鉴别感染羊驼4种病毒多重PCR检测方法的建立.pdf

02-06ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 3-0 5-302023,53(09):1102-1107中国兽医科学D0I:10.16656/j.issn.1673-4696.2023.0148中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96(2 0 2 3)0 9-11鉴别感染羊驼4种病毒多重PCR检测方法的建立于远光1，岳涛,马晓宁,张永兴1*,王萌,曾巧英,刘艳红1，高闪电1,独军政,吴锦艳1,李坤1,许小红3（1.中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室，甘肃兰州730046;2.甘肃农业大学，甘肃兰州730070;3.甘肃省疾病预防控制中心，甘肃兰州730000)摘要：为了建立一种用于羊驼易感的羊口疮病毒（ORFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)、口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)鉴别的多重PCR检测方法，根据GenBank中公布的ORFV、BVD V-1、FM D V和BTV参考株基因序列分别设计特异性引物，优化引物、dNTP、T a q D NA 聚合酶浓度及退火温度，通过敏感性和重复性检验，并对6 0 份羊驼粪便样品和35份羊驼咽拭子样品进行验证。结果显示，所建立的多重PCR方法能够有效区分ORFV、BVD V-1、FM D V和BTV，最低检测限分别为3.18 X104copies/L、3.13X10 1c o p i e s/L、3.0 6 X10 1c o p i e s/L、2.9510 2 c o p i e s/L。结论：所建立的多重PCR方法能够同时快速鉴别羊驼感染的ORFV、BVD V-1、FM D V和BTV，具有较高的应用价值。关键字：羊驼；口蹄疫病毒；羊口疮病毒；蓝舌病病毒；牛病毒性腹泻病毒；多重PCRDevelopment of a multiplex PCR assay for identificationof 4 viruses in alpacaYU Yuan-guang,YUE Tao,MA Xiao-ning,ZHANG Yong-xing*,WANG Meng”,ZENG Qiao-ying”,LIU Yan-hong,GAO Shan-dian,DU Jun-zheng,WU Jin-yan,LI Kun,XU Xiao-hong?(1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute,ChineseAcademy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China;2.Gansu A gricultural University,Lanzhou 730070,China;3.Gansu Provincial Center for Dise ase Control and Prevention,Lanzhou 730000,China)Abstract:To establish a multiplex polymerase chain reaction(multi-PCR)assay for identificationof sheep mouth sore virus(ORFV),bovine viral diarrhea virus(BVDV-1),foot-and-mouth disease virus(FMDV),bluetongue virus(BTV)in alpaca,4 specific primers were designed according to sequences of thefour pathogens from GenBank,respectively,and the multi-PCR assay was optimized for the concentrationof primers,dNTP and Taq DNA polymerase,the annealing temperature,the sensitivity and reproducibilitywere verified,60 stool samples and 35 throat swab samples taken from laboratory alpacas were assayed.The results indicated that this multi-PCR method can distinguish ORFV,BVDV-1,FMDV and