低叶酸联合甲氨蝶呤诱导神经管畸形胎鼠的神经组织转录组学分析.pdf

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81971390,81701441)作者单位:100020首都儿科研究所儿童发育营养组学北京市重点实验室(王芳、张霆);030001太原,山西医科大学生物化学与分子生物学教研室(李建婷);100730中国医学科学院/北京协和医学院北京协和医院中心实验室(谢秋)通信作者:张霆,电子信箱:zhangtingcv 低叶酸联合甲氨蝶呤诱导神经管畸形胎鼠的神经组织转录组学分析王芳李建婷谢秋张霆摘要目的利用低叶酸饲喂联合甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)诱导的小鼠神经管畸形(neural tube defects,NTDs)模型,分析孕 9.5 天胎鼠脑组织和脊髓组织基因转录表达的变化,探讨可能影响神经组织发育的功能基因及转录因子。方法将SPF 级、6 8 周龄健康雌性 ICR 小鼠分为两组,其中对照组采用正常饲喂,低叶酸联合 MTX 实验组采用低叶酸饲喂,4 周后交配,受孕 7.5 天实验组以 1.5mg/kg 浓度腹腔注射 MTX,受孕 9.5 天获取两组的胎鼠脑、脊髓组织,分别提取总 RNA 进行 RNA-seq,采用 DESeq 软件筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),采用生物信息学方法分析实验组与对照组中影响神经组织发育的差异基因功能及转录因子。结果实验组与对照组比较,脑、脊髓组织基因转录组分别有 939、879 个 DEGs。GO(gene ontology)功能分析显示,脑组织 DEGs 功能按生物学过程(biological process,BP)分类,上、下调的基因均主要集中在细胞过程、生物调节、发育过程;按细胞组分(cellular component,CC)分类,上、下调的基因均主要集中在细胞、细胞器相关组分;按分子功能(molecular function,MF)分类,上、下调的基因均主要集中在蛋白结合、转录调节活性。脊髓组织 DEGs 功能在各分类中结果与脑组织的相似。脑、脊髓组织的差异表达转录因子主要聚焦在 zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT 等家族。结论低叶酸联合 MTX 能够引起胎鼠神经组织基因组的转录改变,DEGs 功能主要与神经细胞发育、转录调节有关。影响神经发育的转录调节因子集中在 zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT 家族。关键词神经管畸形叶酸甲氨蝶呤转录组测序差异表达基因中图分类号R591;R742文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.03.011Transcriptome Analysis of Neural Tissues in Mouse Models of Methotrexate-induced Neural Tube Defects under Folate Deficiency.WANGFang,LI Jianting,XIE Qiu,et al.Beijing Municipal Key Laboratory of Child Development and Nutriomics,Capital Institute of Pediatrics,Beijing 100020,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the gene functions and transcription factors that potentially influence the development of neuraltissues by analyzing the changes of gene transcriptional expression in the neural tissue of fetal mice with neural tube defects(NTDs)in-duced by low folate feeding combined with methotrexate(MTX).MethodsSPF-grade 6-8-week-old healthy female ICR mice weredivided into two groups:the control group,which received a normal diet,and the experimental group,which received a low-folic aciddiet.The mice were fed under a low folate diet for four