笼型蛋白仿生纳米结构构建及抗病毒研究_袁嫕.pdf

第 卷 第 期 年 月电 子 显 微 学 报 ，文章编号：（）笼型蛋白仿生纳米结构构建及抗病毒研究袁 嫕，王 超，郭 琼，王 刚，谢志萍，段招军，郑丽舒（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 国家卫生健康委员会医学病毒与病毒病重点实验室，北京）摘 要 本研究利用笼型铁蛋白亚基的解聚和自组装过程，在蛋白酶促活性位点上仿生合成 尺径可控的金纳米团簇，构建了新型高生物活性抗病毒纳米药物 ，使用多种电镜学方法对其形貌、结构进行了表征；在抗病毒功效方面，具有抑制 细胞 抗原分泌和降低 核酸复制的效果，抑制效果随金团簇尺径增加而提高并与纳米药物的浓度呈正相关；在细胞毒性实验测试中，未发现有细胞毒性，且增高了细胞活力，具有很高的生物安全性。本研究提出了一种新的抗病毒纳米药物构建策略，相对传统小分子抗病毒药物，在提高药物生物兼容性、降低毒副作用和抗耐药性等方面具有较大的潜力和应用前景。关键词 笼型蛋白；自组装；仿生合成；纳米结构；抗病毒中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：中国博士后科学基金面上项目（）作者简介：袁嫕（），女（汉族），湖北武汉人，副研究员：通讯作者：郑丽舒（），女（汉族），辽宁沈阳人，研究员：段招军（），男（汉族），湖南怀化人，研究员：病毒感染是人类面临的巨大挑战，特别是近些年，流感病毒、埃博拉、新型冠状病毒等多种新发型病毒爆发全球局部区域至大范围的流行，严重威胁人类的健康。病毒感染的治疗一直是世界性的难题，防控策略往往依赖于疫苗，具有滞后性和被动性，抗病毒治疗性药物进展较慢，传统抗病毒药物往往副作用较大，极易产生抗药性。如何创新性地研发新型高效低毒的抗病毒治疗性药物，是我国乃至世界传染病防控和治疗领域亟待解决的难题。纳米药物是近年来抗病毒药物研发领域突起的热点，纳米材料独特的理化性质，如纳米尺度粒径小、相对比表面积大、表面分子活性强、独特的分子组装结构等，这些特性均有可能产生独特的抗菌、抗病毒治疗效应，其抗病毒原理与传统小分子抗病毒药物不同，传统的小分子药物往往针对一种或一类病毒的治疗，而纳米材料药物对病毒的杀伤往往具有无差别性，因此具有广谱抗病毒的潜力，且纳米材料药物目前没有发现有耐药性产生。多项研究已证明，病毒的增殖与细胞的氧化应激水平相关，如乙型肝炎病毒（）的复制可以引起细胞内 水平显著上升，并由此增加肝纤维化和肝癌的发生率。一些具有纳米酶活性的无机纳米材料，包括金属氧化物（、等）、金属及合金纳米材料（纳米颗粒等）、碳类纳米材料等具有高效催化功效，这类纳米材料可以通过抗氧化应激调节降低病毒在宿主细胞内的繁殖率，还可以破坏病毒表面的一些蛋白抗原，降低病毒的毒力。由纯无机纳米材料研发的治疗性药物往往细胞毒力较大，限制了应用潜力，而以生物体内的天然笼型蛋白质为载体，仿生合成的纳米结构在生物兼容性上具有天然的优势，金离子可以通过笼型蛋白的通道空隙进入蛋白内部合成金团簇，本研究在前期研究基础上，通过对人源笼型铁蛋白亚基解聚和再次自组装体系的设计构建，实现了 尺径可控的金纳米团簇在笼状蛋白限域空腔内部酶活性位点上的仿生合成，并首次应用于抗病毒功效治疗，以 细胞为模型测试了 纳米药物抗 抗原分泌和核酸复制的功效，并完成了细胞毒性测试和安全性分析，为建立新型抗病毒笼型蛋白仿生纳米结构平台奠定基础。材料与方法 主要试剂，等细胞培养试剂购自美国 公司，（第 期袁 嫕等：笼型蛋白仿生纳米结构构建及抗病毒研究 ）购自美国 公司，溶液（水溶液）等试剂购自英国麦克林试剂公司，透射电镜和高分辨电镜制样专用水（）购自北京灵熵科技有限公司，和 诊断试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司，核酸提取试剂盒（）购自德国 公司，乙型肝炎核酸测定试剂盒购自广州中山大学达安基因股份有限公司，检测试剂盒（）购自瑞士 公司。重组质粒的构建表达 所选人源铁蛋白，其 基因序列号为，按照常规方法构建人源铁蛋白基因重组的大肠杆菌表达载体，发酵培养 ，诱导表达 ，收集的产物依次经过经 处理、离子交换柱和分子筛纯化，得到高纯度的人源铁蛋白（）。