快速去除实验室核酸污染方法的探讨.pdf

第 28卷 第 5期聚 合 酶 链 式 反 应（polymerase chain reaction，PCR）技术因其良好的灵敏度和特异性1，被广泛应用于传染病检测领域，成为在新型冠状病毒（SARS-CoV-2，以下简称新冠病毒）感染疫情期间重要的防控检测手段2。该技术缺点是操作中易受到核酸污染而导致假阳性结果3，所以在区域核酸检测4期快速去除实验室核酸污染方法的探讨梁爽，连贺强，胡海洋，史晓娟，马建敏（新乡市疾病预防控制中心，河南 新乡 453000）摘要目的探讨区域新冠病毒核酸检测期间，实验室发生核酸污染后快速消毒处置方法，使其在最短时间重新启用。方法实验室发生核酸污染后，迅速进行消毒前采样检测，查找污染原因；检测的同时展开消毒工作，首先使用 7.5%的过氧化氢分别对各检测区进行雾化消毒，机械通风12 h；再针对重点污染部位，采取不同浓度的含氯消毒剂或核酸去除剂反复擦拭 35 遍，紫外线消毒作为辅助；通风 12 h 后采集环境样进行核酸检测，并使用 5 份新冠病毒盲样进行室间对比检测。结果消毒前采样 25 份，其中核酸提取仪、PCR 扩增仪及冰箱把手等 6 份样品中新冠病毒核酸阳性，消毒后采集相同部位的 25 份样品，结果全部阴性；5 份新冠病毒盲样室间对比检测结果一致。结论实验室发生核酸污染后，多种消毒方法联用可以快速去污染，能够在 36 h 内重启实验室。关键词区域全员新冠检测实验室核酸污染快速消毒处置中图分类号R446.1文献标识码Bdoi10.3969/j.issn.1008-5777.2023.05.011Discussion on Rapid Removal of Nucleic Acid Contamination in LaboratoriesLiang Shuang，Lian Heqiang，Hu Haiyang，Shi Xiaojuan，Ma Jianmin（Xinxiang Center for Disease Prevention and Control，Xinxiang Henan 453000）AbstractObjectiveDuring nucleic acid testing of regional SARS-CoV-2，rapid sterilization disposals werecarried out after nucleic acid contamination in the laboratory，enabling it to be reactivated in the shortest possibletime.MethodsAfter nucleic acid contamination occured in the laboratory，samples were taken immediately beforesterilization to find out the cause of the contamination.Sterilization was carried out at the same time as the nucleicacid test.The test areas were first aerosol disinfected with 7.5%hydrogen peroxide and ventilated mechanically for12 hours.For the key contaminated areas，use different concentrations of chlorine-containing disinfectants ornucleic acid removal agents to repeatedly wipe 3-5 times，with ultraviolet disinfection as an auxiliary measure.After 12 hours of ventilation，environmental samples were collected again for nucleic acid detection，and five COVID-19 blind samples were used for room contrast test.ResultsTwenty-five samples were taken before disinfection，and the results showed that SARS-CoV-2 nucleic acid was positive in 6 samples，including nucleic acid extractor，PCR amplification instruments，and refrigerator handles.After disinfection，25 samples from the same part were collected，and all the results were negative.The results of the laboratory comparison of 5 blind samples of SARS-CoV-2 were consistent.ConclusionAfter nucleic acid contamination occurred in the laboratory，a combination of multiple disinfection methods enabled rapid decontamination and enabled the restart of the laboratory within 36 h.KeywordsUniversalSARS-CoV-2nucleicacidLaboratorynucleicacidcontaminationRapiddisinfectiondisposal实验研究口岸卫生控制-47口岸卫生控制第 28卷 第 5期间，因样本量大、操作不当等原因引起的实验室核酸污染时有发生5-6，实验室只能停用。