草酸青霉16β-葡萄糖苷酶的异源表达_张念.pdf

第 卷 第 期 年 月江西师范大学学报（自然科学版）（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（，），江西省自然科学基金（）和江西师范大学博士科研启动基金（）资助项目通信作者：赵喜华（），男，江西玉山人，教授，博士，主要从事酶工程和合成生物学研究：张念，林颖颖，祁可丹，等 草酸青霉 葡萄糖苷酶的异源表达 江西师范大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：文章编号：（）草酸青霉 葡萄糖苷酶的异源表达张 念，林颖颖，祁可丹，王国平，欧阳蓓，赵喜华（江西师范大学生命科学学院，江西 南昌）摘要：为探究真核菌株草酸青霉 的 葡萄糖苷酶（）在不同宿主中的异源表达情况，该文通过基因克隆技术，将 基因分别与、载体进行连接，转化到毕氏酵母 或大肠杆菌 （）上，筛选阳性克隆子，比较并分析其表达情况 结果表明：未能成功电转到毕氏酵母 上；将 转化到大肠杆菌 上，使用最终物质的量浓度为 的 和质量分数为 的乳糖在 下诱导可实现高水平表达，但极易形成包涵体且无活性 为了消除包涵体的影响，在相同条件下将 的 端加入 分泌信号肽，经 检验，有高水平可溶性表达，但无活性；将 电转到 上，筛选阳性克隆子并接种到含 培养基的摇瓶中，结果表明：上清液蛋白质量浓度达到 ，且有活性 真核来源的 基因适合于真核宿主表达关键词：葡萄糖苷酶；异源表达；酶活中图分类号：文献标识码：引言碳水化合物是地球上分布最广、储量最丰富的可再生生物质资源，大量焚烧碳水化合物会造成环境污染和资源浪费 因此，将多余的碳水化合物转化为有用的生物燃料和化学物具有重要的研究价值 纤维素是自然界分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量 以上 水解纤维素的酶包括，内切葡聚糖酶（）、纤维二糖水解酶（）和，葡萄糖苷酶（）可将长链纤维素水解为纤维糊精和低聚糖，释放纤维二糖单位，将纤维二糖转化为葡萄糖 通常被最终产物葡萄糖抑制，使得纤维二糖的水解成为一个限速步骤 纤维二糖的积累会抑制 和 的作用，减缓整个降解过程 因此，获得大量性质优良的 对加速这一过程具有重要意义本课题组筛选了一种新的快速生长的野生真菌 草酸青霉，它能分泌淀粉酶、纤维素酶和半纤维素酶，研究了草酸青霉 的 的最适温度、最适 值、酸碱耐受性等，发现 具有较差的有机酸耐受性 已通过同源建模获得 维结构，也进行了分子对接，但是精确度不如 衍射的 维结构 此外，的催化机制还有待进一步地阐释 想要解决这些问题，关键是要获得 的蛋白晶体 基于 衍射等技术的结构解析，根据结构决定功能原理，可进行定点突变，以获得耐受有机酸的 突变体，为其应用于纤维素乙醇生产奠定基础 所有这些过程的前提是获得高浓度、高纯度的 蛋白 因此，本文从提高蛋白浓度入手，通过多种手段进行蛋白表达的对比分析 实验材料与方法 实验材料 基因来源于本实验室，载体、载体、载体、毕氏酵母 分别由清华大学李春教授和华东理工大学魏东芝教授赠送 大肠杆菌（）购自索来宝，胶回收和质粒提取试剂盒分别购自 和 公司，酶购自 公司，连接酶和各种限制性核酸内切酶购自 公司，离子交换柱购自天地人和公司，氨苄西林、卡那霉素、氯霉素、柠檬酸、二水合柠檬酸三钠、氯化钠、乳糖、考马斯亮蓝 等均为分析纯试剂，它们购自国药集团药业股份有限公司 实验方法 基因的获取从 基因序列，根据、载体酶切位点，使用 软件设计引物，引物序列如表 所示，再使用 连接酶将双酶切基因和相应载体进行连接表 与不同载体相连的 基因引物表达系统引物名称引物序列（）划线处酶切位点酵母 甲醇诱导型 酵母 组成型 大肠杆菌 诱导型 、酶活性的鉴定 在碱性条件下，葡萄糖苷酶以水杨苷为底物，在 下反应.