BTV,the sensi-bility was 3.18104 copies/L ORFV,3.13X10 copies/L BVDV-1,3.06X10 copies/LFMDV and 2.95X102copies/L BTV,respectively.In conclusion,the multi-PCR assay developed in this study can efficientlyidentificate ORFV,BVDV-1,FMDV and BTV,representing a useful technique for rapid detection of theviruses.Key words:alpaca;foot-and-mouth disease virus;sheep orf virus;bluetongue virus;bovine viral收稿日期：2 0 2 3-0 3-13；修回日期：2 0 2 3-0 5-2 4基金项目：中央引导地方科技发展资金项目（YDZX20216200004349）；甘肃省科技计划项目（2 2 JR5RA715）作者简介：于远光（198 0-），男，甘肃安定人，助理研究员，硕士，主要从事实验动物管理，E-mail：y u y u a n g u a n g c a a s.c n。*通讯作者：张永兴（196 3-），男，甘肃庄浪人，高级实验师，硕士，主要从事实验动物管理，E-mail：z h a n g y o n g-。1103于远光等：鉴别感染羊驼4种病毒多重PCR检测方法的建立第9 期diarrhea virus;multiplex PCR*Corresponding author:ZHANG Yong-xing,E-mail:羊驼是原产于南美洲的骆驼科动物，体型小、性格温顺。2 0 世纪90 年代，科研人员在骆驼科动物外周血中发现了一种天然缺失轻链的抗体，该抗体具有分子质量小，特异性强，亲和力高，可穿透血脑屏障，能在原核或真核系统中高表达，人对该种抗体的免疫原性弱等特点。生命科学研究领域将羊驼作为实验动物用于驼绒、育种、胚胎移植、行为观察、疾病诊断、遗传、疫苗开发、肿瘤、免疫学、纳米抗体、心血管疾病等领域的研究，当前最为热门的是利用羊驼开发纳米抗体药物和疾病检测研究。为了支持科研，甘肃等省份已向一些科研单位颁发了羊驼实验动物使用许可证。羊驼易感染和可携带的病原微生物众多，使用未经病原检测和微生物质量控制的羊驼，不但可能造成实验失败，而且会造成重大生物安全事件。虽然国家标准GB/T14922.2实验动物微生物学等级及监测GB/T14922.1实验动物寄生虫学等级及监测中均有明确规定，作为实验动物须排除羊驼易感染的烈性传染病、人兽共患病以及对实验影响大的病原微生物和寄生虫。羊驼易于感染和携带的病毒,直接影响实验用羊驼的健康,对实验数据的准确性和科研人员的健康影响较大，需在实验前进行排除。目前，国内还没有专门针对羊驼易感和易携带的病原微生物建立的质量控制标准，呕需制定相关的标准。甘肃省依据我国实验动物质量控制标准，制定了甘肃省地方标准实验动物羊驼微生物寄生虫学等级及监测,其中明确了实验用羊驼必须检测并排除羊口疮病毒(orfvirus,ORFV)、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)感染。羊口疮又称羊传染性脓疱皮炎，是由羊口疮病毒引起的一种接触性、嗜上皮性传染病，主要感染绵羊与山羊、羊驼等动物，是通过接触传播的人兽共患病1。主要症状为鼻、口腔、蹄部等周围出现丘疹、水疱和溃疡2 。牛病毒性腹泻病是由牛病毒性腹泻病毒感染所引发的高热、腹泻、口腔和消化道黏膜糜烂坏死、呼吸系统疾病、妊娠母牛流产或胎儿畸形、白细胞减少、免疫抑制等一系列复杂症状的一种传染病3。牛病毒性腹泻病毒主要感染牛，同时也能引起羊驼、猪、绵羊、骆驼等动物的发病4。口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物传染病,其特征是唇、舌部、牙龈、软颚、冠状沟、趾间、乳头等部位表皮糜烂，特牛心肌出现淡黄色或灰白色的带状或点状条纹,形似虎皮5。口蹄疫具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点。牛对口蹄疫病毒最易感，羊驼、猪、绵羊、山羊也可感染发病。蓝舌病是由蓝舌病病毒引起的主要感染反动物的传染性疾病,该病经库螺属昆虫传播6 。蓝舌病以发热、口鼻和胃肠道黏膜溃疡性炎症、白细胞减少、后躯肿胀、发为特征。我国于197 9年在云南省师宗县首次发现绵羊蓝舌病的流行，并成功分离到BTV。针对羊驼易感病毒病的现状和实验动物的微生物质量控制要求，建立一种灵敏度高、特异性强的检测手段是非常必要的。当前国内外针对羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病病毒虽然已经分别建立了PCR检测方法，还没有建立一种能同时鉴别羊驼易感的这4种病毒的多重PCR检测方法。