核酸污染的快速去除对于实验室承担紧急检测任务至关重要，但目前可供参考的方法资料十分有限，且在我们的前期实践工作中发现，彻底去除需要 57 d（数据未发表）。现结合 2022 年 10 月本实验室核酸污染的消毒处置过程，探讨一种快速有效的去污染方法。1材料1.1主要使用仪器全自动核酸提取仪（Zybio EXM3000），荧光定量 PCR 仪（杭州博日 9600 FQD-96A），高速离心机（Eppendorf 5425），过氧化氢空气消毒机（浙江泰林FHP3）。1.2主要使用试剂磁珠法核酸提取试剂（西安天隆科技有限公司），新冠病毒荧光定量 PCR 试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司），核酸去除剂（LEMINSCARE），84 消毒液（北京雅特），7.5%过氧化氢消毒液（泰林生物）。2方法2.1污染发现与排查2022 年 10 月份区域核酸检测过程中，检出的新冠病毒阳性数量突然增加，多为单靶标（ORFa/b 或 N基因）弱阳性，Ct 值在 3740，但同批次检测的空白对照、阴性对照、内质控等结果仍正常。可疑样本使用双试剂（新启封）和备用实验室重新检测，两种试剂结果一致，全部为阴性。疑似该实验室核酸污染。2.2消毒前采样立即开展消毒前的环境采样。对实验室不同区域、各物体表面涂抹采样，共采集 25 份样品，送至备用实验室检测新冠病毒核酸，目的是查找污染部位。2.3污染的消毒处置采样后立即使用过氧化氢消毒机对实验室进行 7.5%过氧化氢雾化消毒。分别对试剂配制区、核酸提取区和 PCR 扩增区消毒，将房间内生物安全柜前挡、离心机盖子、核酸提取舱门及 PCR 仪盖子打开，每个房间（空间 4050 m3）消毒时间设置 1 h，结束后密闭房间 2 h，进行消毒后第一次采样（方法、数量同上），然后打开机械通风 12 h。之后，依据消毒前采样和消毒后第一次采样检测结果，使用不同浓度的含氯消毒剂对污染部位进行重点消毒。用浓度 5 500 mg/L 的 84 消毒液对核酸提取仪、冰箱内部及把手等擦拭 2 遍，10 min 后，再用清水擦拭 3 遍去除余氯。生物安全柜和核酸提取仪仓体内部因构造问题难以擦拭彻底，故再使用自带紫外线灯照射 2 h。较难去除污染的是 PCR 仪上样孔，本研究使用咽拭子蘸取 5 500 mg/L 的 84 消毒液逐孔反复擦拭 2 遍，再蘸取清水擦拭 5 遍以上，最后用核酸去除剂再次喷洒、擦拭，移至通风处。其他未检出阳性的仪器、耗材和地面等用 2 000 mg/L的 84 消毒液擦拭或拖拭。消毒后再次采样，并打开机械通风 12 h。全程时间不超过 36 h。2.4消毒效果验证消毒全部结束后，进行消毒后第二次采样检测（方法、数量同上）；同时使用自制的 2 套相同的新冠病毒盲样质控品（每套 5 份）在该实验室和备用实验室，使用相同试剂分别进行检测。环境样品检测阴性，2 个实验室的盲样检测结果一致，表明污染去除，消毒有效。3结果3.1消毒前采样结果消毒前采集的 25 份样品，包括操作台面、门把手、仪器、生物安全柜、移液器、地面、墙面等各部位，其中 6 份单靶标（N 基因）或双靶标（ORF1ab 和N 基因）阳性，分别是核酸提取仪、PCR 仪和冰箱等。（见表 1）。表 1消毒前后环境样品检测结果一区冰箱门把手及内部二区冰箱门把手及内部一区传递窗把手及内部二区传递窗把手及内部NNNNN37.6NN阴性阳性阴性阴性NNNNNNNN阴性阴性阴性阴性NNNNNNNN阴性阴性阴性阴性采样部位消毒前（Ct 值）ORF1abN结果消毒后第一次（Ct 值）ORF1abN结果消毒后第二次（Ct 值）ORF1abN结果-48第 28卷 第 5期3.2消毒后采样结果使用过氧化氢消毒后第一次采样结果显示，核酸提取仓和 PCR 仪模块仍检出阳性（见表 1）；消毒结束后第二次采样结果，25 份环境样本全部阴性（见表 1）；5 份新冠病毒盲样在两个实验室检测 Ct值基本一致，且结果正确，空白对照、阴性对照均为阴性，阳性对照出现明显的扩增曲线（见表 2）。表明实验室可以使用。4讨论核酸污染难以去除，这是困扰绝大多数实验室的一个难题。本实验室在指导和处理基层实验室去污染过程中，工作思路上倾向于先找明污染来续表 1消毒前后环境样品检测结果核酸提取仪 1 内仓核酸提取仪 2 内仓一区移液器二区移液器生物安全柜 1生物安全柜 2操作台台面 1操作台台面 2一区地面+墙面二区地面+墙面三区地面+墙面一区操作台面（含各物体表面）二区操作台面（含各物体表面）三区操作台面（含各物体表面）一区门把手内外侧二区门把手内外侧三区门把手内外侧1 号 PCR 扩增仪上样模块2 号 PCR 扩增仪上样模块3 号 PCR 扩增仪上样模块4 号 PCR 