克罗诺杆菌分型技术研究进展.pdf

20235139收稿日期：2022-09-06基金项目：国家自然科学基金面上项目（31871828）。作者简介：贾嫒（1998-），女，硕士研究生，研究方向为食品加工与安全。通讯作者：姜毓君（1971-），男，博士，教授，研究方向为乳品科学技术。克罗诺杆菌分型技术研究进展贾嫒，黄燕，宋丹靓敏，苏群超，梁雅琪，李誉，郑亚平，杨鑫焱，满朝新，姜毓君（东北农业大学食品学院 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）摘要：克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是污染婴幼儿配方乳粉（powdered infant formulas，PIF）的主要食源性致病菌之一，可通过辅料的添加和加工环境进入 PIF，可引起新生儿严重感染，导致菌血症、脑膜炎等疾病。因此，高时效性及高精度的菌株分型技术对于克罗诺杆菌的溯源和防控具有重要意义。文章对克罗诺杆菌常用的分型技术进行综述，包括血清分型、生化分型、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型、脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、CRISPR-Cas 阵列分析、随机多态性扩增 DNA 基因分型、核糖体分型、特殊基因分型和全基因组分型，并对上述各种方法的原理和溯源能力进行概述。关键词：克罗诺杆菌，分型技术，婴幼儿配方乳粉，溯源，防控中图分类号：TS207.4文献标识码：B文章编号：1001-2230(2023)10-0042-07doi:10.19827/j.issn1001-2230.2023.10.007Progress in typing methods for Cronobacter spp.JIA Ai,HUANG Yan,SONG Danliangmin,SU Qunchao,LIANG Yaqi,LI Yu,ZHENG Yaping,YANG Xinyan,MAN Chaoxin,JIANG Yujun(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)Abstract：Cronobacterspp.is one of the major foodborne pathogens in powdered milk(PIF).Transmission occurs through the addition of excipientsand in the processing environment,it can cause severe infections in newborns,leading to bacteremia,meningitis and other diseases.Therefore,timelyand accurate bacterial typing is of great significance for the traceability,prevention and control of Cronobacter spp.In this study,the common typingstrategies of Cronobacter spp.were reviewed,including serological typing,biotyping,matrix assisted laser desorption ionization time of flight massspectrometry parting,pulsed field gel electrophoresis type,multilocus sequence typing,the CRISPR locus sequence more point-Cas array analysis,random amplification polymorphic DNA genotyping,ribosomes parting,special genotyping and the full genotype composition.Meanwhile,theprinciple and traceability ability of various methods were summarized.Key