weeks and conceived,on day 7.5 of conception;the experimental group was intra-peritoneally injected with MTX at a concentration of 1.5mg/kg.On day 9.5 of conception,the brain and spinal cord were collected fromboth groups.Total RNA was extracted from the tissues for RNA-seq analysis.The differentially expressed genes(DEGs)were identifiedusing DESeq software.Bioinformatic approaches were used to analyse functions and transcription factors associated with the DEGs in theexperimental and control groups.ResultsThere were 939 and 879 DEGs in the brain and the spinal cord tissue for the experimental groupand the control group,respectively.Gene Ontology(GO)functional analysis showed that DEGs of biological process(BP)were mainlyenriched in cellular process,biological regulation,developmental process,and metabolic process;DEGs of cellular component(CC)were mainly concentrated in cellular and organelle-related components;DEGs of molecular function(MF)were primarily involved inprotein binding,transcriptional regulatory activity,and molecular function regulators.The DEGs function in the spinal cord had consistentresults in the brain.The differentially expressed transcription factors in the brain and spinal cord were focused on zf-C2H2,bHLH,Ho-meobox,and STAT families.ConclusionThe combination of low folate and MTX can induce transcriptional alterations in the genome offetal mouse neural tissues.The DEGs identified are primarily associated with neural cell development and transcriptional regulation.The05论著J Med Res,March 2024,Vol.53 No.3transcriptional regulators influencing neural development are concentrated in the zf-C2H2,bHLH,Homeobox,and STAT families.Key wordsNeural tube defects;Folic acid;Methotrexate;Transcriptome sequencing;Differential expression genes神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是由于胚胎发育过程中神经管闭合不全引起的出生缺陷,主要表现为无脑儿、脊柱裂及脑膨出。NTDs 发生率高,后果严重。流行病学研究表明,母亲在孕期和围孕期补充叶酸可以降低后代患 NTDs 的风险1,2。实验研究证明,叶酸缺乏可通过影响胚胎表观遗传修饰的改变导致 NTDs 的发生,然而机制还不完全清楚3,4。小鼠的神经管闭合过程在细胞、组织、基因及代谢水平上与人类相似,是被用于研究 NTDs 的最广泛的模式动物。本研究拟在前期建立的低叶酸联合甲氨喋呤诱导 NTDs 小鼠模型的基础上,检测小鼠胚胎神经发育关键时期(受孕 9.5 天)脑组织和脊髓组织基因的表达变化,分析寻找差异表达基因及可能影响神经发育的差异转录因子基因,为进一步阐明叶酸预防NTDs 的机制提供理论依据5。