口腔厌氧菌的日常培养.pdf

科技视界Science&Technology Vision33科学课堂SCIENCE CLASSROOM 科普介绍口腔健康是提高生活质量的关键，也是守护全身健康的大门。其中牙周疾病和牙髓病是最常见的口腔感染性疾病，两种疾病与厌氧菌相关，厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，口腔部位腔隙较多，更利于厌氧菌生长。临床工作中，鉴定口腔中细菌并做药敏实验，防止抗生素滥用对于缺乏先进细菌培养仪器的基层医疗机构是极其困难的，因此，利用简便的仪器培养口腔厌氧菌选择合适的抗生素用于口腔疾病的预防和治疗是必要的。引言牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌是口腔厌氧菌的典型代表，其中牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性厌氧菌，被认为是主要的牙周病原菌1。侵入性牙龈卟啉单胞菌具有大量侵入牙周组织和避免免疫清除的特性，例如黏附宿主细胞的菌毛、用于降解细胞外基质的蛋白酶（即牙龈蛋白酶）和引发大量免疫反应的脂多糖。由于厌氧菌对于定植环境较为挑剔，因此临床上厌氧菌很难分离出来，而且分离后如果不能及时在特定环境下培养，失败率较高，而临床上一旦延迟实施适当的治疗可能会导致失败。厌氧菌在有氧的情况下不能生长，如果要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。通常可以在普通培养基中加入还原剂，或用物理、化学的方法去除普通培养环境中的游离氧，以此降低氧化还原电势，主要有疱肉、硫基乙酸钠，牛心脑浸液等培养基2。厌氧菌培养方法有许多，但每种方法均有其利弊。因此，掌握厌氧菌的分离、运输和培养方法对于口腔医生临床与科研均有好处。本文主要对口腔厌氧菌的日常培养方法、效果等做一个科普式分析介绍。1材料与方法1.1 试验材料与仪器血平板（广州，环凯）、牙龈卟啉单胞菌（ATCC33277，作者简介：马海绒，硕士，助教，研究方向为口腔医学教学与研究。通信作者：张华林，博士，教授，研究方向为口腔组织工程与再生修复研究。基金项目：国家自然科学基金（81560191）。口腔厌氧菌的日常培养 马海绒张华林*（宁夏医科大学，宁夏银川750004）摘要：口腔中存在大量的微生物，其中口腔厌氧菌与口腔疾病密切相关，因此，掌握厌氧菌培养的简单方法，对于口腔医生临床与科研均有好处。文章以 Pg 和 Fn 的培养为例进行研究，以期为实验条件有限状况下更好地培养口腔厌氧菌提供一种日常方便、可行、简单、经济的细菌培养、细菌冻存和复苏方法。关键词：口腔；厌氧菌；培养；冻存科学课堂CIENCE&TECHNOLOGY VISION34科技视界科技视界SScience&Technology Vision上海复祥生物）、厌氧消化链球菌（ATCC27337，上海复祥生物）厌氧产气包（美国 BD）、厌氧发生指示条（美国 BD）、厌氧培养盒（日本三菱）、细菌培养箱（电热恒温培养箱）、细菌冻存管（青岛海博）、生物安全柜（美国 Labconco）、显微镜（日本尼康）。1.2 方法121细菌接种、传代与鉴定细菌接种：超净工作台照射紫外灭菌 30 min，用酒精棉球操作台面。用浸润过 75%酒精的脱脂棉球擦拭安培管壁，用酒精灯加热安培管顶端，同时在顶部滴少量的无菌水使其破裂并掰断。用无菌吸管吸取 200 L 无菌水滴入安培管内轻轻震荡使冻干菌体充分溶解呈悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，接种在 1 个平板上，分区涂布。打开厌氧产气包和厌氧发生指示条放入厌氧培养盒中，在 37 细菌培养箱中进行培养。培养 24 h，拿出平板进行传代和鉴定。细菌传代：点燃酒精灯，在火焰上部操作，将接种环沿着酒精灯烧约 30 s，随后将接种棒金属部分放在火焰上烧灼，以彻底灭菌。将加热过的接种环放入血平板取部分菌落，注意在取出时接种环不能通过火焰，应迅速插入酒精灯旁的接种管中与其中的无菌水混合均匀，测定麦氏值，由下而上划“Z”字形曲线接种在平板上，完毕后将平板盖在火焰上灭菌，将厌氧产气包和发生指示条放入厌氧培养盒中，在 37 培养箱中进行培养。细菌染色鉴定：用擦片布擦净从载物玻片，用特种铅笔在背面画涂抹的标记范围，为直径 1.5 2.0 cm的圆。用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取单个菌落，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。干燥：可放在空气中自然干燥也可把涂片置于酒精灯火焰的上部烘烤，注意不要将涂膜烤焦。固定：用夹子夹住涂片，在燃烧酒精灯最热部分连续烘烤 3 次。可杀死大部分细菌，使标本固定在玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。