本研究拟建立能同时鉴别ORFV、BVDV-1、FM D V、BT V的多重PCR方法，为实验用羊驼微生物质量控制及羊驼疾病的防控提供参考和有效的技术手段。1材料与方法1.1核酸提取物羊口疮病毒核酸提取物、牛病毒性腹泻病毒I型(BVDV-1)核酸提取物、口蹄疫病毒核酸提取物和蓝舌病病毒核酸提取物均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供1.2仪器和试剂PCR仪为赛默飞世尔科技有限公司的产品。台式高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司的产品。电泳仪为北京六一仪器厂产品。DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、HiScript II QRT Superfor qPCR试剂盒均为诺唯赞生物科技有限公司的产品。2 FastTaqPremix为吐露港生物科技有限公司的产品。绿色荧光核酸染料10 0 0 0、DNA分子质量标准均为索莱宝生物科技有限公司的产品。1.3引物的设计与合成根据GenBank网站发布的ORFV、BV D V-1、FMDV和BTV参考株的基因序列设计特异性引物（见表1)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1104第53卷中国兽医科学表1所用的引物序列Table 1 Primer sequences used引物名称序列(5 3)长度/bpPrimernamesSequencesSizesORFV-2B-FGGCGTCAACTACTACAAGGTCAAGG159ORFV-2B-RGGTGGAGTAGAGCCCGAGGTTCBVDV-1-5UTR-FGGACTAGCAAAACAAGGAGGGTAGC207BVDV-1-5UTR-RCAGGCTGTATTCGTAGCGGTTGGFMDV-3D-FGACAAAGGTTTTGTTCTTGGTC275FMDV-3D-RCAACGCAGGTAAAGTGATCTGBTV-S10-FCCGGGCTGATCCAAAGGTTC384BTV-S10-RCAACAACCGCCGCTATCAGT1.4人工质粒标准品的制备根据ORFV、BVD V-1、FM D V和BTV的参考株基因ORFV-2B、BVD V-1-5 U T R、FM D V-3D 和BTV-S10序列人工合成片段，并连接至含有氨苄青霉素抗性基因的pUC57载体上，转化至TOP10细胞中,筛选阳性菌落扩大培养,抽提质粒，进行PCR、酶切鉴定及测序验证1.5多重PCR方法的建立与优化分别提取BVDV-1、FM D V、BT V的RNA并反转录为cDNA,提取ORFV的DNA,这4种DNA分别作为后续PCR模板。通过优化引物浓度和退火温度等反应条件，建立50 L反应体系：2 XFastTaqPre-mix25L,4对特异性上、下游引物（浓度为1mol/L)设置体积梯度加入反应体系,DNA模板各1L，用灭菌双蒸水补足至50 L。采用梯度法对退火温度（53、54、55、56、57、58）和引物用量（0、0.15、0.2 5、0.50、0.7 5、1.0 0 L）等反应条件进行优化。1.6多重PCR的敏感性试验测定4种质粒标准品，换算成拷贝数，10 倍梯度稀释作为样品，ddHzO为阴性对照，以优化的条件进行多重PCR。1.7多重PCR的重复性试验取质量浓度为0.1g/L的标准质粒为模板，在优化条件的基础上先后进行2 组重复试验，作为组间对照，每组设3个相同的反应体系，作为组内对照，验证该方法的可重复性。1.8临床样品的检测利用建立的该方法对采集的95份临床样品进行检测,同时所有样品进行单一PCR检测,将单一PCR与多重PCR得出的结果进行对比,得出该多重PCR在临床试验中的检出率与准确率。2丝结果2.1多重PCR方法的建立与优化在单一PCR基础上对多重PCR条件进行优化，确定最佳退火温度为56（见图1),ORFV、BVD V-1、FMDV和BTV最佳引物终浓度均为0.0 1mol/L，引物用量为0.5L(见图2)。以ORFV核酸提取物、BVDV-1、FM D V和BTV核酸反转录产物为模板，扩增出了4条预期大小的目的条带，分别为159、207、2 7 5和38 4bp，而阴性对照未扩增出任何条带(见图3）。M1234561500bp1000bp800P600bp400 bp200bp图1退火温度的优化Figure 1Optimization of annealing temperatureM:DNA分子质量标准；1:53;2:54;3:55;4:56;5:57；6:58。