材料与方法1.实验材料:采用物体特定病原体(SPF)级、6 8 周龄的健康雌性 ICR 小鼠(体质量为 18 22g)及健康雄性 ICR 小鼠(体质量为 20 22g),均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。低叶酸饲料及正常饲料购自北京科澳协力饲料有限公司,甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)购自美国 Sigma 公司,0.9%氯化钠溶液购自中国大冢制药有限公司,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)购自美国 Gibco 公司,RNA 文库制备试剂盒(TruSeq RNA sample Prepa-ration kit V2)购自美国 Illumina 生物技术公司,核酸片段筛选试剂盒(Agencourt SPRIselect Reagent Kit)和核酸纯化试剂盒(Agencourt AMPure XP)购自美国Beckman Coulter 公司,反转录酶(SuperScript)购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司。2.NTDs 胎鼠模型制备:将雌性小鼠分为正常饲喂组(对照组)与低叶酸联合 MTX 诱导 NTDs 组(低叶酸联合 MTX 实验组),对照组的雌性小鼠及全部雄性小鼠均提供正常繁殖饲料喂养,低叶酸联合 MTX实验组小鼠采用特制低叶酸饲料。小鼠喂养 4 周后,按雌雄比例 2 1交配过夜,于次日 8:00 时观察到阴道栓,指定为受孕 0.5 天;受孕 7.5 天时以 1.5mg/kg用量对低叶酸联合 MTX 实验组雌性小鼠腹腔注射MTX,对照组雌性小鼠使用等剂量 0.9%氯化钠溶液进行腹腔注射;至受孕 9.5 天,对妊娠小鼠实施颈椎脱白处死,取出胎鼠,详细 NTDs 胎鼠模型建立方法参考课题组既往报道5。3.组织样本收集:取出胎鼠后置于预冷的 PBS中,其中对照组选取发育正常胎鼠,低叶酸联合 MTX实验组选取 NTDs 表型明显的胎鼠,解剖其神经组织,自前脑嘴端至后脑微端,尽可能地分离中胚层或非神经组织,胎脑、脊髓组织分别收集于液氮中保存备用。4.总 RNA 提取:采用 TRIzol 法提取总 RNA,用Dnase消化 DNA,琼脂糖凝胶电泳检测和 Agilent2100 检测 RNA 完整度;Nanodrop 检测 RNA 的浓度和纯度。琼脂糖凝胶电泳图 3 条 rRNA 带清晰可见,RNA 完 整 性 RIN 6.5,RNA 浓 度 100ng/l,总量2g,A260/A280为 1.8 2.2。则 RNA 质量满足建库要求。提取的 RNA 于-80 冻存,用于后续文库制备和测序。5.文库制备与测序:文库制备以及测序由安诺优达基因科技(北京)有限公司完成。cDNA 文库的构建方法参照美国 Illumina 生物技术公司的样品制备试剂盒说明书,文库构建完成后使用 Qubit3.0 和 Ag-ilent 2100 分别检测文库浓度与文库片段长度。浓度 5ng/l,且片段长度集中为 300 400bp,为库检合格。利用 Illumina HiSeq2500 平台,以 2 150bp 双端测序模式进行高通量测序,并使用 TrimGalore 法对原始测序数据过滤,得到高质量的 Clean Data。使用HISAT2 软件将过滤和质量控制后的序列和参考基因组进行比对,利用 FPKM(Fragments per Kilobase perMillion Mapped Fragments)方法对已知的基因和转录本进行表达定量。6.差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)分析:采用 DESeq 软件分析低叶酸联合 MTX实验组与对照组的差异表达基因。Type 为筛选结果,满足 P 1 的为差异基因。其中 log2(fold change)1 标记为上调基因(up);log2(fold change)-1 标 记 为 下 调 基 因(down),不满足上述条件的为非显著差异表达基因。7.差异表达基因的 GO(gene ontology)分析:基于筛选出的 DEGs,采用 R 包 cluster Profiler 对差异表达基因进行基因功能分类分析,来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO 是国际标准化的基因15医学研究杂志 2024 年 3 月第 53 卷第 3 期论著功能分类体系,GO 总共有 3 类,分别描述基因的生物学过程(biological process,BP)、细胞组分(cellularcomponent,CC)、分子功能(molecular function,MF)。本研究按照此 3 类对差异表达基因进行筛选。8.