仿生纳米结构的构建 在天然细胞环境中，金属 通过铁蛋白的亚基间空腔进入到铁蛋白内部，吸附在铁蛋白空腔内部的亚铁氧化酶酶促位点上，并由亚铁氧化酶酶促中心氧化成，完成储存铁的生理学功能。本文的仿生合成方法模拟了这个生理学过程的逆反应，将 溶液浓度稀释至 左右，新配置的氯金酸和 溶液按照 ，的摩尔比混合，该比例是经过精准计算过的不同尺径金团簇所需要的金原子数目，调整体系 至，在此 条件下，解聚成亚基状态，此时 不由亚基间的空腔进入蛋白内部，而是在笼型蛋白的亚铁还原酶活位点上充分吸附，振荡孵育 ，调整体系 至 ，此时 亚基自组装成 聚体笼型结构，蛋白内部亚铁氧化酶活性结构域组装完成，继续将反应体系 值调整并维持在，酶促中心开始催化已吸附的 在原位还原、成核、生长，分别振荡孵育 、和，随着反应时间增加，溶液的颜色由浅黄色至暗红色变化，尺径约 、的金纳米团簇依次合成。合成反应结束再次经过分子筛进一步纯化，去除反应体系中形成的副产物，最终得到高纯度的一系列不同尺径的 仿生纳米结构。透射电镜表征 将待表征样品稀释至合适浓度，吸附于镀有连续碳膜的载网上，使用 醋酸铀溶液进行染色，载网经缓冲液润洗后自然干燥，透射电子显微镜下观察结构形貌。高分辨电镜表征 制样过程同 ，区别在于样品不经过醋酸铀染色处理，电镜低倍下找到电子密度大的纳米团簇后，逐步放大倍数直至纳米团簇出现高分辨晶格条纹。乙型肝炎病毒抗原抑制试验将 对 数 期 的 细 胞 用 消化后制成混悬液，计数并调节浓度后接种到 孔培养板中，待细胞长至 汇合，弃去上清，加入不同浓度的含药培养基，同时设拉米夫定阳性对照组（）和空白对照组，每个稀释度设 个复孔，继续培养。使用 和 诊断试剂盒，即乙型肝炎病毒 抗原检测试剂盒，测定 细胞培养上清中的 抗原含量，抗原抑制率（）（药物组 值 阴性对照组 值）。乙型肝炎病毒核酸复制抑制试验将 对 数 期 的 细 胞 用 消化后制成混悬液，计数并调节浓度后接种到 孔培养板中，待细胞长至 汇合，弃去上清，加入不同浓度的含药培养基，同时设拉米夫定阳性对照组和空白对照组，每个稀释度设 个复孔，继续培养 后，通过核酸提取试剂盒（）提取 培养上清和 细胞裂解产物的。利用 测定样本核酸中 含量，同时设定阳性对照（阳性标准品）和阴性对照（阴性标准品）。仿生纳米结构的细胞毒性试验将 对 数 期 的 细 胞 用 消化后制成混悬液，计数并调节浓度接种到 孔培养板中，待细胞长至 汇合，弃去上清，加入不同浓度的含药培养基，每个稀释度设 个复孔，同时设置 个细胞对照孔，继续培养 。使用 检测试剂盒（）测定药物的细胞毒性，细胞毒性（）（实验组 低对照组）（高对照组 低对照组）。结果 的表达经表达和纯化后的 经 鉴定，其条带位置与预期分子量一致。仿生纳米结构 的合成组装 在 值为 和 时，呈现出解聚和自 电子显微学报 第 卷组装的不同状态，在 值为 时，仿生催化还原反应持续发生，复染色样品通过透射电子显微镜，可以观察到不同 值下，笼型铁蛋白的结构形貌特征变化和纳米团簇在笼型铁蛋白空腔内合成（图）。图 笼型铁蛋白在不同 值下的结构形貌特征。在 时，铁蛋白呈现出解聚的结构状态，在 时，铁蛋白自组装成笼型结构，在 时，纳米团簇的合成持续发生。，随着金离子浓度增加及反应时间延长，仿生合成反应在亚铁氧化酶酶促中心上持续发生，笼型铁蛋白内部的金团簇逐渐长大，反应溶液颜色由浅黄色至暗红色变化（图），不经染色的样品于透射电镜下观察，尺径约 、的纳米团簇分别合成，且团簇具有较高的均一性（图）。在高分辨电镜下，纳米团簇呈现出典型的 晶格条纹（图），符合金团簇的高分辨电镜学特征。此外，由于金团簇具有荧光学效应，作者测量了不同尺径的 纳米结构的荧光光谱，、的 均有荧光发射光谱，其特征峰分别在、（图）。综合以上的实验结果，本文实现了不同尺径的金纳米团簇在笼型铁蛋白内部的可控仿生合成，所合成的不同尺径的 具有逐步红移的荧光效应。抗乙型肝炎病毒活性 为了验证合成的仿生纳米结构药物 的抗病毒效果，本文以 病毒为例，用 细胞系为模型，分别测试了 作用前后，细胞的 抗原分泌的变化，以及细胞内外 核酸复制的变化。