柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析.pdf

基金项目:上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项青年项目(2 0 2 0 4 Y 0 2 1 0)通信作者:周艳秋,陈敏C o r r e spo n d e n c e t o:Z H O U Y a nqi u E m a i l:z h o uya nqi u s c d c.s h.c n;C H E N M i n E-m a i l:c h e n m i n s c d c.s h.c nd o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 3-6 1 8 4.2 0 2 3.0 2.0 0 4论著柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析李云逸1,杨玉颖1,崔心怡1,费洁2,仲文江3,李淑佩1,周艳秋1,陈敏11.上海市疾病预防控制中心,上海 2 0 0 3 3 6;2.上海市嘉定区疾病预防控制中心,上海2 0 1 8 0 0;3.上海市青浦区疾病预防控制中心,上海 2 0 1 7 9 9摘 要:为探讨上海市不同来源的柯萨奇病毒B组3型(c o x s a c k i e v i r u s B 3,C V B 3)菌株的循环动态变化及基因特征,本研究对分离自上海市环境污水、健康儿童和急性弛缓性麻痹(a c u t e f l a c c i d pa r a lys i s,A F P)病例中的C V B 3菌株进行V P 1区基因序列测定,并对照全球 C V B 3代表株进行序列相似性分析和系统发生学分析。结果显示,1 9 8 92 0 2 1年上海市不同来源的C V B 3分离株共有1 2 0株,属于D、E基因亚型。上海C V B 3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大,分别为7 8.7%1 0 0%和9 3.3%1 0 0.0%。2 0 1 6年首次从上海环境污水中分离到E基因亚型C V B 3,2 0 2 1年再次分离到该基因亚型。2 0 2 1年上海环境污水中的E基因亚型C V B 3分离株与2 0 2 0年的广东手足口病(h a n d,f o o t,a n d m o u t h d i s e a s e,H F MD)病例C V B 3分离株V P 1 区的核苷酸相似性较高,但上海暂未有该基因亚型感染病例报道。因此,仍须长期对环境污水和不同肠道病毒感染病例进行监测,以提高肠道病毒监测的敏感性,为肠道病毒相关疾病的诊疗提供数据支撑。关键词:柯萨奇病毒B组3型;环境污水监测;基因特征中图分类号:R 3 7 3 文献标识码:AG e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s o f c o x s a c k i e v i r u s B 3 s t r a i n s i s o l a t e d i n S h a n g h a iL I Y u nyi1,Y A N G Y uyi ng1,C U I X i nyi1,F E I J i e2,Z H O N G W e nji a ng3,L I S h upe i1,Z H O U Y a nqi u1,C H E N M i n11.S h a n g h a i M u n i c i p a l C e n t e r f o r D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n,S h a n g h a i 2 0 0 3 3 6,C h i n a;2.J i a d i n g D i s t r i c t C e n t e r f o r D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n,S h a n g h a i 2 0 1 8 0 0,C h i n a;3.Q i n g p u D i s t r i c t C e n t e r f o r D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n,S h a n g h a i 2 0 1 7 9 9,C h i n aA b s t r a c t:T o e xpl o r e t h e dyn a m i c c h a nge s a n d ge n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s o f c o x s a c k i e v i r u s B 3(C V B 3)i s o l a t e d f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s i n S h a ngh a i,t h e f u l l V P 1 s equ e n c e s o f C V B 3 i s o l a t e s f r o m e n v i r o n m e n t a l s e w age s u r v e i l l a n c e,h e a l t hy c h i l d r e n a n d a c u t e f l a c c i d pa r a lys i s(A F P)s u r v e i l l a n c e