，可产生葡萄糖，还原糖与二硝基水杨酸（）会发生氧化还原反应，生成 氨基硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下呈棕红色，根据在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，在 处测定其吸光度在 和 连接并转化到毕氏酵母 中表达时，目的蛋白分泌在胞外，只需在培养后离心取上清液鉴定即可 当转化到大肠杆菌 中表达时，目的蛋白分泌在胞内，只有在诱导后超声破碎离心取上清液才能鉴定 重组载体的表达）重组菌的表达 重组载体经 线性化后电转到毕氏酵母 上，在含博莱霉素的 平板上筛选阳性克隆子，将阳性克隆子接种到 液体培养基中于 和 的转速下培养 ，离心取上清液测酶活，并进行 蛋白电泳鉴定）重组菌的表达 将含有 重组载体的阳性克隆子接种到 培养基中，在 和 条件下培养 ，再加入最终物质的量浓度为 的 和最终质量分数为 的乳糖，于 和 条件下过夜诱导，在破碎细胞后取上清验证酶活，并进行 蛋白电泳鉴定在 的 端引入 分泌信号肽序列，含有 重组工程菌的表达操作步骤同上 蛋白纯化使用 离子交换柱和 液相色谱分析仪进行蛋白纯化 蛋白酶液在 转速下离心 ，用透析袋固装好上清液并放在装有 值为 、物质的量浓度为 的柠檬酸缓冲液的烧杯中，用保鲜膜密封好放在 冰箱中透析 ，期间最少换 次缓冲液 之后收集液在 转速下离心 ，上清液使用孔径为 的微孔滤膜抽滤，平衡液与洗脱液也需进行同样处理 使用 不含盐的 值为 、物质的量浓度为 的柠檬酸缓冲液以 的流江西师范大学学报（自然科学版）年速平衡预装柱，然后以相同的流速上样 蛋白酶液，室温静置，使用 不含盐的 值为、物质的量浓度为 的柠檬酸缓冲液洗脱部分杂蛋白，最后使用 值为 、物质的量浓度为 的低盐柠檬酸缓冲液和物质的量浓度为 的高盐柠檬酸缓冲液进行梯度洗脱，直至出现蛋白峰值 检测每一步收集液的酶活和蛋白浓度，并进行蛋白电泳鉴定 实验结果 重组载体的构建如图 所示，、都连接成功15 00010 0007 5005 0002 5001 0002505002501005 0003 0002 0001 5001 000750bpM 1 2 3 M 4 5 6 7 8 9M10 11 12Mbp 注：为；、为 基因；为 重组质粒，为 空载体；、为 空载体，为 重 组 质 粒；为 重 组 质 粒；为 空载体，为 重组质粒图 重组表达载体构建凝胶电泳图 重组蛋白的表达 在 中的表达如图 所示，重组蛋白在大肠杆菌 中实现高水平表达，但目的蛋白均为包涵体，破碎细胞上清液也没有酶的活性M123456789kDa20011697.266.444.329.020.1 注：为；为 重组蛋白：为目的蛋白号在破碎后的全细胞，为在破碎后的上清液，为在破碎后的沉淀；为目的蛋白号在破碎后的全细胞，为在破碎后的上清液，为在破碎后的沉淀；为空载体 在破碎后的全细胞，为在破碎后的上清液，为在破碎后的沉淀图 重组蛋白 凝胶电泳图 在 中的表达如图 所示，重组蛋白在大肠杆菌 中实现了高水平表达，而且在破碎后上清液含有目的蛋白，这表明在胞内可溶性表达，但是酶也无活性另外，测序表明序列连接正确M123456kDa20011697.266.444.329.020.1 注：为；为目的蛋白在破碎后的全细胞，为在破碎后的上清液，为在破碎后的沉淀；为空载体 在破碎后的全细胞，为在破碎后的上清液，为在破碎后的沉淀图 重组蛋白 凝胶电泳图 在 中的表达 由于 