首先，作者测试了不同尺径的 的作用效果，经实验测定，不同尺径的 均具有抑制 细胞 抗原分泌的效果，且抑制效果随金团簇尺径增加而提高，因此后续的抗病毒功效研究和细胞毒性测试均使用效果最好的 。接下来，作者测试了不同浓度的 抗病毒作用效果，经实验测定，纳米药物对 抗原分泌的抑制效果随药物浓度增加而提高（图，），纳米药物浓度为 时，对 抗原分泌的抑制率达到左右，接近或超出传统的核苷类抗病毒药物拉米夫定（）在 浓度时的 抗原抑制效果（图，）。进一步作者测试了 纳米药物对 细胞 核酸复制的作用，加入 后，细胞内外 核酸的复制显著降低，证明 可以抑制 核酸的复制；随之进一步用 作为氧化应激的刺激因子加入细胞系后，细胞内外的 核酸复制均增高了，证明刺激细胞氧化应激会导致 核酸复制增加，而当 纳米药物与 加入细胞系后，纳米药物能逆转 作为刺激因子引发的 核酸复制增高，在 纳米药物存在的情况下，能将刺激后的 细胞降低至接近正常无刺激情况下细胞 核酸复制的水平（图）。的安全性评价 纳米药物考虑用于生物体系的抗病毒治疗性的药物，前提是其必须具有良好的生物安全性。因此作者考察了 的细胞毒性，细胞毒性实验结果显示，在测试的 浓度 第 期袁 嫕等：笼型蛋白仿生纳米结构构建及抗病毒研究 图 纳米结构的合成及表征。不同纳米尺径的金团簇合成后，溶液的颜色变化；透射电镜下的纳米尺径表征；高分辨电子显微镜下金团簇的典型 晶格条纹；以及不同尺径的 展现出不同的荧光效应。，；范围内，各浓度梯度均没有产生细胞毒性，且随着纳米药物的浓度增加，细胞活力不但没有下降反而有所增高，加药组均高于对照组（图），原因可能与金团簇的抗氧化功能有关，可能降低了 细胞的本底氧化应激水平，从而使细胞活力处于更高的状态。讨论 根据从、以及近年爆发并仍在大流行的 疫情中吸取的经验教训，无有效治 电子显微学报 第 卷图 纳米药物抑制 抗原分泌和核酸复制的效果。，在较低浓度下，纳米药物即展现出抑制 抗原分泌的效果，且抑制效果与浓度成正相关（和）；具有较好的抑制 核酸复制的效果。，（）；图 纳米药物的细胞毒性测试。细胞毒性测试显示，纳米药物在各浓度下均没有产生细胞毒性，且加药组的细胞活力均高于未加药组。，疗药物的现状使得公共卫生体系在应对高致病性病毒大流行时十分脆弱。得益于近年来快速发展的纳米生物技术，为研发新的广谱型、高效低毒型抗病毒纳米药物提供了有力的技术支撑。纳米材料对不同种类病毒的杀伤具有无差别性，因此具有广谱抗病毒的潜力，本研究以笼型铁蛋白为载体仿生构建的 具有细胞内抗 核酸复制和抗原分泌的功效，仿生合成的纳米药物具有很高的 第 期袁 嫕等：笼型蛋白仿生纳米结构构建及抗病毒研究 生物兼容性，未发现有细胞毒性，相对传统抗病毒药物存在的较大副反应和易耐药性，本研究提出的新型抗病毒纳米药物策略具有较显著的优势；此外，笼型蛋白仿生纳米材料还具有的优势在于其蛋白结构表面易于重组和修饰，如荧光分子、靶向配体、抗原分子、药物等，因此能够作为一个可不断发展的层层组装型功能材料的平台；再次，的尺径稳定均一保持在 左右，纳米尺寸效应有利于纳米药物在生物体内的分布，特别是在渗漏组织、感染部位的富集程度将明显高于小分子抗病毒药物，有望在生物体内使用低剂量就能达到高效的抗病毒效应。这些优势使得本研究所提出的新型纳米药物策略在抗病毒领域具有很大的潜力和应用前景。本研究的实施，不仅进一步理解了人源笼形铁蛋白的自组装过程，实现了不同尺径的金纳米团簇在蛋白酶活性位点的可控合成，新的纳米药物展现出良好的抗病毒功效且未发现细胞毒性产生，本课题可进一步在广谱性、抗耐药性和器官靶向性等方面进行延伸性研究，最终为多种难治性、新发突发病毒病的防控和治疗提供新思路和新型药物储备。参考文献：，：，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：，：李祥，王晶，李兴华，等 异质结的构建及光催化性能研究 电子显微学报，（）：胡阳，朱柳，李红利，等 钴镍合金纳米颗粒的合成及孪晶结构形成机理的电镜原位研究 电子显微学报，（）：，：，（）：，：，：，（），（）：，（）：，（）：，：，（）：电子显微学报 第 卷 ，（，），；