w e r e a mpl i f i e d a n d s equ e n c e d i n t h i s s t u dy.S i m i l a r i ty a n d phyl oge n e t i c a n a lys i s o f C V B 3 i s o l a t e s i n S h a ngh a i a n d gl o b a l r epr e s e n t a t i v e C V B 3 s t r a i n s w e r e pe r f o r m e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e 1 2 0 C V B 3 s t r a i n s i s o l a t e d f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s i n S h a ngh a i f r o m 1 9 8 9 t o 2 0 2 1,b e l o ngi ng t o D a n d E ge n o ty pe s.T h e s i m i l a r i t i e s o f n u c l e o t i d e a n d a m i n o a c i d o f S h a ngh a i C V B 3 i s o l a t e s w e r e f r o m 7 8.7%t o 1 0 0%a n d f r o m 9 3.3%t o 1 0 0.0%,r e spe c t i v e ly.I n 2 0 1 6,t h e ge n o ty pe E C V B 3 w a s f i r s t ly i s o l a t e d f r o m s e w age i n S h a ngh a i,a n d i t w a s i s o l a t e d aga i n i n 2 0 2 1.19微生物与感染 J o u r n a l of M i c r o b e s a n d I nfe c t i o n s,Apr i l 2 5,2 0 2 3,1 8(2):9 1-9 6 h t tp:jm i.f u d a n.e d u.c nT h e n u c l e o t i d e s o f ge n o ty pe E C V B 3 i s o l a t e s f r o m s e w age i n 2 0 2 1 w e r e s i m i l a r t o t h o s e o f C V B 3 i s o l a t e s f r o m h a n d,f o o t,a n d m o u t h d i s e a s e(H F MD)c a s e s i n G u a ngd o ng i n 2 0 2 0.B u t,S h a ngh a i h a s n o r epo r t e d i n f e c t i o n c a s e s o f ge n o ty pe E C V B 3.I t i s s t i l l n e c e s s a ry t o h a v e a l o ng-t e r m s u r v e i l l a n c e f o r s e w age a n d e n t e r o v i r u s c a s e s t o i mpr o v e t h e s e n s i t i v i ty o f e n t e r o v i r u s s u r v e i l l a n c e,a n d pr o v i d e d a t a s up po r t f o r t h e d i agn o s i s a n d t r e a t m e n t o f e n t e r o v i r u s-r e l a t e d d i s e a s e s.K e y w o r d s:C o x s a c k i e v i r u s B 3;E n v i r o n m e n t a l s e w age s u r v e i l l a n c e;G e n e t i c c h a r a c t e r i z a t i o n 柯萨奇病毒B组3型(c o x s a c k i e v i r u s B 3,C V B 3)是单股正链无包膜R N A病毒,属于小R N A病毒科(P i c o r n a v i r i d a e)肠道病毒属(E n t e r o v i r u s),在B组肠道病毒中常见。大多数C V B 3感染是无症 状 的,但 也 可 能 引 起 病 毒 性 心 肌 炎(v i r a l myo c a r d i t i s,VMC)、胰腺炎、无菌性脑膜炎(a s epi c m e n i ngi t i s,AM)、手 足 口 病(h a n d,f o o t,a n d m o u t h d i s e a s e,H F MD)等的暴发流行1-3。上海自2 0 1 2年启动脊髓灰质炎病毒环境污水监测网络以来,建立了肠道病毒数据库,对污水中的肠道病毒病原谱构成以及不同肠道病毒基因变异变迁规律进行了研究。环境污水中肠道病毒基因型别众多,不同的肠道病毒有不同的流行规律。C V B 3是环境污水中检出率较高的肠道病毒基因型。以往对C V B 3的研究主要围绕其引起的AM、VMC等相关疾病2,4-5。