M:DL1500DNAMarker;1:53;2:54;3:55;4:56;5:57;6:58.M1234561500bp1000bp800bp600bp400 bp200bp图2 引物浓度的优化Figure 2Optimization of primer concentrationM:DNA分子质量标准；1:0 mol/L;2:0.003mol/L;3:0.005mol/L；4:0.010mol/L;5:0.015mol/L;6:0.020mol/L。M:DL1500 DNA Marker;1:0 mol/L;2:0.003 mol/L;3:0.005 mol/L;4:0.010mol/L;5:0.015mol/L;6:0.020mol/L.M1234561500bp1000bp800bp6006P400bp200bp图3多重PCR的优化Figure 3 Optimization of multiplex PCRM:DNA分子质量标准；1：阴性对照；2:ORFV2B;3:BVDV-15UTR；4:FMDV3D;5:BTVS10;6:ORFV2B+BVDV-15UTR+FMDV3D+BTVS10。M:DL1500 DNA Marker;1:Negative control;2:ORFV 2B;3:BVDV-15UTR;4:FMDV3D;5:BTV S10;6:ORFV2B+BVDV-15UTR+FMDV3D+BTVS10.1105于远光等：别感染羊驼4种病毒多重PCR检测方法的建立第9 期2.2敏感性试验换算4种重组质粒的拷贝数，ORFV标准质粒拷贝数为3.18 10 1copies/L、BVD V-1标准质粒拷贝数为3.13X101copies/L、FM D V标准质粒拷贝数为3.0 6 10 1copies/L、BT V标准质粒拷贝数为2.9510 1copies/L；将4种质粒分别按10 倍梯度稀释后作为多重PCR模板,以ddH,O为阴性对照进行多重PCR，结果（见图4)显示：ORFV最低检测限为3.18 10 4copies/L,BVDV-1最低检测限为3.1310 copies/L,FMDV最低检测限为3.0610copies/L,BTV最低检测限为2.9510 2copies/L，而阴性对照无扩增条带。M1123456789101500bp1000bp8005P6006P400bp200bp图4多重PCR检测4种病毒的敏感性试验Figure 4Specificity test of multi-PCR for ORFV,FMDV,BTV andBVDV-1M:DNA分子质量标准；19：质粒浓度分别是10 copies/L,107copies/L,10 copies/L,105 copies/L,10 copies/L,10 copies/L,102copies/L,10copies/L,10copies/L;10:阴性对照。M:DL1500 DNA Marker;1-9:Plasmids concentrations were 108copies/L,107 copies/L,106copies/L,1055copies/L,104copies/L,103copies/L,102copies/L,1011copies/L,10ocopies/L,respectively;10:Negative control.2.3重复性试验以质量浓度为0.1g/L的标准质粒为模板，先后进行2 组重复试验，作为组间对照，每组设3个相同的反应体系，作为组内对照。结果(见图5)显示,组间对照和组内对照结果一致。M1234561500bp1.000bp800P600400bp384bp2751200bp159p图5多重PCR的重复性检测Figure 5Repeatability test of multiplex PCR for ORFV,FMDV,BTV and BVDV-1M:DNA分子质量标准；1,2,3：第一批次的3个重复试验；4,5,6：第二批次的3个重复试验。M:DL1500 DNA Marker;1,2,3:3 replicates for the first batch test;4,5,6:3 replicates for the second batch test.2.4临床试验用建立的多重PCR方法对6 0 份粪便样品和35份咽拭子样品分别进行检测，结果显示：粪便样本中1份BVDV-1阳性，样品中未检出BVDV-1、FMDV与BTV(见图6);咽拭子样本中有1份ORFV阳性，未检出BVDV-1、FM D V与BTV(见图7)。分别用各引物对分别进行PCR检测的结果与多重PCR的结果一致,说明该多重PCR方法可靠。M123456789 1011 12 131500bp1000bp8006P600bP400bP884200bp图6 粪便样品的多重PCR检测Figure 6Multi-PCR detection of the fecal samplesM:DNA分子质量标准；1 12：均是临床样品；13：阳性对照。