words：Cronobacter spp.;typing technology;powdered infant formula;traceability;prevention and control0引言克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）曾被称为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，是肠杆菌科下多存于人和动物肠道内的一个多样化的属，该属由 7 个种组成，分别为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)、莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)、都柏林克罗诺杆菌（C.dublinensis)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)和康帝蒙提克罗诺杆菌(C.condimenti)1，其中 3 个种已从感染的新生儿中分离出来，分别为 C.sakazakii、C.malonaticus和 C.turicensis2。克罗诺杆菌是一种有周身鞭毛、能运动、革兰氏阴性、氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、兼性厌氧的食源性致病菌，广泛存在于食品和环境，尤其是婴幼儿配方乳粉(powdered infant formula,PIF)及其加工环境中。目前，感染克罗诺杆菌的大多数病例来自于摄入受污染 PIF 的早产儿和低出生体重儿以及 4周龄新生儿3，少数为免疫功能低下的老年人4。克罗诺杆菌感染主要引起坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病，致死率可高达 40%80%，存活者也会出现长期后遗症，包括神经发育迟缓、脑积水和永久性神经损伤和精神残疾等5。近年来，我国每年约有 1600万新生儿出生，其中约 85%使用 PIF 喂养6，因摄入受污染 PIF 引起婴儿感染问题却时有发生，使 PIF 安全问题成为社会热点问题。2021 年，Yaylor 等7报告了两名因摄入受阪崎克罗诺杆菌污染的 PIF 而患脑膜炎住院的婴儿，其中一名婴儿存活后听力受损。2022 年，4 名婴儿因摄入奶粉感染阪崎克罗诺杆菌，其中 2 名已被证实死亡8。克罗诺杆菌感染事件不仅引起了广泛关注，也再次敲响了克罗诺杆菌污染的 PIF 对婴幼Vol.51，No.10 2023(total 395)儿造成严重生命威胁的警钟，因此提高对克罗诺杆菌的防控水平是十分必要的。2020 年，Parra 等9从来自荷兰、墨西哥等 4 个国家的 128 个 PIF 样本中分离得到 6 株克罗诺杆菌。2021 年，Gan 等10从中国陕西婴幼儿配方奶粉及工厂环境采集的 617 份样品中分离出 15 株克罗诺杆菌。Gicova11、Zhang12和 Brandao 等13分别从婴儿配方奶粉、奶粉工厂及巴西零售食品中分离出克罗诺杆菌，分离率分别为 92.31%、73.68%和 82.22%。除 PIF 外克罗诺杆菌还存在其他污染源14，一系列食物中曾分离出克罗诺杆菌，如面粉，坚果，蔬菜，水果，大米，干肉，调味品和海鲜15-17，大大增加了克罗诺杆菌的感染风险。2018 年，Moravkova 等18在一年时间里收集了175 份蔬菜样品，并对其进行克罗诺杆菌的分离，最终分离率为 22.3%。除食物外克罗诺杆菌在环境中的分布也很普遍，涉及土壤，水和家居环境17,19。2019 年，Hu 等20从来自土壤和水样的 141 份环境样品中分离得到 22 株克罗诺杆菌，其中包括 6 株阪崎克罗诺杆菌。2021 年 Costa 等21从来自美洲的 465 份样品中分离出 232 株克罗诺杆菌，其中 102 个来自环境样品，27 株从 PIF 中分离出来，1 株来自水样品。可见克罗诺杆菌在自然界中很普遍，要实现控制克罗诺杆菌的污染与危害，不仅需要开发相应的检测技术以达到溯源目的，同时也需要相应的分型技术通过对克罗诺杆菌相似性研究，来确定引起感染的菌株类型、来源与致病能力，因为并不是所有的克罗诺杆菌都具有致病性22。因此，了解不同来源菌株的类型对于追踪污染源和降低危害非常重要，因此本文从分型方法的原理入手，对不同分型方法的分型能力及应用现状进行比较与分析，以期为克罗诺杆菌溯源分型方法的选择提供依据。