2 0 1 42 0 1 6年美国国家肠道病毒监测系统显示,C V B 3是引发肠道病毒感染的第5 位常见基因型别6。有文献报道,C V B 3也是除脊髓灰质炎病毒外导致急性弛缓性麻痹(a c u t e f l a c c i d pa r a lys i s,A F P)的病原体之一7-8。近年来,不少文献报道了由C V B 3导致的H F MD 暴发,其逐渐成为引起H F MD的主要病原体之一3,9。本研究通过探讨环境污水监测中的C V B 3分离株与实验室A F P病例和健康儿童肠道病毒监测中的C V B 3分离株的V P 1区基因特征,分析不同来源的C V B 3的循环动态变化,为上海市预警C V B 3引发的H F MD提供基础资料,为 C V B 3相关疾病的科学防控工作提供相关依据。1 材料与方法1.1 标本来源本研究所用标本主要来自2 0 1 22 0 2 1年的环境污水监测,部分来自1 9 8 92 0 2 1年的健康儿童肠道病毒监测和1 9 9 32 0 2 1年的A F P病例监测。污水样本采用阴离子膜吸附-超声波振荡法浓缩1 0。健康儿童和A F P病例的粪便标本按照世界卫生组织(W o r l d H e a l t h O rga n i z a t i o n,WH O)脊髓灰质炎实验室手册 中推荐的方法进行处理1 1。1.2 病毒分离与鉴定将处理好的污水浓缩液样本接种于人横纹肌肉瘤(h u m a n r h a b d o myo s a r c o m a,R D)细胞和人喉癌上皮细胞(h u m a n l a rynge a l c a r c i n o m a epi t h e l i a l c e l l,H ep-2)进行病毒分离培养,将处理好的健康儿童样本、A F P病例样本接种于R D细胞进行病毒分离。待样本产生细胞病变效应(cyt opa t h i c e f f e c t,C P E)时,收获病毒,冻存于-2 0,待检测。根据Q I A a mp V i r a l R N A M i n i K i t试剂盒(Q i age n;货号:5 2 9 0 4)说明书,从1 4 0 L阳性分离物中提取5 0 L病毒核酸。采用0 0 8-0 1 3、0 1 2-0 1 1通用肠道病毒引物1 2,将每份阳性分离物进行反转录-聚 合 酶 链 反 应(r e v e r s e t r a n s c r ipt i o n po lym e r a s e c h a i n r e a c t i o n,R T P C R)(T a K a R a;O n e-s t ep R N A P C R K i t 试剂盒;货号:R R 0 5 5 A)。将P C R产物用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,阳性产物委托生工(上海)股份有限公司进行测序。原始序列使用 S equ e n c h e r 5.4.5软件进行整理和拼接,与G e n B a n k 数据库中的肠道病毒参考株进行B L A S T比对分析,鉴定肠道病毒型别。1.3 C V B 3全长V P 1区序列测定和分析对于鉴定为C V B 3的病毒分离物,采用B组肠道病毒通用引物H E V B S 6 9 5/R 1 3 21 3和C V B 3特异性引物1 4进行R T-P C R,目的基因片段为9 0 0 bp 左右。电泳鉴定后,阳性产物委托生工(上海)股份有限公司进行测序。原始序列使用 S equ e n c h e r 5.4.5软件进行整理和拼接,通过软件M E G A 1 0.0.4运用最大似然法(m a x i m u m l i k e l i h o o d,ML)构建系统发育树,建树自展值(b o o t s t r ap)检验1 0 0 0次。2 结果2.1 C V B 3的分离鉴定本研究收集C V B 3毒株的时间跨度为1 9 8 929微生物与感染 J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,Apr i l 2 5,2 0 2 3,1 8(2):9 1-9 62 0 2 1年,共收集1 2 0株。其中7 2株来自2 0 1 22 0 2 1年的污水标本,4 1株来自1 9 8 92 0 2 1年的健康儿童粪便标本,7株来自1 9 9 32 0 2 1年的 A F P 病例粪便标本。环境污水标本中的C V B 3毒株分别于2 0 1 2、2 0 1 5、2 0 1 6和2 0 2 1年分离获得,主要集中于春夏季(57月)。健康儿童标本分别于2 0 0 4、2 0 0 5和2 0 0 8年出现C V B 3毒株分离高峰(见图1)。2.2 C V B 3的相似性分析1 2 0株不同来源的C V B 3分离株中,有1 0 8株获得V P 1全长序列(其中环境污水分离株7 0株、健康儿童分离株3 2株、A F P病例分离株6株)。C V B 3的V P 1全长为8 5 2个核苷酸,共编码2 8 4个氨基酸。采用B i o e d i t软件对1 0 8条C V B 3序列进行相似性分析,结果显示,1 9 8 92 0 2 1年C V B 3分离株的核苷酸和氨基酸相似性差异较大,分别为7 8.7%1 0 0%和9 3.3%1 0 0.0%;与C V B 3原型株N a n cy核苷酸和氨基酸的相似性分别为7 7.3%8 0.6%和9 4%9 7.1%。2.3 遗传进化分析为了 解 上 海C V B 3的 系 统 进 化 特 征,从G e n B a n k中下载2 8 9条1 9 5 62 0 2 0年1 3个国家的C V B 3分离株V P 1(8 5 2 bp)编码区序列(截至2 0 2 2年8月2 8日)(其中H F MD病例7 8条、A F P病例2 3条、AM病例9条、健康儿童6条、污水1 3条)。