差异表达转录因子基因分析:转录因子(tran-scription factor,TF)是一群能与基因 5-端上游特定序列专一性结合,从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。选取筛选出的 DEGs,通过与动物物种 AnimalTFDB(Ani-mal Transcription Factor DataBase)比较,预 测 DEGs是否是差异表达转录因子基因,以及所属的转录因子家族。9.统计学方法:应用 SPSS 23.0 统计学软件对数据进行统计分析。组间均数比较采用独立样本 t 检验,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.低叶酸联合 MTX 诱导小鼠 NTDs 模型构建情况:通过对适龄母鼠喂养低叶酸饲料,并在受孕 7.5天时对母鼠进行腹腔注射 MTX,可成功诱导出具有明显NTDs表型的胎鼠。受孕9.5天取出胎鼠,通过体式显微镜观察可见:对照组胎鼠外观上较为饱满圆润,各脑室发育良好,神经管已完全闭合;低叶酸联合MTX 实验组表现出脊柱裂、脑裂等,提示 NTDs 的表型,详见图 1。图 1对照组和低叶酸联合 MTX 实验组受孕 9.5 天胎鼠外观A.正常胎鼠;B.NTDs 表型胎鼠,箭头所指部位为缺陷部位2.低叶酸联合 MTX 实验组 NTDs 胎鼠的脑组织基因表达分析:对低叶酸联合 MTX 实验组和对照组的胎 鼠 脑 组 织 转 录 组 分 别 进 行 测 序、分 析,使 用DESeq 软件确定 DEGs。结果显示,低叶酸联合 MTX实验组与对照组比较,共有 939 个 DEGs,其中 406 个显著上调,533 个显著下调,P 0.05,DEGs 火山图详见图 2A。从 BP、CC 和 MF 3 类对差异表达的上调和下调基因进行筛选、分析,结果显示按 CC 分类,上调的基因主要是细胞、细胞器及蛋白复合物的基因,下调的基因主要是细胞、细胞器及细胞膜的基因,下调的基因和上调的基因在该分类基本一致;按 BP 分类,上调的基因主要是细胞过程、生物调节、发育过程及代谢过程的基因,下调的基因和上调的基因在该分类基本一致;按 MF 分类,上调的基因主要是蛋白结合、转录调节活性、分子功能调节因子及催化活性的基因,下调的基因和上调的基因在该分类一致,详见图 2B。差异转录因子分析显示,筛选出的 DEGs,通过与Animal TFDB 数据库比较,预测脑组织中有 191 个基因属于差异表达转录因子基因,其中 104 个显著上调,87 个显著下调,P 0.05,通过与蛋白家族比对,发现转 录 因 子 主 要 聚 焦 在 Homeobox、zf-C2H2、bHLH、STAT 等家族,结果详见图 2C。3.低叶酸联合 MTX 实验组 NTDs 胎鼠的脊髓组织基因表达分析:对低叶酸联合 MTX 实验组和对照组的胎鼠脊髓组织转录组分别进行测序、分析,使用DESeq 软件确定 DEGs。结果显示,低叶酸联合 MTX实验组与对照组比较,共有 879 个 DEGs,其中 268 个显著上调,611 个显著下调,P 0.05,DEGs 火山图详见图 3A。从 BP、CC 和 MF3 类对差异表达的上调和下调基因进行筛选、分析,结果显示按 CC 分类,上调和下调的基因主要是细胞、细胞器及蛋白复合物等的基因;按 BP 分类,上调和下调的基因主要是细胞过程、生物调节及发育过程的基因;按 MF 分类,上调和下调的基因主要是蛋白结合、转录调节活性、分子功能调节因子及催化活性的基因。脊髓组织 DEGs 与脑组织的基本一致,详细结果详见图 3B。差异转录因子分析显示,脊髓组织中有 195 个基因属于差异表达转录因子基因,其中 41 个显著上调,154 个显著下调,P 0.05,通过与蛋白家族比对,发现转录因子主要聚焦在 zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT 等家族,结果详见图 3C。4.低叶酸联合 MTX 实验组 NTDs 胎鼠的脑和脊髓组织 DEGs 比较分析:比较两种组织中的 DEGs 发现,9.5 天的 NTDs 胎鼠的脑组织和脊髓组织的 DEGs分别有 939、879 个,其中有 185 个 DEGs 同时在脑组织和脊髓组织中的转录表达受到影响。对比两种组织中预测的差异转录因子发现,在脑组织和脊髓组织中分别有的 191、195 个差异转录因子中,有 31 个为相同的转录因子,结果详见图 4。25论著J Med Res,March 2024,Vol.53 No.3图 2低叶酸联合 MTX 实验组 NTDs 胎鼠脑组织 DEGsA.DEGs 火山图,横坐标为实验组基因表达倍数变化,纵坐标为表达量变化的统计学显著程度,不同颜色表示不同分类的基因,其中蓝色代表显著下调基因,黄色代表显著上调基因,灰色代表不显著差异基因;B.DEGs 的 GO 功能分析柱状图,横坐标为功能分类或细胞定位,左纵坐标为基因数目所占百分比,右纵坐标为基因数目;C.