不能电转到 中，所以后续的蛋白表达实验也无法进 行 因 此，本 文 将 与 连接，并且成功电转到 中 如图 和图 所示，重组蛋白在毕氏酵母 中表达且有活性 由表 可知：蛋白质量浓度达到，经过浓缩纯化后，质量浓度达到 ；纯度为 左右，但仍达不到 的质量浓度和以上的 纯度的结晶要求97.066.242.731.012M 注：为；为在纯化后的蛋白酶液；为在浓缩后的原始酶液图 重组蛋白 凝胶电泳图表 的蛋白纯化蛋白酶液蛋白质量浓度（）原始酶 透析液 穿梭液 收集液 浓缩液 第 期张 念，等：草酸青霉 葡萄糖苷酶的异源表达 注：为对照组：酶液与 底物水杨苷未加热反应，在直接加 终止反应后煮沸冷却；为实验组：酶液与 水杨苷在 下加热反应，在再加 终止反应后煮沸冷却图 酶活检测图 讨论能源在国家发展中被视为经济增长的重要推动力，有着举足轻重的作用 但化石等能源为不可再生资源且储量有限，在使用过程中容易造成环境污染问题 用可再生资源替代化石能源，可以减少化石燃料的使用并减少对环境的污染 木质纤维素在可再生生物质资源中占比最大（），其以纤维素生物质为原料，可转化为各种化学品（如乙二醇等）纤维素需要、和 协同降解，其中 是整个水解反应的限速酶，它可将纤维二糖转化为葡萄糖，通过催化末端非还原性 葡糖基残基的水解并释放 葡萄糖 在许多领域（如纤维素降解、食品风味的改善等）中具有重要的应用价值，它存在于自然界许多植物、酵母、曲霉、木霉等细菌体内，可参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用 此外，还能将在水果、蔬菜、茶叶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质 因此，近年来 受到学术界广泛关注，具有重要的理论和实用价值本文以 为出发点，研究它与不同载体连接后在不同宿主上的表达情况 通过实验成功地筛选到了阳性克隆子，但在验证后发现表达情况各不相同 未能电转到毕氏酵母 上，其原因可能是重组载体片段过大；转化到大肠杆菌 上，筛选阳性克隆子接种到 培养基中，在 和 条件下培养 ，使用最终物质的量浓度为 的 和最终质量分数为 的乳糖在 下过夜诱导可实现高水平表达，但极易形成包涵体且无活性 为了消除包涵体，可使重组蛋白分泌至周质空间，周质空间的周质蛋白不仅能帮助重组蛋白正确折叠还有利于二硫键的生成 因此，在设计 引物时，端加 了 分 泌 信 号 肽 序 列 在相同条件下可实现高水平可溶性表达，但表达的酶经鉴定无活性；电转到毕 氏 酵 母 中，涂 板 到 平 板（含 博莱霉素）上，筛选阳性克隆子接种到 烧瓶中，在 和 条件下培养 ，最终能组成分泌表达且有酶的活性，但蛋白纯化后的质量浓度较低，仅为 为了获得蛋白结晶，未来工作应集中于发酵罐小试研究，以获得更多的 从构建的重组表达载体在不同宿主中的表达情况来看，来源于真核菌株的基因在原核宿主中很难表达出有活性的蛋白，因为原核宿主缺乏蛋白翻译后修饰的功能，所以目的蛋白不能折叠为正确的 维结构，最终导致蛋白无活性 这为之后的研究提供了一些思路：来源于真核菌株的基因应在真核宿主中表达，尽量避免使用原核宿主 参考文献 ，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，江西师范大学学报（自然科学版）年 ，（）：，（）：李琦，童欣怡，姜云鹏，等 定点突变提高 木糖苷酶 的酶活 食品与生物技术学报，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（，）：（），（），：；（责任编辑：刘显亮）第 期张 念，等：草酸青霉 葡萄糖苷酶的异源表达