删除高度同源序列,挑选有时间和地域代表性的C V B 3,本研究共纳入1 1 5株C V B 3的V P 1编码区序列(包括5 0条上海分离株和6 5条其他国家和我国其他省份的分离株),使用ML法构建系统发育树(见图2)。以V P 1区基因亚型1 5%核苷酸差异为分型标准1 5,C V B 3的进化树分为AE 5个基因亚型,核苷酸差异 1 5%(1 5.6%2 1.8%)。本研究中上海不同来源的C V B 3分离株分别属于D、E 基因亚型。原型株N a n cy(G e n B a n k号:M 1 6 5 7 2)属于A基因亚型。D基因亚型主要由中国、泰国、日本、俄罗斯、法国株组成。我国大部分C V B 3株聚集在D基因亚型,时间跨度为1 9 8 92 0 2 0年,可分成3个分支(l i n e age 1、l i n e age 2、l i n e age 3)。l i n e age 1(绿色分支)主要为1 9 8 92 0 0 8年的C V B 3分离株,上海1 9 8 92 0 0 1年健康儿童和A F P病例的C V B 3分离株均位于l i n e age 1。近1 0多年来没有l i n e age 1 C V B 3相关序列信息,表明该分支已不是优势型别。从2 0 0 4年开始,l i n e age 2(蓝色分支)的C V B 3分离株逐渐替代l i n e age 1。D基因亚型的l i n e age 2(蓝色分支)和l i n e age 3(红色分支)包括了上海2 0 0 42 0 2 0年健康儿童、2 0 1 5年A F P病例和2 0 1 22 0 1 6年环境污水(除2 0 1 6年1株外)中的C V B 3分离株。目前,D基因亚型的l i n e age 2和l i n e age 3分支交替流行,成为优势型别。上海E基因亚型的C V B 3分离株从2 0 1 6年7月的嘉定区污水样本中获得,随后4年从环境污水中均未分离到C V B 3。2 0 2 1年27月在嘉定区和青浦区污水厂连续分离到E基因亚型C V B 3,提示E基因亚型C V B 3处于活跃期。上海E基因亚型C V B 3与欧美、澳大利亚、广东H F MD分离株聚为一簇。2 0 1 6年的H J 7 7 7-C V B 3分离株与2 0 2 1年污水C V B 3分离株的核苷酸存在一定差异(9.3%9.6%),与N S W-V 2 5/A U S/2 0 1 5澳 大 利 亚 株(G e n B a n k号:M F 6 7 8 3 1 4)核苷酸的相似性较高(9 3.5%),提示2 0 1 6年后的5年内E基因亚型C V B 3不 断 在 进 化 变 异。上 海2 0 2 1年 的 污 水C V B 3分离株与2株广东H F MD株(G e n B a n k号:O K 6 4 3 8 7 7、O K 6 4 3 8 8 2)的 相 似 性 高 达9 7.8%9 9.5%。图1 1 9 8 92 0 2 1年上海市C V B 3分离情况F i g.1 I s o l a t i o n o f C V B 3 i n S h a n g h a i d u r i n g 1 9 8 9 a n d 2 0 2 139李云逸,等:柯萨奇病毒B组3型上海分离株的基因特征分析N o t e s:S h a ngh a i C V B 3 i s o l a t e s w e r e m a r k e d r e d.m e a n s C V B 3 s t r a i n s f r o m AM c a s e s;m e a n s C V B 3 s t r a i n s f r o m A F P c a s e s;m e a n s C V B 3 s t r a i n s f r o m H F MD c a s e s;m e a n s C V B 3 s t r a i n s f r o m h e a l t hy c h i l d r e n;m e a n s C V B 3 s t r a i n s f r o m s e w age.图2 C V B 3上海分离株与各基因型代表株完整 V P 1序列的系统进化树F i g.2 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s b a s e d o n c o m p l e t e V P 1 r e g i o n s o f C V B 3 i s o l a t e s i n S h a n g h a i a n d e a c h r e p r e s e n t a t i v e C V B 3 s t r a i n3 讨论本研究中,C V B 3分离株出现的时间分布显示由于入选的上海市 A F P病例和健康儿童基数太小,故流行周期不明显。2 0 1 22 0 2 1年环境污水监测中C V B 3分离株的流行周期为35年,分离株高峰集中于春夏季,与H F MD监测系统中贵州省和广东省的C V B 3流行周期较为一致,但江苏省和山东省AM监测系统中C V B 3呈现持续流行的特点9,1 6。由于监测系统口径不一致,C V B 3的流行特点还有待进一步研究,这提示建立完善的肠道病毒监测系统有助于充分了解C V B 3等肠道病毒的传播动态。目前,我国大陆地区C V B 3 优势基因型为 D 基因亚型,分为3个分支,每个分支内均显示上海不同来源的毒株间亲缘关系较近。