差异转录因子蛋白家族分布图,纵轴表示不同转录因子家族,横轴表示注释到该转录因子下 DEGs 的个数讨论叶酸在体内经酶催化生成活性的四氢叶酸,四氢叶酸作为一碳基团转移酶的辅酶,参与碱基的合成、氨基酸之间的相互转化以及 DNA 和蛋白质等多种物质的甲基化,进而影响体内多种与发育相关的基因和通路的调控。胎儿早期生长发育中,对核酸和蛋白质的合成需求最为旺盛,这一阶段如果叶酸缺乏,对胎儿发育的影响更为严重。MTX 作为抗叶酸类抗代谢药,可抑制有生理活性的四氢叶酸合成。本研究使用的小鼠模型采用低叶酸饮食喂养,模拟动物体内低叶酸的生理环境,神经管闭合关键期在孕鼠腹腔注射 MTX,既排除了单纯叶酸缺乏饲喂并不能导致小鼠 NTDs 的不足,又排除了单纯 NTX 诱导小鼠 NTDs 不能更好模拟体内叶酸缺乏生理状态的缺陷5。因此在该动物模型基础上检测胚胎神经发育关键时期脑组织和脊髓组织基因的表达变化,对推论低叶酸环境可能影响人胚胎期神经组织发育的功能基因及转录因子的参考意义较大。本研究选取受孕 9.5 天胎鼠脑组织和脊髓组织,转录组测序结果直接反映了神经管发育当时基因转录表达变化,而不是神经管发育完成状态下的情况。通常小鼠神经管发育时期为 7.5 10.5 天。从受孕7.5 天开始出现神经板;受孕 8 天,后脑和颈部交界的第一闭合点以拉链方式同时向头侧方向和尾侧方向进行,分别形成将来的脑和脊髓;受孕 9 天,位于中前脑和中脑的第二闭合点向头尾两端闭合;位于前脑喙末端的第三闭合点单向闭合6。本研究在受孕7.5 天通过腹腔注射 MTX 进行诱导 NTDs,并在受孕9.5 天可以观察到神经管正常完整发育外观以及畸形外观时取材,能更准确反映发育阶段的即时情况。与同类型畸形胎鼠研究取材时间 10.5、11.5、13.5 天35医学研究杂志 2024 年 3 月第 53 卷第 3 期论著图 3低叶酸联合 MTX 实验组 NTDs 胎鼠脊髓组织差异表达基因图 4低叶酸联合 MTX 实验组 NTDs 胎鼠的脑和脊髓组织 DEGs 对比图比较,能更好地反映发育当时的情况4,7,8。RNA-seq 结果显示,低叶酸联合 MTX 实验组转录组学发生明显改变,DEGs 功能主要与神经细胞发育、转录调节有关。脑组织 DEGs 功能不论是按 BP、CC 还是 MF 进行分类,DEGs 的上调和下调基因出现同时富集在同一生物学功能的情况,说明该生物学功能的基因出现了表达的紊乱。脊髓组织 DEGs 功能在各分类中结果与脑组织的相似。该结果反映出低叶酸联合 MTX 同时影响胎鼠脑组织和脊髓组织的发育,并且产生了相似的影响。叶酸代谢对细胞中发生的甲基化反应至关重要,包括 DNA 和组蛋白甲基化。DNA 甲基化是由叶酸代谢产生的一碳基团作为甲基供体来源,可以调控基因的表达及沉默,参与胚胎发育及多种疾病的进展,是表观遗传修饰研究中最广泛、最具特征的一类。组蛋白甲基化也是叶酸代谢产生的一碳基团作为甲基供体来源,研究表明大量与组蛋白 H3 第 79 位赖氨酸二甲基化(H3K79me2)相结合的基因处于转录激活的状态,H3K79me2 对基因的转录调控发挥着激活作用9。在全基因组范围内有 280 个发育相关的基因在人胚胎干细胞中接受 H3K79me2 的调控。研究还表明,叶酸还可以影响组蛋白乙酰化水平,从而影45论著J Med Res,March 2024,Vol.53 No.3响下游基因的转录和表达10。因此叶酸通过表观遗传修饰作用对基因的转录和表达的影响相当广泛。在本实验研究中,实验组与对照组比较,脑、脊髓组织基因转录组分别有 939、879 个 DEGs,受影响的基因数量较多。其中分别有 191、195 个基因属于差异表达转录因子基因。在脑组织和脊髓组织的差异表达转录因子基因中,通过与蛋白家族比较,发现转录因子主要聚焦在zf-C2H2、bHLH、Homeobox、STAT 等转录因子家族。因转录因子家族涉及到转录因子数量较多,还需要后续进一步深入的研究。课题组的另一项通过抑制叶酸代谢物参与 DNA 合成诱导小鼠 NTDs 的研究结果发现,bHLH 家族的一员 Hes3 表达异常,同时有研究发现,该转录因子与神经管的发育密切相关11,12。本研究仅 是在低叶酸 饲喂联合 MTX 诱 导 的 小 鼠NTDs 模型的基础上,对可能影响的神经组织发育的功能基因及转录因子的初步探索,可为 NTDs 发生机制的研究提供思路。综上所述,低叶酸联合 MTX 能够引起胎鼠神经组织基因组的转录改变,DEGs 主要是以神经细胞发育、转录调节基因为主,叶酸可能通过调节功能相关基因的表达来影响胚胎神经组织的发育,但其具体机制尚有待于进一步探讨。