扩增仪上样模块空白对照阴性对照阳性对照NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN36.3NN25.638.236.7NNNNNNNNNNNNNNN37.338.1N37.1NN26.3阳性阳性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阳性阳性阴性阳性阴性阴性阳性NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN25.539.6NNNNNNNNNNNNNNNN39.3NN39.1NN26.2阳性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阳性阴性阴性阳性阴性阴性阳性NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN25.7NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN26.3阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性阳性采样部位消毒前（Ct 值）ORF1abN结果消毒后第一次（Ct 值）ORF1abN结果消毒后第二次（Ct 值）ORF1abN结果名称盲样编号样品 1样品 2样品 3样品 4样品 5空白对照阴性对照阳性对照消毒后实验室（Ct 值）ORF1ab35.2/34.1/34.7/25.9N36.1/35/35.6/26.1结果阳性阴性阳性阴性阳性阴性阴性阳性备用实验室（Ct 值）ORF1ab35.1/34.1/34.8/26.2N36.2/34.9/35.4/25.8结果阳性阴性阳性阴性阳性阴性阴性阳性表 25 份新冠病毒盲样检测室间比对结果梁爽，等.快速去除实验室核酸污染方法的探讨-49口岸卫生控制第 28卷 第 5期源，然后使用过氧化氢和 84 消毒液中的一种，或者两者联合使用，反复消毒、检测，虽然污染最终消除，但所用时间长，严重影响工作。为此，本次在前期数据（未发表）的基础上对采取措施的时间、流程和消毒方法上进行了整体优化，缺憾是因受限于时间以及现实条件，未能设置平行比对实验。但该实验室污染后能够在 36 h 重新启用，表明整个流程及方法行之有效。首先要快速发现污染，本次实验室出现同一反应板阳性数量突然增多，复查后呈阴性，即果断停用实验室，立即按照核酸污染进行消毒。消毒前采样是为了查找污染原因，但完全依赖该结果再采取措施会耽误时间，因引起实验室污染的原因很多，涉及实验活动的方方面面，准确找到原因不是件容易的事7。可视为实验室存在气溶胶污染，从而采用过氧化氢雾化消毒。过氧化氢溶液是一种强氧化剂，可游离释放出羟自由基和氧自由基，能分解核酸片段8，且雾化形成的气溶胶微粒扩散性好，消毒时不留死角9。对一些污染难以消除的重点部位如核酸提取仓、PCR 仪加样模块等，再选择 84 消毒液、核酸去除剂及紫外线消毒灯等化学消毒和物理消毒联合去污染。上述消毒方法适用于核酸污染的应急快速处置，其缺点是高浓度含氯消毒剂和过氧化氢消毒液均具有强氧化性，用于核酸提取仪、生物安全柜及PCR 扩增仪的消毒处理后，应迅速彻底去除消毒剂残留，避免对金属仪器的腐蚀10；且在消毒过程中，消毒人员需做好二级防护，防止消毒剂对呼吸系统和皮肤黏膜的刺激。此外，污染去除后，应及时更换实验室排风滤网，避免再次污染。因此，实验室一定高度重视并严防核酸污染的发生。建议规范各项管理：一是科学制定核酸检测实验室 SOP，并严格执行操作规范；二是要强化培训，人员需持证上岗，并落实岗位监督机制；三是加强对易产生气溶胶的仪器的日常消毒，如全自动核酸提取仪在提取核酸过程中，因震荡会造成质控品或阳性样本等核酸挥发形成气溶胶11，日常消毒时可以用 1 000 mg/L 的含氯消毒剂进行擦拭消毒后开启自身紫外线灯消毒 3 h12。参考文献1 林万明.PCR 技术操作和应用 M.北京：人民军医出版社，2012.2 中华人民共和国国家卫生健康委.国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒感染的肺炎防控方案（第三版）的通知 EB/OL.http：/ Kwok S，Higuchi R.Avoiding false positives with PCRJ.Nature，1989，339（6221）：237.4 中华人民共和国国家卫生健康委.关于印发区域新型冠状病毒核酸检测组织实施指南（第三版）的通知EB/OL.http：/ 李夫，张代涛，贾蕾，等.环境样本新型冠状病毒核酸检测阳性结果评估及处置建议 J.国际病毒学杂志，2021，28（3）：177-181 6 Lippi G，Simundic AM，Plebani M.Potential preanalytical and analytical vulnerabilities in the laboratory diagnosis of coronavirus disease 2019（COVID-19）J.ClinChem Lab Med，2020，58（7）：1070-10767 王爽，潘阳，徐新民，等.新型冠状病毒核酸 PCR 检测假阳性核酸污染类型的鉴别方法 J.首都医科大学学报，2022，43（3）：427-432.8 王思懿，陆松柳，王丽花，等.新冠病毒肺炎疫情中常用空气消毒对气载病原体的消杀作用及其生态健康危害研究进展 J.环境化学，2023，42（5）：5-6.9 宋大海.过氧化氢（干雾）灭菌及其在药厂的应用 J.机电信息，2015（20）：44-49.10 陈昭斌.消毒学概论 M.北京：人民卫生出版社，2021：60.11 龚文娟，陈宝荣，孙慧颖，等.新型冠状病毒核酸检测阳性质控品污染原因分析及解决方法 J.中华临床实验室管理电子杂志，2021，9（4）：237-239.12 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