近年来交替流行的49微生物与感染 J o u r n a l o f M i c r o b e s a n d I n f e c t i o n s,Apr i l 2 5,2 0 2 3,1 8(2):9 1-9 6l i n e age 2和l i n e age 3分支内,2 0 1 2、2 0 1 5和2 0 1 6年上海污水C V B 3分离株与2 0 1 12 0 1 7年广东、山东、浙江等多个省份AM病例和H F MD病例分离株的亲缘关系较近。山东省和广东省的长期环境污水监测结果显示,C V B 3是污水中检出率较高的肠道病毒1 7-1 8,表明C V B 3在环境和人群中的隐性循环已有较长时间,C V B 3感染临床病例与当地生活污水中的 C V B 3分离株密切相关。目前,上海尚缺乏C V B 3引起H F MD的相关文献和资料,须加强对C V B 3引起H F MD的监测和基础研究,以应对可能的暴发。E 基因亚型C V B 3在全球范围内分布广泛,但在2 0 2 0年之前我国未有其数据报道,推测此亚型在我国不是优势基因型别。杨倩等1 9首次报道在2 0 2 0年广东省H F MD监测中发现了输入性E基因亚型C V B 3分离株的流行。本研究也显示,早在2 0 1 6年就从上海污水中分离到了并不是优势型别的E基因亚型C V B 3,其后5年未再分离到,直到2 0 2 1年再次分离到E基因亚型C V B 3,但未分离到D基因亚型C V B 3。因此,与过去9年流行的基因亚型不同,该输入性E基因亚型C V B 3可能在我国逐渐成为新的优势基因型别。目前,尚未有文献报道E 基因亚型C V B 3引起的上海H F MD病例。受肠道病毒感染的个体无论有无临床症状,均会通过粪便持续3 4周向外环境排出病毒,病毒颗粒在外环境中可存活一定时间,并保持感染性。相关部门通过定期监测环境污水中的肠道病毒型别变化和基因特征,可了解人群中的肠道病毒病原谱和动态循环变化。WH O在全球脊髓灰质炎消灭计划(G l o b a l P o l i o E r a d i c a t i o n I n i t i a t i v e,G P E I)中提出,将环境污水监测作为A F P病例监测的一种补充方法2 0。多项研究表明2 1-2 2,环境污水监测中的肠道病毒与病例监测中的肠道病毒密切相关。引发H F MD的主要病原体具有多变性和交替性,除了熟知的肠道病毒 A 组 7 1型(e n t e r o v i r u s A 7 1,E V-A 7 1)和柯萨奇病毒 A组1 6 型(c o x s a c k i e v i r u s A 1 6,C V-A 1 6)外,其他多种肠道病毒也逐渐成为引发国内H F MD的优势基因型3,2 3,但研究C V B 3引发H F MD的报道尚不多。因此,持续对环境污水进行监测,可为上海市肠道病毒相关传染病预防和控制提供数据支撑。参考文献1 F a i r w e a t h e r D,S t a f f o r d K A,S u ng Y K.Upd a t e o n c o x s a c k i e v i r u s B 3 myo c a r d i t i s J.C u r r Opi n R h e u m a t o l,2 0 1 2,2 4(4):4 0 1-4 0 7.2 K u m a r A,S h u k l a D,K u m a r R,I d r i s MZ,J a u h a r i P,S r i v a s t a v a S,D h o l e T N.M o l e c u l a r i d e n t i f i c a t i o n o f e n t e r o v i r u s e s a s s o c i a t e d w i t h a s ept i c m e n i ngi t i s i n c h i l d r e n f r o m I n d i a J.A r c h V i r o l,2 0 1 3,1 5 8(1):2 1 1-2 1 5.3 H a n Z,Z h a ng Y,H u a ng K,W a ng J,T i a n H,S o ng Y,Y a ng Q,Y a n D,Z h u S,Y a o M,W a ng X,X u W.T w o C o x s a c k i e v i r u s B 3 o u t b r e a k s a s s o c i a t e d w i t h h a n d,f o o t,a n d m o u t h d i s e a s e i n C h i n a a n d t h e e v o l u t i o n a ry h i s t o ry w o r l d w i d e J.B M C I n f e c t D i s,2 0 1 9,1 9(1):4 6 6.d o i:1 0.1 1 8 6/s 1 2 8 7 9-0 1 9-4 1 0 7-z.4 W o ng A H,L a u C S,C h e ng P K,Ng A Y,L i m WW.C o x s a c k i e v i r u s B 3-a s s o c i a t e d a s ept i c m e n i ngi t i s:a n e m e rgi ng i n f e c t i o n i n H o ng K o ng J.J M e d V i r o l,2 0 1 1,8 3(3):4 8 3-4 8 9.5 W u Z,D u 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