利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1 Czeizel AE,Duds I.Prevention of the first occurrence of neural tubedefects by periconceptional vitamin supplementation J.N Engl JMed,1992,327(26):1832-18352 Berry RJ,Li Z,Erickson JD,et al.Prevention of neural-tube de-fects with folic acid in China.China-U.S.Collaborative Project forNeural Tube Defect Prevention J.N Engl J Med,1999,341(20):1485-14903 Wang L,Wang F,Guan J,et al.Relation between hypomethylationof long interspersed nucleotide elements and risk of neural tube defectsJ.Am J Clin Nutr,2010,91(5):1359-13674 Pei P,Cheng X,Yu J,et al.Folate deficiency induced H2A ubiquit-ination to lead to downregulated expression of genes involved in neuraltube defects J.Epigenetics Chromatin,2019,12(1):695 裴培,崔小岱,张霆,等.低叶酸联合甲氨蝶呤诱导神经管畸形小鼠模型 的 建 立 J.中 华 神 经 外 科 杂 志,2019,35(2):193-1966 Ji Y,Hao H,Reynolds K,et al.Wnt signaling in neural crest onto-genesis and oncogenesis J.Cells,2019,8(10):11737 王秀伟,官臻,朱智强,等.5-氟尿嘧啶对早期胚胎发育的影响J.中国优生与遗传杂志,2020,28(2):239-2428 Cheng X,Pei P,Yu J,et al.F-box protein FBXO30mediates retin-oic acid receptor ubiquitination and regulates BMP signaling in neu-ral tube defects J.Cell Death Dis,2019,10(8):5519 Zhou VW,Goren A,Bernstein BE.Charting histone modificationsand the functional organization of mammalian genomes J.Nat RevGenet,2011,12(1):7-1810Boshnjaku V,Ichi S,Shen YW,et al.Epigenetic regulation of sen-sory neurogenesis in the dorsal root ganglion cell line ND7 by folicacid J.Epigenetics,2011,6(10):1207-121611王秀伟,官臻,朱智强,等.5-氟尿嘧啶对神经管畸形胎鼠脑组织基因表达的影响 J.发育医学电子杂志,2020,8(3):213-21912Hong CS,Saint-Jeannet JP.The b-HLH transcription factor Hes3participates in neural plate border formation by interfering with Wnt/-catenin signaling J.Dev Biol,2018,442(1):162-172(收稿日期:2023-06-30)(修回日期:2023-07-12)基金项目:国家自然科学基金青年科学基金资助项目(82002015)作者单位:200233上海交通大学医学院附属第六人民医院麻醉科通信作者:刘鹏昊,电子信箱:shjdlph ;崔德荣,电子信箱:cuishuning118 SIRT3 缺陷对脓毒症心肌损伤的影响及作用机制徐天华刘鹏昊崔德荣摘要目的探讨 SIRT3 缺陷对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒症心肌损伤的影响及作用机制。方法通过对 SIRT3 基因敲除(SIRT3-/-)小鼠及野生型(wild type,WT)小鼠进行 LPS(10mg/kg)腹腔注射 24h 制备脓毒症心肌损伤模型,等体积 0.9%氯化钠溶液(normal saline,NS)腹腔注射作为对照,设立 WT-NS 组、WT-LPS 组、SIRT3-/-LPS 组、SIRT3-/-NS 组。通过对人心脏微血管内皮细胞进行 LPS(10g/ml)刺激 24h 制备细胞损伤模型。正常培养作为对照,使用 SIRT3 过表达慢病毒及阴性对照病毒进行细胞转染,设立对照组、LPS 组、LPS+SIRT3 过表达组、阴性对照病毒组。采用心脏超声检测各组小55医学研究杂志 2024 年 3 月第 53 卷第 3 期论著