1 分型技术概括分型技术是根据微生物的生化或基因特征，对不同来源微生物间的种属关系进行判定的一项技术。现知的克罗诺杆菌属的分类很复杂，因为其普遍与肠杆菌科其他成员的遗传关系密切。因此，对其进行正确的分型一直是一项艰巨的任务，且克罗诺杆菌不同型别菌种之间具有一定的生物学差异23，所以采用更加可靠的分型方法很重要。克罗诺杆菌的分型方法可分为表型分型和分子分型两种，其中应用较早的表型分型包括生化分型、蛋白分型和血清分型等，但是克罗诺杆菌属的分型仍然需要更快速、更具成本效益和更可靠的方法。因此，这些方法目前正被基于 DNA 指纹识别的技术，如脉冲场凝胶电泳（PFGE）、扩增片段长度多态性（AFLP）、多位点序列分型（MLST）、多位点VNTR 分析（MLVA）、核糖体分型、全基因组分型等分子分型方法所取代，因为它们具有更高的可靠性以及集中的开放存取数据库方法。分型结果不仅能准确反映出克罗诺杆菌的形态特征、蛋白结构、血清型等表型特征，也可以对克罗诺杆菌进行鉴定。近年来随着分子技术的进步，有多种方法可用于对不同来源的克罗诺杆菌菌株进行分型24，克罗诺杆菌属的分型取得了重大进展。2 克罗诺杆菌表型分型技术2.1 传统血清型分型血清型分型是最早发展起来的细菌分型方法，为细菌菌株的分类提供了基础，是流行病学监测的重要工具。传统血清分型技术的原理是基于抗体抗原相互作用来确定与革兰氏阴性病原体相关的 O-抗原之间的差异25。O-抗原是克罗诺杆菌外膜的重要组分，O-抗原结构的多样性为血清分型提供了基础。基于 PCR 的阪崎克罗诺杆菌 O-型血清分型方案首次在 2011 年由 Sun 等26提出，他们将从各国食品中分离出的 114 株阪崎克罗诺杆菌分为 7 个血清型。2015 年，Yan 等27对此血清分型方法进行了扩展，通过PCR 限制性片段长度多态性分析，确定了阪崎克罗诺杆菌 O-抗原编码位点 rfb 的核苷酸多态性，基于对这些 DNA 图谱的分析，在不同来源的 62 株阪崎克罗诺杆菌中检测到 12 种独特的带型，并确定了两种常见的血清型（O:1 和 O:2）。2013 年，Jarvis 等28采用 MboII限制性片段长度多态性模式和 O-抗原基因簇的DNA 序列鉴定了克罗诺杆菌属的新型血清型（C.turicensisO3，C.muytjensiiO2，C.dublinensisO1，C.dublinen原sisO2 和 C.universalis O1）。2015 年，Bla kov佗 等29共检测不同来源的 82 株克罗诺杆菌，通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析确定 O-抗原基因簇的核苷酸变异性，结果将其分为 17 个血清型。2021 年，姜华等30对分离自 156 份学校环境样品的 11 株克罗诺杆菌进行血清型分析，结果得到的 5 种不同的血清型中有 3种血清型属于阪崎克罗诺杆菌，目前在克罗诺杆菌中已经鉴定出 24 种 O 血清型。将血清型与数据库菌株构成对比存在差异，结果证明样品来源不同或各血清型分布不同存在着地区差异。血清分型有助于我们正确识别克罗诺杆菌，虽然其操作存在一定繁琐、耗时等问题，但 O-抗原基因簇的多样性一定程度上反映其结构的多样性，对克罗诺杆菌 O-抗原基因簇的研究为明确血清学分类与基因之间的关系提供了可靠线索。其结果直观、准确，并且对食源性疾病的治疗有益，因此目前仍然被广泛应用。2.2 生化分型生化方法是较早应用于克罗诺杆菌的常规分型方法，主要是依据克罗诺杆菌不同的生理生化反应来进行判定。传统的生化分型主要通过生理生化反应：福格斯-普里斯考尔实验、甲基红反应、吲哚反应、鸟氨酸脱羧酶反应、乳糖产酸反应、D-葡萄糖的产气反应、丙二酸利用等31，来确定克罗诺杆菌的生化表型。但目前常用的是比传统生化鉴定方法更准确、更快速的 API20E、ID32E 两种生化鉴定系统。API20E 是通过酶促反应及代谢产物检测而研制的被国际公认的细菌标准鉴定系统，也是肠杆菌科的标准鉴定系统32。ID32E 鉴定试条由 32 个干燥的培养基测定小管组成，通过液体方式进行接种、培养后使用鉴定软件对结果进行判定。LU 等33将分离自 PIF 及加工环境的75 株克罗诺杆菌进行 API20E 生化分型鉴定，共分为Monographs 专题论述202351398 种生物型。2008 年，李磊34对分离自婴儿奶粉的 23株野生克罗诺杆菌进行生化分型，经 API20E 生化鉴定条将 23 株菌分为 7 个生化型。