抗菌肽复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼生物胺的控制及品质的影响.pdf

食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究基金项目：浙江省科技项目（202302B00479）作者简介：韩璐（1996），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品加工与安全。*通信作者：谢超，副教授，博士，研究方向：水产品质量与安全。DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.20.00抗菌肽复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼生物胺的控制及品质的影响韩璐1，谢超1*，李娜2，周华2（1.浙江海洋大学 食品与药学学院，浙江 舟山 316000；2.舟山市福瑞达食品有限公司，浙江 舟山316000）摘要：为探究抗菌肽复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼加工过程中生物胺的抑制效果，评价其对秘鲁鱿鱼加工过程中品质的影响，该研究选取牡蛎源抗菌肽（oyster antimicrobial peptide，OAP）、海蟹源抗菌肽（crab antimicrobial peptide，CAP）和带鱼源抗菌肽（hairtail antimicrobial peptide，HAP）进行单因素试验，分析 3 种水产蛋白抗菌肽对生物胺的抑制效果；通过正交优化试验调配出复合保鲜抑制剂的最佳浓度比；验证试验以挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、菌落总数及多种生物胺含量为指标，评价其对秘鲁鱿鱼品质的影响。试验结果表明，3 种水产蛋白抗菌肽均能有效抑制生物胺的生成。正交优化试验得到复合保鲜抑制剂的最佳浓度比为 231，其对组胺的抑制率为74.39%。应用该复合保鲜抑制剂后，试验组生物胺含量均低于对照组，证明复合保鲜抑制剂可有效抑制生物胺的生成；第 10天时试验组 TVB-N 值为 17.87 mg/100 g，仅为对照组的 47.85%，证明复合保鲜抑制剂对样品中 TVB-N 产生明显的抑制作用；第 10 天时复合保鲜抑制剂对菌落总数的抑制率达到 33.02%。研究结果表明，抗菌肽复合保鲜抑制剂对生物胺的生成有抑制作用，有利于鱿鱼的品质控制。关键词：秘鲁鱿鱼；生物胺；组胺；抗菌活性肽；品质变化Effects of Antimicrobial Peptide Composite Preservative on the Control of Biogenic Amines and Qualityof Dosidicus gigasHAN Lu1，XIE Chao1*，LI Na2，ZHOU Hua2（1.School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，Zhejiang，China；2.ZhoushanFuruida Food Co.，Ltd.，Zhoushan 316000，Zhejiang，China）Abstract：The effect of antimicrobial peptide composite preservative on the production of biogenic amines during the processing of Dosidicus gigas was examined.The inhibitory effects of oyster antimicrobial peptide（OAP），crab antimicrobial peptide（CAP），and hairtail antimicrobial peptide（HAP）on biogenic amines wereanalyzed by single factor tests.The optimal concentration ratio of the three antimicrobial peptides in the composite preservative was determined by orthogonal design.With total volatile basic nitrogen（TVB-N），total numberof colonies，and content of biogenic amines as