染色：结晶紫染液染色（初染）1 min，水洗后芦戈氏碘液 1 min，水洗后用 95酒精脱色（注意：脱色时不断摇动玻片，直至流下的酒精液体为无色为止），水洗后石炭酸复红稀释液染色（复染）0.5 min，再次水洗，用滤纸轻轻吸干染色玻片，待标本充分干燥后进行镜检。染色过程中，不要将水流直接冲到涂膜上，应用细水流缓慢冲洗涂膜的背面3。122细菌冻存与复苏细菌复苏：无菌操作台灭菌 30 min，75%酒精消毒所有实验物品。用灭菌的镊子或者接种环取出小瓷珠。将小瓷珠直接放入平板划线或加到液体培养基中，随后取出磁珠，将平板或者培养基在 37 培养 24 h，超净台下挑取单个菌落接种无菌水中配置合适浓度的菌液即可用于实验。细菌冻存：液体石蜡密封储存法：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，采取以下两种方法进行灭菌。（1）121 湿热灭菌 30 min，置于 40 恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。将菌种接种于斜面培养于庖肉培养基中，培养好备用。（2）取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管 10 15 mL，加棉塞，瓶口包上纸，121 高压灭菌 30 min，取出置37 温箱或 110 170 烘箱中 1 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 cm 为宜，将试管直立，入 4 冰箱中保藏。磁珠保藏菌株：从培养 1 d 以上的平板上刮取细菌菌落于菌种保存管中，配成大约 3 麦氏单位的细菌混悬液。拧紧保存管，来回颠倒几次使细菌乳化，注意不要旋摇。用无菌移液器将菌种保存管内的液体吸取干净，将吸出的废液放入废液缸，并进行高温高压消毒丢弃。拧紧菌种保存管，迅速将其置于-20 或-80 冰箱中进行冻存。2结果2.1 细菌染色结果图 1 和图 2 分别为两种口腔厌氧菌革兰氏染色图片，其中图 1 是具核梭杆菌，染成蓝色，菌体呈梭状，两端尖细，大小为 510 m，常见到游离者为椭圆体，有时菌体中有革兰阳性颗粒存在。无芽孢，无鞭毛。图 2 是牙龈卟啉单胞菌，染成红色，菌体呈圆形。科技视界Science&Technology Vision35科学课堂SCIENCE CLASSROOM图1具核梭杆菌染色图图2牙龈卟啉单胞菌染色图2.2 细菌培养前期通过液体石蜡密封储存法，因厌氧菌对于管中无气要求较高，复苏后的细菌生长状态不好。使用磁珠保藏菌株冻存两种厌氧菌后，细菌复苏后，细菌生长状态良好。在血平板上，Pg 和 Fn 均能够正常生长，且能看到细菌生长均匀。3讨论口腔中有大量的菌群，但是口腔厌氧菌与口腔各类疾病如牙周疾病和牙髓病及颌面部感染的发生发展密切相关4。目前，培养厌氧菌主要有厌氧袋、厌氧箱、厌氧手套箱、生物耗氧、焦性末食子酸法、疱肉培养基等方法。其中厌氧手套箱是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一，既可以进行接种操作，也可以进行培养，避免了不必要的微生物污染4。但因实验条件有限，当无专用厌氧手套箱时，可采用厌氧盒、厌氧袋或厌氧箱作为厌氧环境，即在袋内/箱内造成厌氧环境以用于培养厌氧菌（Fn 和 Pg）。厌氧袋均为透明不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，然后将其放入普通的恒温细菌培养箱进行培养。厌氧箱操作与此类似，打开厌氧产气包和厌氧发生指示条放入厌氧培养盒中，盖好盒盖，放入 37 培养箱培养即可。这种细菌培养方法为资金不足以购买手套箱的临床基层单位，提供了一种方便、简单、经济且有效的厌氧菌培养方式。通过比较液体石蜡密封储存法和磁珠保藏菌株法，发现液体石蜡密封储存法更适合有一定细菌培养经验的专业技术人员，而磁珠保藏简单方便，冻存后复苏率较高，建议使用。4结语厌氧菌培养的最终目的是在疾病的发展中利用抗菌药物控制其生长，消除炎症。通过口腔厌氧菌培养及药敏实验，可帮助医生选择抑菌效果强的药物用于治疗感染。同时针对厌氧菌培养需要特殊仪器、成本昂贵等缺点5，当实验条件有限，无专用培养仪器时，可采用厌氧盒、厌氧袋或厌氧箱替代厌氧手套箱，并用磁珠保藏菌株法做好菌株保藏，这为改进了厌氧菌的培养和冻存技术提供实验基础。参考文献1 喻丽.牙龈卟啉单胞菌研究进展 J.口腔研究，2016，5（24）：314-317.2 郑昕，宫利宏，杨毅，等.厌氧菌预还原琼脂平板培养方法 J.微生物学杂志，2020，40（1）：94-99.3 王笠，沈建华.混合涂片革兰氏染色法鉴别细菌 J.科技创新导报，2018（24）：79-81.4 封黎明，赵西珍.口腔厌氧菌牙髓感染患者血清免疫球蛋白和炎症介质检测的临床意义J.中国实验诊断学.2020，24（6）：978-980.5 俞世勋，吴顺馨，谢晓萱.基于 ESP8266 的便携式厌氧菌培养箱的设计与性能测试J.生物医学工程与临床，2021，25（5）：539-545.