2014 年 LU 等33利用 API20E 生化分型系统将来自不同 PIF 加工环境的75 株克罗诺杆菌分为 8 种生化表型。2020 年，Chen等35利用 API20E 生化系统对从贵州 350 个 PIF 样本分离出的 21 株克罗诺杆菌进行鉴定，结果共分为 6种生化表型。传统生化反应的方法虽应用较早，但其存在耗时长、操作繁琐、不易分辨结果，并且存在一定假阳性等问题，所以并没有微生物自动化检测系统应用广泛。因 API20E、ID32E 等生化鉴定方法能更加快速、准确地发现和鉴定病原体等特点，而越来越多地应用于克罗诺杆菌分型领域。2.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix as原sisted laser desorption ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS）已成为一种有效的分析工具，用于高效分型鉴定人类病原微生物的新兴技术36，它使用来自完整细菌细胞的独特蛋白质或脂质，分析从整个细菌中提取的蛋白质的谱，类似于使用DNA 指纹的 DNA 检测方法，生成的数据具有可重复性，可用于在属和种水平上区分细菌种类37。LU 等33将分离自 PIF 及加工环境的 75 株克罗诺杆菌进 MAL原DI-TOF MS 蛋白分型鉴定，共分为 18 个 MAL DI-TOF MS 型。LU 等33利用 MALDI-TOF MS 对来自不同 PIF 加工环境的 75 株克罗诺杆菌进行蛋白分型，可分为 36 个 MALDI-TOF MS 型。2019 年，刘铭等38利用 MALDI-TOF MS 技术对分离自水、食品和粪便样品的 82 株克罗诺杆菌进行鉴定，将其分为 5个群体（MS-1、MS-2、MS-3、MS-4、MS-5），分别与C.sakazakii、C.malonaticus、C.dublinensis、C.turicensis、C.muytjensi 等 5 个种对应。2021 年，Sulaiman 等39使用MALDI-TOF MS 系统完成对回收自环境的 83 株克罗诺杆菌的鉴定，共鉴定出 44 株阪崎克罗诺杆菌并且可信度高达 99.99%。MALDI-TOF MS 虽仪器成本相对较高，但上述研究说明 MALDI-TOF MS 具有较高的灵敏度，同时其样品制备简单、自动化程度高、准确高速、具有高通量和高效率等优点40，因此 MALDI-TOF MS 分型方法在克罗诺杆菌的分型鉴定中已经应用广泛，并取得了非常理想的效果。3 克罗诺杆菌分子分型技术3.1 脉冲场凝胶电泳分型脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是一种在 1984 年开发的溯源分型方法，该技术主要是借助限制性核酸内切酶对菌株 DNA 稀有切点进行特异性酶切，产生不同大小的 DNA 片段，经脉冲场凝胶电泳分离，形成特异性 PFGE 图谱，从而判断菌株的亲缘关系41。因此，它成为微生物污染来源追踪的早期工具，是细菌分型中最为传统并且应用广泛的方法之一，且常用于克罗诺杆菌分型的技术42。PFGE分型常用的限制性核酸内切酶有 2 种43，分别是 Xba玉一级内切酶和 Sep 玉二级内切酶，2 种内切酶可单独使用，然而 Cui 等44在 2014 年对几个菌株用 Xba I消化时表现出相同的 PFGE 模式，但在使用 Spe I 时表现出不同的 PFGE 模式。因此，2 种限制性内切酶配合使用对克罗诺杆菌进行酶切效果更好。在 Cui 等44的研究中，105 个克罗诺杆菌分离株显示出 85 种可区分的 XbaI-SpeIPFGE 模式。PFGE揭示了基因组 DNA 高度的遗传多样性，使用辛普森的多样性指数计算的判别指数为 0.9940。然而，当分离物分别用 XbaI 和 SpeI 消化时，可分别分为 83 和86 个 PFGE 带型。因此，使用 SpeI 的识别率可能高于使用 XbaI 的识别率。2018 年，张博等43选用 4 种内切酶对 34 株克罗诺杆菌进行 PFGE 分型，其中 4 种酶可将 34 株菌株分为 27 个基因型，而 3 种酶结合使用仅能分为 21 个基因型，可见选用酶种类越多，分型分辨率越高。2020 年，张彩霞等45对分离自婴幼儿配方粉、巧克力等食品中的 68 株阪崎克罗诺杆菌进行 PFGE分子分型，结果 68 株菌株形成 58 个 PFGE 带型，其中同一带型的菌株来源较集中，说明受同一来源克罗诺杆菌污染的可能性大。