indicators，the effect of the composite preservative on the qualityof processed D.gigas was evaluated.The results showed that the three antimicrobial peptides inhibited the production of biogenic amines.The optimal concentration ratio was determined as 231 for the composite preservative，which inhibited histamine by 74.39%.After the application of this composite preservative，the biogenicamine content of the test group was lower than that of the control group，which proved that this composite preservative could effectively inhibit the production of biogenic amines.On day 10，the group with application of thecomposite preservative showed the TVB-N of 17.87 mg/100 g，which was only 47.85%of that of the controlgroup，proving that the composite preservative had a significant inhibitory effect on TVB-N in the samples.Thecomposite preservative inhibited 33.02%of the total number of colonies on day 10.The results demonstrated thatantimicrobial peptide composite preservative inhibited the production of biogenic amines and facilitated thequality control during the processing of D.gigas.17食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究Key words：Dosidicus gigas；biogenic amines；histamine；antimicrobial peptides；quality change引文格式：韩璐，谢超，李娜，等.抗菌肽复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼生物胺的控制及品质的影响J.食品研究与开发，2023，44（20）：17-24.HAN Lu，XIE Chao，LI Na，et al.Effects of Antimicrobial Peptide Composite Preservative on the Control of Biogenic Aminesand Quality of Dosidicus gigasJ.Food Research and Development，2023，44（20）：17-24.生物胺（biogenicamine，BA）是一类具有生物活性且含有氨基的有机化合物的总称1-2，广泛存在于蛋白质含量较高的水产食品中3。在水产品体内微生物中酶的作用下，水产品会发生腐败变质，在此过程中生成大量生物胺，人体摄入过量生物胺易引发中毒。在水产品腐败变质过程中尸胺、腐胺、组胺和酪胺为主要生成的 4 种生物胺4，因此，本文选取尸胺、腐胺、组胺和酪胺作为评价抗菌肽对生物胺控制的指标，通过观察 4 种生物胺含量的变化，分析生物胺的生成和水产品腐败变质的程度。秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）是茎柔鱼的俗称，生长速度快5、体型较大、颜色偏白、肉质细腻、营养丰富，是一种高蛋白、低脂肪、低胆固醇的美味食品，且价格低廉，适合作为食品加工的原料。秘鲁鱿鱼含有丰富的氨基酸和蛋白质6-7，极易在贮藏和运输过程中受微生物的影响产生大量生物胺，从而导致生物胺中毒。生物胺的前体物质一般是氨基酸，生物胺主要是由游离的氨基酸经微生物的脱羧作用或经氨基酸脱羧酶脱羧产生8。