g e N o 的各浓度的平均效应,另一个针对L a t e S t a g e Y e s 的各浓度的平均效应.还能对各L a t e S t a g e水平内处理组与对照组的均值做进一步比较.如果在L a t e S t a g e变量的同一水平内呈非单调性的剂量效应关系,那么可以应用合适的对比或简单的两两比较进行趋势分析.N Y/T 参考文献P D N i e u w k o o p&J F a b e r()N o r m a lT a b l eo fX e n o p u sL a e v i s(D a u d i n)G a r l a n dP u b l i s h i n g,N e wY o r kO E C D()T e s tNO :G u i d a n c eD o cm e n to nAm p h i b i a nT h y r o i dH i s t o l o g yO E C D()T e s tNO :Am p h i b i a nM e t a m o r p h o s i sA s s a y O E C DG u i d e l i n e s f o r t e s t i n go f c h e m i c a l sU SE P A()Am p h i b i a nM e t a m o r p h o s i s(F r o g)(O P P T S )E n d o c r i n eD i s r u p t o rS c r e e n i n gP r o g r a mT e s tG u i d e l i n e sO E C D()T e s tNO :D e t a i l e dR e v i e w P a p e ro nAm p h i b i a n M e t a m o r p h o s i sA s s a yf o rt h eD e t e c t i o no fT h y r o i dA c t i v eS u b s t a n c e s A S TM()S t a n d a r dG u i d e f o rC o n d u c t i n gA c u t eT o x i c i t yT e s t so nT e s tM a t e r i a l sw i t hF i s h e s,M a c r o i n v e r t e b r a t e s,a n dAm p h i b i a n s Am e r i c a nS o c i e t yf o rT e s t i n ga n dM a t e r i a l s,A S TMI n t e r n a t i o n a lE (),W e s tC o n s h o h o c k e n,P A