2021 年，苏秀敏等46从工厂采集的 1 246 份样品中分离得到 33 株克罗诺杆菌，经PFGE 分型分为 14 个 PFGE 带型，并结合 PFGE 结果明确了员工鞋底、工厂周边土壤、加工车间、净化系统进风口等可能是克罗诺杆菌污染的关键点，达到溯源目的。2021 年，闫军等47对分离自 2 405 份黑龙江 PIF企业加工环节样品的 16 株克罗诺杆菌进行 PFGE 分型，共分为 10 个型别。其中来自同一生产线不同环节的分离菌株带型相同，说明生产过程可能对产品造成污染。2022 年，李毅等48对检自 296 份食品香辛料和调味品中的 66 株克罗诺杆菌进行 PFGE 与 MLST 分析。经 PFGE 分析共分为 51 个带型，经 MLST 分析共分为 25 个 ST 型。结果显示具有相同的 MLST 型却有不同的 PFGE 型，显示出 PFGE 比 MLST 更强的分辨能力和追踪溯源分析能力。多个研究可以看出 PFGE 具有特异性高、可重复性好、结果高度可信等优点，已成功应用于克罗诺杆菌分型溯源研究。但是 PFGE 本身存在一些限制，克罗诺杆菌菌株具有内在的 DNA 酶活性49，不能对所有菌株进行分型，不同菌株的 PFGE 谱图可能相同，且该方法仍不能鉴定菌株，不能给出菌株之间的关系，它不适用于所有克罗诺杆菌株。3.2 多位点序列分型多 位 点 序 列 分 析(multilocus sequence typing,MLST)是基于 DNA 的高度灵敏的分型方法，是一种选用 7 个看家基因（atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB 和ppsA）进行序列分析的基因分型方法，在鉴定和聚类的细菌分离基础上可以用来分析物种的遗传多样性31。2015 年，Joseph 等50对 325 环境拭子样本进行 MLST分型，已鉴定出包括克罗诺杆菌属的 115 种序列类型（ST）。其中，53 个 STs 已被确定为阪崎克罗诺杆菌，与新生儿脑膜炎有关。2018 年，Guo 等51使用 MLST 重新分析了 2005 年至 2006 年间从进口 PIF 中回收的52 株分离株，这些分离株被确定为阪崎克罗诺杆菌，专题论述 MonographsVol.51，No.10 2023(total 395)共有 8 个 ST 型，包括致病性 ST1、ST4 和 ST12。2018年，Peng 等52在中国东北地区 800 份饮用水、冷却新鲜猪肉、PIF、方便面、饼干、水果、蔬菜和准备好的菜肴中分离出 34 株克罗诺杆菌。后经 MLST 分析，使用根据看家基因设计的引物扩增克罗诺杆菌分离株的DNA 并测序，将 34 个分离株分为 15 个 ST 型，其中ST4 最多占比 29.4%。Chen 等35同样对从贵州 350 个PIF 样本分离出的 21 株克罗诺杆菌进行 MLST 分析，结果共分为 11 种 ST，其中，ST193 和 ST157 是从市售PIF 中分离出的克罗诺杆菌的显性 ST。2021 年，Irshad等39利用 MLST 数据库分析来自美国 12 个地理位置的 785 个环境监测样本中回收的 83 个克罗诺杆菌分离株时，清楚地揭示了 12 个不同的克隆复合物。并基于克罗诺杆菌 MLST 数据库的临床菌株的比较分析，显示几乎 50%菌株为临床最常见的 ST4，而其余菌株被鉴定为 ST8。虽然设计一个用于克罗诺杆菌 MLST 方案需要设计扩增引物和测序等大量前期工作，但其对克罗诺杆菌的分析快速，可重复性强，分辨率较高，所得数据准确。因此，该方法可以在未来的克罗诺杆菌属物种研究中发挥重要作用。因此，MLST 已广泛应用于对PIF 及其生产设施和临床克罗诺杆菌分离株的分析。3.3 CRISPR-Cas 阵列分析CRISPR-Cas 系统为细菌提供针对噬菌体和质粒的序列特异性、获得性防御，是细菌的适应性免疫系统53。CRISPR 位点用于细菌分型的原理是使用标记的引物 PCR 扩增 CRISPR 阵列，这些引物可识别定向重复序列，然后将 PCR 产物使用正向和反向扩增引物进行测序。CRISPR-Cas 阵列分析是一种非常强大的微生物来源追踪方法，因为它可以区分同一MLST 克隆簇和 PFGE 组中的菌株54。2017 年，Oodzki等55使用 CRISPR-Cas 系统对经 MLST 确定的 2 株都柏林克罗诺杆菌 ST80 菌株进行分析，结果显示 2株分离株的 CRISPR-Cas 型（CT）不同。