组胺是由组氨酸脱羧酶对组氨酸脱羧作用后产生的一种生物胺，在水产品中毒性最强，因此可选取组胺为评价指标9-10。抗菌肽是一种小分子多肽，在动物的非特异性免疫中起着重要的免疫抗菌作用11-14，且在水产品中大多具有免疫、广谱抗菌作用15，可用作真菌、细菌和寄生虫等的抑制剂16。目前国内外有关秘鲁鱿鱼的研究主要集中在蛋白质氧化程度和抗氧化肽方面17-20，对其加工过程的产胺菌、生物胺的生成以及抗菌肽的研究较少21，关于抑制秘鲁鱿鱼体内生物胺的生成和对鱿鱼的品质控制的研究鲜有报道。因此本文选取秘鲁鱿鱼为研究对象，进行海蟹源抗菌肽22、牡蛎源抗菌肽和带鱼源抗菌肽作为单一生物胺抑制剂的单因素试验并调配复合保鲜抑制剂，通过正交优化试验得到其最优浓度比。验证该复合保鲜抑制剂对以组胺为代表的生物胺的影响，评价该复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼品质控制的能力，以期为秘鲁鱿鱼在贮藏加工中安全质量的监控提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂秘鲁鱿鱼：舟山市福瑞达食品有限公司，在无菌条件下，将鱼切开，依次去内脏团、去头、去皮、洗净、沥尽水分备用。腐胺二盐酸盐、尸胺、组胺二盐酸盐、酪胺盐酸盐标准品（纯度均99.0%）：德国 Dr Ehrenstorfer公司；海蟹源抗菌肽（crab antibacterial peptide，CAP）、牡蛎源抗菌肽（oyster antibacterial peptide，OAP）、带鱼源抗菌肽（hairtail antibacterial peptide，HAP）：舟山市常青海洋食品有限公司。1.2仪器与设备电子天平（FA2004）：上海精密科学仪器有限公司；冷柜（BC/BD-829HN）：青岛海尔股份有限公司；高速冷冻离心机（BR4i）：法国 Jouan 公司；高速均质器（T18 生物胺 ic 型）：德国 IKA 公司；全自动凯氏定氮仪（HGK-57）：上海赫冠仪器有限公司；高速组织捣碎机（DS-1 型）：上海标本模型厂；超纯水系统（Milli-QELIX51 型）：美国 Millipore 公司。1.3方法1.3.1单因素试验设计考察 3 种水产蛋白抗菌肽（OAP、CAP 和 HAP）对秘鲁鱿鱼中 4 种生物胺含量的影响。3 种水产蛋白抗菌肽的浓度设定均为 1%、2%、3%，每个水平设 3 个重复。1.3.23 种水产蛋白抗菌肽溶液的配制试验选取 3 种水产蛋白抗菌肽（OAP、CAP 和HAP）作为生物胺抑制剂，以秘鲁鱿鱼为研究对象，根据倪佳丹等23、黄明焜等24的方法配制 3 种生物胺抑制剂溶液，稍作修改，探究 3 种生物胺抑制剂溶液对水产品生物胺的抑制效果。分别称取 1、2、3g 的 OAP、CAP和 HAP 并将 9 组抑制剂加入超纯水定容至 100 mL，混匀后即得到浓度为 1%、2%、3%的 3 种溶液。将以上配制好的溶液，置于 4 条件下备用。1.3.3正交试验在单因素试验的基础上，正交试验以秘鲁鱿鱼为研究对象，选用 3 种水产蛋白抗菌肽为生物胺抑制剂，以 3 种抗菌肽抑制剂浓度为自变量，鱼肉样品在 4 下贮藏 6 d 后对组胺的抑制率为响应值，评价各因素对生物胺的抑制作用，设计三因素三水平的正交试验，因素与水平见表 1。1.3.4组胺抑制率的计算根据测定出的组胺含量，计算组胺抑制率，评价18食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究图 1牡蛎源抗菌肽对 4 种生物胺含量的影响Fig.1Effects of oyster antimicrobial peptides on four biogenic amines content复合保鲜剂对组胺的抑制作用，其中抑制率（Y，%）按下式计算。Y=（X对照-X试验）/X对照100式中：X对照为对照组组胺含量，mg/kg；X试验为试验组组胺含量，mg/kg。1.3.5验证试验将试验组（即 200 g 样品+10 mL 复合保鲜抑制剂，用干净玻璃棒充分搅拌混合均匀）的鱼肉浆液和对照组（200 g 样品+10 mL 超纯水）的鱼肉浆液，分装后置于 4 条件下贮藏，测定各组样品的组胺含量。1.3.6挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值的测定利用半微量定氮法测定 TVB-N 值。取 10 g 秘鲁鱿鱼肉剪碎，移至消化管，加入 1.0 g 氧化酶，加少许蒸馏水摇匀，采用凯氏定氮仪进行 TVB-N 值的测定。