M:DL1500 DNA Marker;112:All were clinical samples;13:Positivecontrol.M123456781500bp1000bp8006P600bp400bp200bp图7咽拭子样品的多重PCR检测Figure 7 Multiplex PCR detecting the throat swab samplesM:DNA分子质量标准；1 7：均是临床样品；8：阳性对照。M:DL1500 DNA Marker;1-7:All were clinical sample;8:Positivecontrol.3讨论据报道羊口疮病毒在我国各地均被发现，2 0 0 8年在吉林省暴发的羊口疮，导致小尾寒羊羔羊的发病率和死亡率分别高达41.7%和3.3%7 。2 0 0 9年湖北出现山羊群暴发羊口疮，发病率接近6 0%，死亡率高达2 4.7%8 。2 0 2 0 年新疆阿克苏地区一养殖场暴发羊口疮9。2 0 16 年，常亮等10 对甘肃东部地区的羊场检测ORFV，阳性率均在2 5%以上，最高的达到近6 0%,表明该病在甘肃等地区广泛存在和流行。1980年，我国学者李佑民等11 首次从流产的牛胎儿脾中分离出牛病毒性腹泻病毒长春18 4毒株，后陆续在黑龙江、安徽、广西、山东、云南、新疆、宁夏等多个地区检测到BVDV,且多以BVDV-1型毒株为主。此外,我国还在牛、猪、鹿、骆驼、山羊等1106第53卷中国兽医科学动物体内检测出BVDV12。羊驼感染BVDV后，胃、肠、睾丸、前列腺、肾、腮腺和唾液腺等器官中均可检出BVDV13蓝舌病目前已在我国的2 9个省份检测到,其流行范围呈现扩大趋势14。1995年,Afshar等15 在羊驼体内检测到蓝舌病病毒。Maclachlan等16 报道南美羊驼感染蓝舌病病毒,且其易感性可能与BTV的毒力有关。Henrich等17 研究发现感染蓝舌病的羊驼濒死前出现咳嗽和类似打隔的呼吸症状。死后剖检发现羊驼的舌头、上颚和颊黏膜有糜烂和溃疡，肺部有严重充血、间质性肺炎和肺泡水肿。口蹄疫(FMD)在南美洲、非洲、亚洲和欧洲部分地区均有流行18 。我国贵州、甘肃等地对牛、羊、猪等动物进行口蹄疫流行病学调查发现部分动物血清学检测呈阳性19-2 0 。感染口蹄疫的羊驼可见发热，精神沉郁,食欲减退，行走困难或跛行等症状。Lu-broth等2 1 研究发现，实验羊驼接种FMDV,经2 4h接种部位上皮脱落；经48 h舌面上皮出现大量水疱并破裂。舌面下层间质严重出血。经2 5d口腔黏膜周围有明显的细绳状、泡沫状口腔分泌物。56 d后羊驼的四肢出现了水疱性病变。同时发现同群中未接种FMDV的部分羊驼感染了口蹄疫；与实验接种FMDV的羊驼接触的猪全部发病；这些实验表明羊驼对口蹄疫病毒具有一定的易感性和传播性。多重PCR方法在病原微生物检测方面已经得到了广泛的应用。本研究根据GenBank中公布的ORFV、BVD V-1、FM D V和BTV参考株基因序列设计特异性引物，分别用于扩增曾ORFVB2L基因、BVDV-15UTR基因、FMDV3D基因和BTVS10基因,通过对引物、dNTP、T a q D NA 聚合酶的浓度及退火温度和时间的优化，成功建立了能同时检测上述4种病原的多重PCR方法。并利用该方法对6 0 份羊驼粪便和35份羊驼咽拭子样品进行检测，被检的6 0 份粪便样品中BVDV-1阳性1份，未检出ORFV、FM D V与BTV;35份咽拭子样品中ORFV阳性1份，未检出BVDV-1、FM D V 与BTV,其检测结果与单一PCR检测结果一致。本文建立的多重PCR检测方法具有良好的可重复性和准确性，能够同时快速检测实验用羊驼体内的ORFV、BVD V-1、FMDV和BTV,可大大减少工作量，节约检测成本，具有较高的应用价值。参考文献(References)1HOSAMANLI M,BHANUPRAKSH V,SCAGLIARINI A,et al.Comparative sequence analysis of major envelopeprotein gene(B2L)of Indian Orf viruses isolatedfrom sheep and goatsJJ.Veterinary Microbiology,2006,116(4):317-324.2闫丰超，邵佳，窦永喜.羊口疮病毒分子生物学的研究进展J.中国兽医科学,2 0 13，43（1)：10 3-10 9.YAN Feng-chao,SHAO Jia,DOU Yong-xi.Progress inmolecular biology of Orf virusJ.Chinese Veteri-nary Science,2013,43(1):103-109.(in Chinese)3LANYON S R,HILL F I,REICHEL M P,et al.Bovine 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