2018 年，Zeng 等56将他们的研究扩展到克罗诺杆菌属，并预测克罗诺杆菌祖先菌株可能同时具有 I-E 亚型和 I-FCRISPR-Cas 系统，但 I-F 亚型选择性退化并被大多数克罗诺杆菌致病菌丢失，且植物相关物种都柏林克罗诺杆菌具有更高的 CRISPR 活性，进一步扩展了该方法在克罗诺杆菌分型中的作用。2019 年，Zeng 等57利用 CRISPR-Cas 对 257 株阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌进行分析，结果显示 161 株阪崎克罗诺杆菌可分为 129 种 CT；65 株丙二酸盐克罗诺杆菌分为 42 个 CT 型；31 株都柏林克罗诺杆菌分为 31 个 CT 型。2020 年，Zeng 等58分别对 54 株分离自 588 份肉类的克罗诺杆菌进行 MLST分型以及 CRISPR-Cas 阵列分析，结果显示出 40 种ST 和 60 种 CT。这些结果表明，CRISPR 分型结果与MLST 具有良好的对应关系，且与 MLST 相比，CRISPR-Cas 具有更大的区分相似菌株的能力，效果更好，结果也更加直观，可用于克罗诺杆菌更精细的分型。3.4 随机多态性扩增 DNA 基因分型随机多态性扩增 DNA(Random Amplified Poly原morphic DNA,RAPD)技术采用随机选择的单一引物，通过 PCR 即能产生复杂基因组。其是一种操作简单、可行性高、高灵敏度的遗传标记技术，目前广泛应用于微生物的分子分型、物种亲缘关系确定等领域59。2012 年，杨海荣等60采用 RAPD 对 8 株克罗诺杆菌标准菌株 DNA 进行扩增，并从产物中选取可以将克罗诺杆菌属明确区分的特异性引物，以此对 30 株食品克罗诺杆菌分离株进行 RAPD 分型。结果 38 株可分为 37 个不同的 RAPD 带型，而按照其遗传差异可以分为 8 个基因型类群，可见该技术可用于克罗诺杆菌不同种的鉴定。2013 年，陈万义等61对由 8 株模式菌株与 35 株食品分离菌株组成的 43 株克罗诺杆菌属菌株基于 gyr B 基因多态性进行聚类分析，结果发现克罗诺杆菌属之间的菌株聚成一类，5 株肠杆菌属菌株聚在一起，并且阪崎克罗诺杆菌也被分成了 7 个类群。结果可以看出 gyr B 基因适合用于区分克罗诺杆菌属菌株和其他肠杆菌属菌株，以及 gyr B 基因在克罗诺杆菌属菌株种水平上的多态性。该方法技术简单，不需要预先知道分离物的基因序列信息，具有普遍适用性，可为食品和环境中克罗诺杆菌的分型和溯源提供参考。3.5 核糖体分型核糖体分型通过将细菌分离株进行酶切，并经凝胶电泳将酶切结果显示出来，最后对其图谱进行分析。该方法是一种适用于克罗诺杆菌的快速分子分型方法，基于核糖体分型方法在确定遗传结构、系统发育关系、区别不同来源阪崎克罗诺杆菌等方面非常有效62。2010 年，Pei 等63采用杜邦 RiboprinterTM指纹图谱分析仪对分离自食品的 29 株克罗诺杆菌进行核糖体分型，运用 BioNumerics 数据库软件建立相应的核糖体指纹图谱数据库进行分析，结果核糖体分型将 29 株克罗诺杆菌分离株分成 26 种核糖体带型。2016 年，陈万义等64以分离自蔬菜的 13 株阪崎克罗诺杆菌和乳粉的 2 株阪崎克罗诺杆菌为研究对象进行核糖体分型，并利用BioNumeicrus 软件对其结果进行聚类分析，按照相似性大于 80%计算后根据辛普森方程计算该分型方法的分辨率可达到 0.808，且乳品分离株和其他实验菌株明显不同，其他分离菌株聚成一列，并显示出高基因相似性，成功将不同来源的菌株区别开来。以上实验结果表明核糖体分型适用于不同来源的克罗诺杆菌分离菌株之间的鉴定与分型。它能够将不同来源的分离菌株区别开来，尽管该方法费用相对较高，但是其操作简便，结果判断快，重复性相对较高，省时省力，一次可同时对多个样品进行处理。因此，在紧急状况下采用该技术对乳粉及其他食品来源的克罗诺杆菌进行快速分子分型是非常有效的。3.6 特殊基因分型除上述提到几种传统的分型方法外，还有一些基于特殊基因的用于克罗诺杆菌分型鉴定的方法，例如基于 16S rRNA 的单基因座序列分型(SLST)是用于细菌鉴定和建立系统发育关系最广泛使用的技术。2015年，娄彬彬等65利用 16S rDNA 基因测序的方法对分离自不同地区乳粉加工环境的 37 株克罗诺杆菌进行鉴定，Monographs 专题论述20235139所有菌株（除 ES4）与阪崎克罗诺杆菌的同源性最高，相似性达 99%，鉴定为阪崎克罗诺杆菌。