1.3.7菌落总数的测定参考 GB 4789.22016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定25中的方法，采用平板计数法测定菌落总数，结果以 lg（CFU/g）表示。1.3.8菌落总数抑制率的计算根据测定出的菌落总数，计算菌落总数抑制率，评价复合保鲜剂对菌落总数的抑制作用，其中抑制率（A，%）按下式计算。A=（B对照-B试验）/B对照100式中：B对照为对照组菌落总数，lg（CFU/g）；B试验为试验组菌落总数，lg（CFU/g）。1.4数据处理所有试验均重复 3 次。获得的数据采用 Excel2013 与 SPSS 18.0 进行统计分析，结果以平均值标准差表示。2结果与讨论2.1抗菌肽对秘鲁鱿鱼体内多种生物胺的影响2.1.1牡蛎源抗菌肽对生物胺的影响牡蛎源抗菌肽对生物胺的影响见图 1。表 1正交试验因素与水平Table 1Factors and levels of orthogonal test水平因素A牡蛎源抗菌肽浓度/%B海蟹源抗菌肽浓度/%C带鱼源抗菌肽浓度/%11.001.001.0022.002.002.0033.003.003.00由图 1 可知，随着贮藏时间的延长，对照组与 3 组试验组的鱼肉中 4 种生物胺含量均呈上升趋势。经OAP 处理后的鱼肉中 4 种生物胺含量整体上均低于对照组，且 2%OAP 作用下的鱼肉中 4 种生物胺含量均低于 1%和 3%OAP 作用下的含量，由此推断 2%OAP 抑制效果最佳，可能是由于 3%OAP 对鱼肉的结构造成了破坏，导致了 OAP 浓度为 3%时比浓度为 2%时更容易产生生物胺。36FUNHLHUB:KE&3010101F6FUNHLHUB:KE&301010166FUNHLHUB:KE&30101016FUNHLHUB:KE&301010119食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究36FUNHLHUB:KE&3$1$1$1F6FUNHLHUB:KE66FUNHLHUB:KE&3$1$1$16FUNHLHUB:KE&3$1$1$1&3$1$1$136FUNHLHUB:KE&3)1)1)1F6FUNHLHUB:KE66FUNHLHUB:KE&3)1)1)16FUNHLHUB:KE&3)1)1)1&3)1)1)12.1.2海蟹源抗菌肽对生物胺的影响海蟹源抗菌肽对生物胺的影响见图 2。由图 2 可知，在 02 d 内 4 种生物胺含量变化较小，可能是由于初期样品中的微生物基数较小且游离氨基酸较少，从而产生的生物胺含量较低。经 3%CAP处理后的秘鲁鱿鱼肉中 4 种生物胺含量最低，由此推断，3%CAP 的抑制作用更强。在整个贮藏期间对照组的 4 种生物胺含量均高于试验组，是由于抗菌肽具有免疫、广谱抗菌作用，可以有效阻止微生物中酶的作用，从而抑制秘鲁鱿鱼肉中生物胺的生成。因此，再次证实 CAP 可有效抑制生物胺的生成。2.1.3带鱼源抗菌肽对生物胺的影响带鱼源抗菌肽对生物胺的影响见图 3。由图 3 可知，随着贮藏时间的延长，对照组与 3 组图 2海蟹源抗菌肽对 4 种生物胺含量的影响Fig.2Effects of crab antimicrobial peptides on four biogenic amines content图 3带鱼源抗菌肽对 4 种生物胺含量的影响Fig.3Effects of hairtail antimicrobial peptides on four biogenic amines content20食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究试验组的鱼肉中 4 种生物胺含量均呈上升趋势，且在第 2 天后试验组的 4 种生物胺含量均低于对照组，表明 HAP 对生物胺的生成起到了有效的抑制作用。第 2天后 3 种浓度的 HAP 处理后的秘鲁鱿鱼肉中 4 种生物胺含量接近，推测 3 种浓度的 HAP 对 4 种生物胺的抑制效果相似。2.2复配保鲜抑制剂正交优化试验在前期单因素试验的基础上，进一步研究 3 种水产蛋白抗菌肽对秘鲁鱿鱼肉中生物胺的综合抑制作用。选用上述 3 种水产蛋白抗菌肽调配复合保鲜抑制剂，按其添加剂量不同将其分为 9 组复合保鲜抑制剂，对牡蛎源抗菌肽、海蟹源抗菌肽及带鱼源抗菌肽的添加水平设计三因素三水平正交试验，通过正交优化试验得出在 4 条件下贮藏 6 d 后，各水平的样品中组胺含量和组胺抑制率 对照组组胺含量为（57.871.89）mg/kg，结果见表 2。由表 2 可知，在应用复合保鲜抑制剂后第 6 组的组胺含量最低，且对组胺抑制率可达 74.40%，因此第6 组对组胺抑制效果最优。结合 R 值的大小对比可知，牡蛎源抗菌肽是最优因素，其次是海蟹源抗菌肽和带鱼源抗菌肽。结合各因素的最佳水平可知，A 为 2%、B为 3%、C 为 1%时最优。因此再次证实第 6 组复合保鲜抑制剂为最优组合，即牡蛎源抗菌肽、海蟹类抗菌肽和带鱼源抗菌肽的浓度分别为 2%、3%、1%，由此得出该试验配制的复合保鲜抑制剂的最佳浓度比为 231。2.3验证试验通过对正交优化试验结果的分析，优化浓度比后制得复合保鲜抑制剂。样品贮藏过程中复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼组胺的抑制率见表 3。由表 3 可知，在贮藏第 6 天时，复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼肉样品的组胺抑制率可以达到 74.39%。但随着贮藏时间的延长，复合保鲜剂对组胺的抑制效果有所下降，贮藏第 10 天时，抑制率下降到 57.36%。由此推断，虽然随着贮藏时间的延长复合保鲜剂对组胺的抑制率有所下降，但对组胺仍有较强的抑制作用。2.4复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中品质指标变化的影响2.4.1复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中生物胺含量变化的影响复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中生物胺含量变化的影响见图 4。由图 4 可知，两组样品在 04 d 时 3 种生物胺含量变化较小，可能是由于初期样品中的微生物基数较小且游离氨基酸较少，使得产生的生物胺含量较低。表 3复合保鲜抑制剂对组胺含量变化的影响Table 3Effects of composite preservatives on histamine content贮藏时间/d组胺含量/（mg/kg)组胺抑制率/%对照组试验组036.741.7536.311.64243.661.4021.850.7649.951.73447.373.7614.102.6770.235.63657.784.4214.800.7474.392.28879.8810.921.391.4173.221.761097.7723.341.696.6557.366.84表 2正交试验结果与极差分析Table 2Results and range analysis of orthogonal test序号ABC组胺含量/（mg/kg）组胺抑制率/%11.001.003.0023.7558.9621.002.002.0018.4068.1731.003.001.0017.9568.9842.001.003.0017.5269.7252.002.002.0014.9774.1362.003.001.0014.8174.4073.001.003.0017.9469.0083.002.001.0017.9069.0793.003.002.0017.5869.62K137.817 38.130 40.980K242.100 40.757 40.867K340.063 41.090 38.130极差 R4.2832.9602.850因素主次 ABC较优搭配 A2B3C1注：表示未应用复合保鲜抑制，对组胺尚未起到抑制作用。F6FUNHLHUB:KE66FUNHLHUB:KE&3AO36FUNHLHUB:KE&3AO3&3AO321食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究图 4秘鲁鱿鱼的生物胺含量变化Fig.4Changes in biogenic amine content of Dosidicus gigasF6FUNHLHUB:KE66FUNHLHUB:KE&3AO36FUNHLHUB:KE&3AO3&3AO3经复合保鲜抑制剂处理后，试验组的 3 种生物胺含量均低于对照组，可能是因为随着贮藏时间的延长，微生物逐渐增多，且游离的氨基酸在脱羧酶的作用下生成生物胺。腐胺由鸟氨酸脱羧酶作用产生，因此推测具有鸟氨酸脱羧酶的微生物繁殖较快，试验组在抑制剂处理后阻碍了微生物生长，极大程度抑制了腐胺的产生。综上，复合保鲜抑制剂处理后的样品抑制了 3 种生物胺的生成，从而延缓了鱼体的腐败时间，降低了鱼体的腐败程度，有利于秘鲁鱿鱼的品质控制。2.4.2复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中 TVB-N 值变化的影响复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中 TVB-N值变化的影响见图 5。