另外，编码细菌 RNA 聚合酶亚基的 rpo B 基因也已用于克罗诺杆菌属的鉴定。2009 年，Stoop 等66开发并评估了基于rpo B 的 PCR 系统，该系统可以区分克罗诺杆菌属中的 6 个物种。2017 年，Miranda 等67对分离自 44 个国家不同食品的 195 份样中的 51 个克罗诺杆菌分离株进行 rpo B 位点扩增并进行 16S rRNA 测序，核苷酸测序揭示了在回收的克罗诺杆菌分离株中相当大的种间和种内遗传变异性。2021 年，Sulaiman 等39在使用上述两步 PCR 方案时，所有来自各个环境样本的 83 个分离株在 rpo B 位点均被鉴定为阪崎克罗诺杆菌。然而，基于 16S rRNA 的 SLST 和基于生物分型的表型分析有一些局限性，且与 MLST 相比 16S rDNA 的基因序列多样性较低。该方法不可以一次性地将克罗诺杆菌的所有的“种”区分，还需要与其他方法结合才能实现。3.7 全基因组分型全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）技术能够在基因水平上全面分析其序列组成特征，是从整个基因组的角度分析菌株特性的有效方法，在食源性疾病爆发病原菌的流行病学调查中发挥了重要作用68。2018 年，冯婧69对分离自 PIF 及其加工环境的15 株不同 ST 菌株与已完成测序的 12 株参考克罗诺杆菌菌株进行比较基因组分析。结果表明，测序菌株可分别归属于阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌 2 个种。同时利用 Roary 软件通过比较基因组学的泛基因组，并通过 COG 数据库对其结果进行分析，发现 27 株克罗诺杆菌基因组划分成 11 262 个直系同源簇，其中特有基因占总基因簇的 43%，三类基因在 26类功能分类中均有富集，表明克罗诺杆菌各项功能是由整体遗传物质统筹调控的。2019 年，WANG 等70对2006 至 2015 年间输入北京的奶粉中分离的阪崎克罗诺杆菌进行 WGS 分析，测得其主要的型别为 ST1 和ST4 型。2021 年，Gan 等10对从 617 份 PIF 及其工厂环境样品中分离出的 15 株克罗诺杆菌进行 WGS 分析，结果 15 株分离株均为阪崎克罗诺杆菌，且均分为 7个 ST 型，其中 ST46 为显性。2021 年，张红芝等71对婴幼儿食品中分离的阪崎克罗诺杆菌进行 WGS 分析，其研究中分离的 9 株阪崎克罗诺杆菌共分为 5 个 ST型，ST1 和 ST64 型为显性，分别来自 PIF 和婴儿辅食，表明阪崎克罗诺杆菌污染对婴幼儿存在潜在的危险需提高重视。全基因组测序技术要求高且测序时间较长。但随着 WGS 对克罗诺杆菌进行高分辨率跟踪、费用逐步降低、测序时间逐步缩短等优势的显现，该方法逐渐取代传统克罗诺杆菌分型方法，广泛用于克罗诺杆菌的分型及溯源中。4 总结与展望对常用于克罗诺杆菌的分型方法进行了概述，其中血清分型结果对克罗诺杆菌血清型的确定有利于临床疾病的溯源与治疗，虽然此类方法存在操作繁琐并且分辨率较低等问题，但目前技术的开发一定程度上弥补了这种不足。生化分析方法作为基于生理生化反应的表型分型方法较其他方法应用较早、方法更成熟、结果更直观，但操作繁琐导致鉴定耗时长。多位点序列分析方法在对目的菌株多态性和菌株间亲缘关系的分辨上更有优势，但该方法分型过程中涉及 7 个看家基因，因此成本较高。随着研究的深入以及数据库的不断完善，MALDI TOF MS 作为一种新兴的分型方法可配合其它分型方法实现对食源性致病菌的快速诊断。脉冲场凝胶电泳作为一种以酶切片段为依据的分子分型方法分辨率更高、准确、快速等特点，因此在克罗诺杆菌流行病学分析方面应用很广泛。随着测序技术的发展基于全基因组序列的分型方法表现出对微生物的高分辨力及数据的可共享能力，在食源性致病菌溯源分析及流行病学监控方面有着更加突出的优势。因此全基因组数据的分析与处理成为了溯源分型的关键，这就要求今后具有完备的生物信息学相关软件及标准的分析流程，以更好地发挥全基因组分型技术的优势。目前克罗诺杆菌造成的婴儿配方乳粉污染已经逐渐呈现出全球化趋势，因此未来对克罗诺杆菌的分型溯源分析一定会趋于标准化、规范化。克罗诺杆菌的分型并不仅仅依赖于一种分型方法，而是多种传统分型方法与新型分型方法的结合应用来达到分型目的，在具有合适分型依据的基础上，选择最佳的分型方法可以帮助我们找到克罗诺杆菌的污染源，达到更好的防控效果。