由图 5 可知，随着贮藏时间的延长，TVB-N 值逐渐升高，是由于鱼的脂肪等物质不断氧化，在微生物的作用下，产生碱性物质。TVB-N 值升高意味着鱼体在微生物的作用下正处于腐败变质过程。经复合保鲜剂处理后的试验组，由于其微生物的繁殖受到限制，产生的碱性代谢产物也相对较少，因此 TVB-N 值较低26-27。结果表明，在贮藏第 10 天时试验组 TVB-N 值为 17.87 mg/100 g，仅为对照组的 47.85%，证明该复合保鲜抑制剂对样品中 TVB-N 值产生了明显的抑制作用，有利于秘鲁鱿鱼的品质控制。2.4.3复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中菌落总数变化的影响复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼贮藏过程中菌落总数变化的影响见图 6。由图 6 可知，随着贮藏时间的延长，对照组与试验组的菌落总数均呈上升趋势，且试验组的菌落总数均低于对照组，由此可见复合保鲜抑制剂具有一定的抑菌作用。贮藏第 10 天时，复合保鲜抑制剂对菌落总数抑制率达到了 33.02%，有很好的抑菌效果。对照组与试验组进行对比，结果显示试验组的微生物数量增加更缓慢。因此，再次证实复合保鲜抑制剂对微生物的生长有明显的抑制作用28-29。3结论本试验以秘鲁鱿鱼为试验对象，以牡蛎源抗菌肽、海蟹源抗菌肽和带鱼源抗菌肽作为单一生物胺抑制剂，进行单因素试验，并将 3 种水产蛋白抗菌肽配制成复合保鲜抑制剂进行三因素三水平的正交优化试验及验证试验，优化了复合保鲜抑制剂的最佳浓度比并分析其对组胺的抑制效果，通过观察 TVB-N 值、菌落总数及多种生物胺含量的变化，评价贮藏期间该复合保鲜抑制剂对鱿鱼品质的影响。试验结果表明，3 种水产蛋白抗菌肽均能够有效减缓鱿鱼体内生物胺的形成，对生物胺有明显的抑制作用；正交试验优化了复合保鲜抑制剂的最佳浓度比为 231；验证试验表明到贮藏第 6 天时对组胺的抑制率为 74.39%，第 10天时下降到 57.36%，虽然随着贮藏时间的延长对组胺的抑制率有所下降，但是复合保鲜剂对组胺仍有较强的抑制作用。试验组的样品在贮藏过程中 TVB-N 值显著低于对照组，且在贮藏第 10 天时试验组 TVB-N 值为17.87 mg/100 g，仅为对照组的 47.85%，表明试验组对TVB-N 值的升高产生了明显的抑制作用，说明该复合保鲜抑制剂有利于延缓鱿鱼品质的劣变；贮藏第 10 天时复合保鲜抑制剂对菌落总数的抑制率达到了33.02%。研究结果表明，该复合保鲜抑制剂不仅有效89B:KE&3AO3图 5秘鲁鱿鱼 TVB-N 值的变化Fig.5Changes in total volatile basic nitrogen of Dosidicus gigas图 6秘鲁鱿鱼的菌落总数变化Fig.6Changes in the total number of colonies of Dosidicus gigas57#/UNHHUB:KE&3AO322食品研究与开发23 年 10 月第 44 卷第 20 期基础研究抑制了生物胺的生成，还有利于鱿鱼品质的控制。本试验通过抗菌肽复合保鲜抑制剂对秘鲁鱿鱼生物胺的控制及品质的影响进行初步分析，可为秘鲁鱿鱼贮藏期内的保鲜提供基础的理论依据。参考文献：1WANG J M,JIN G F,ZHANG W G,et al.Effect of curing salt content on lipid oxidation and volatile flavour compounds of dry-curedTurkeyhamJ.LWT-FoodScienceandTechnology,2012,48(1):102-106.2刘红,李传勇,曾志杰,等.水产品中生物胺的检测与控制技术研究进展J.食品安全质量检测学报,2015,6(11):4516-4523.LIU Hong,LI Chuanyong,ZENG Zhijie,et al.Research progress onthe determination methods and control technology of biogenicamines in seafoodJ.Journal of Food Safety&Quality,2015,6(11):4516-4523.3杨姗姗,王晓雯,林翠苹.水产品中生物胺的研究进展J.青岛农业大学学报(自然科学版),2021,38(1):65-73.YANG Shanshan,WANG Xiaowen,LIN 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