参 考 文 献：1 CARVALHO G G,CALARGA A P,ZORGI N E,et al.Virulence andDNA sequence analysis of Cronobacter spp.isolated from infant cerealsJ.International Journal of Food Microbiology,2022,376:109745.2 FEI P,JING H,MA Y,et al.Cronobacter spp.in commercial powderedinfant formula collected from nine provinces in China:prevalence,genotype,biofilm formation,and antibiotic susceptibilityJ.Frontiers inMicrobiology,2022,13:900690.3 SAWALE M,OZADALI F,VALENTINE C J,et al.Impact of bovinelactoferrin fortification on pathogenic organisms to attenuate the risk ofinfection for infantsJ.Food Control,2022,139:109078.4 FRIEDEMANN M.Epidemiology of invasive neonatal Cronobacter(En原terobacter sakazakii)infectionsJ.European Journal of Clinical Microbiol原ogy&Infectious Diseases,2009,28(11):1297-1304.5 OTAKE S,OKADA Y,FORSYTHE S J,et al.Meningitis and brain ab原scess formation caused by Cronobacter malonaticus sequence type 440 in afull-term neonateJ.Journal of Infection and Chemotherapy,2021,27(11):1648-1652.6 李沛霖,刘鸿雁.中国儿童母乳喂养持续时间及影响因素分析基于生存分析方法的研究J.人口与发展,2017,23(2):100-112.7 TAYLOR M G,AMERSON-Brown M H,HULTEN K,et al.Twocases of Cronobacter Sakazakii meningitis in infants the importance of earlyadvanced brain imaging and public health reportingJ.Pediatric Infec原tious Disease Journal,2021,40(9):346-348.8 杜蔚,丁舟洋.雅培陷召回门：超 10 城多个患儿家庭追问真相N.每日经济新闻,2022-04-18.9 PARRA-FLORES J,MAURY-SINTJAGO E,RODRIGUEZ-专题论述 MonographsVol.51，No.10 2023(total 395)FERNANDEZ A,et al.microbiological quality of powdered infant for原mula in latin americaJ.Journal of Food Protection,2020,83(3):534-541.10 GAN X,LI M H,YAN S F,et al.Genomic landscape and phenotypicassessment of Cronobacter sakazakii isolated from raw material,environ原ment,and production facilities in powdered infant formula factories inChinaJ.Frontiers in Microbiology,2021,12.11 GICOVA A,ORIESKOVA M,OSLANECOVA L,et al.Identifica原tion and characterization of Cronobacter strains isolated from powderedinfant foodsJ