焦磷酸测序技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用价值.pdf

中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 24 焦磷酸测序技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用价值 陶 萍 湖北省荆州市第二人民医院，湖北 荆州 434000 摘要摘要：目的 研究在结核分枝杆菌耐药性检测中焦磷酸测序技术的价值。方法 通过生物素标记引物扩增甲基因片段，通过经链亲和素标记的磁珠分离单链模板，对突变区甲基因耐药的序列进行检测，并对结果进行记录，与正常序列比对后对结核分枝杆菌的耐药进行判断。结果 临床分离所得到的结核分枝杆菌株总共有 108 株，检测方法选择绝对浓度法，其中利福平敏感有 44 株（40.74%），耐药菌株有 64 株（59.56%）。本次研究总共得到 108 株菌株，通过不同的方法扩增上下游引物的基因片段，分别对高变区的rpoB基因片段进行处理，最终获得204bp DNA，产物通过琼脂糖凝胶电泳进行相应的处理，获得清晰度较高的 DNA 条带。最终只有 2 株未得到理想的结果，原始为由于制备的误差，其余临床株及 H37Rv 标准株均得到了较为准确的检测结果，其中有 44 株利福平敏感株未获取到 rpoB 基因突变核心区,有 64 株都发生了不同程度的突变，突变的类型总共有 8 种，其中有 2 株属于 511 和 516位点的联合突变，最为常见的突变位点为 531 位和 526 位，531 位突变率为 68.75%,526 位的突变率为 18.75%，所均获得的焦磷酸测序图谱均较为清晰。在检测中突变的野生型结核分枝杆菌并未被发现，DNA 序列测定的结果指出未发生突变的情况，发生了基因突变的结核分枝杆菌，研究显示其 DNA 测序结果和 Pyrosequencing 检测所获取的结果不存在区别，100%完全一致。结论 在结核分枝杆菌耐药性检测中焦磷酸测序技术的运用价值较高，值得在临床上进行推广运用。关键词关键词：结核性腹膜炎；抗原靶蛋白 6；诊断价值；阳性率；灵敏度；特异度 中图中图分类号：分类号：R378 结核病属于一种较为古老的疾病，虽然在抗结核一线药物被成功研发后结核病得到了有效的控制，但全球结核病疫情自80年代起又出现了明显回升的情况，其中大量耐药结核杆菌的出现是结核病回升的较为主要想一个原因。调查研究结果指出，我国结核病的总耐药率约为 28.00%，耐药菌株的出现与的传播在很大程度上影响了结核病的治疗1。如何准确有效的检查结核分枝杆菌的耐药性情况，已经逐渐成为了临床目前对结核病进行有效防治的重要方式。随着临床上对耐药分子机制研究结果的逐步升入，目前主要的结核分枝杆菌发生耐药的子机理为药物作用导致靶基因出现不同程度的突变，这为分子生物学方法在快速的进行结核分枝杆菌耐药性基因检测的运用打下了理论的基础2-3。本次我院就焦磷酸测序技术的相关价值进行研究，报道如下。1 资料与方法 1.1 一般资料 总共从结合病患者的标本中分离提取出结核分枝杆菌 108 株，标准菌株(HyRv)购买于国家菌种保藏中心。以我国结核病细菌学检验规程作为要求进行临床分离株的培养，将培养所获得的菌株进行鉴定和药物敏感试验，所有操作严格按照规程进行。1.2 方法（1）仪器和试剂 Pyrosequencing微 测 序 试 剂 盒、瑞 典PYROSEQUENCINGAB 公司生产的链亲和素包被的磁珠,在全自动焦磷酸测序仪（型号：PSQ96）上进行测序反应。结合缓冲液:1mmol/L EDTA、2mol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl、0.1%Tween20 去离子水溶解,lmol/L HCl 将pH 调节至 7.6；退火缓冲液：2mmol/L MgAc、20mmol/L Tris-Acetate,变性缓冲液:0.5mol/L NaOH；用 4mol/L乙酸将 pH 值调节至 7.6；洗涤缓冲液:10mmol/L TrisAcetae,用 4mol/L 乙酸将 pH 值调节至 7.6。（2）引物设计、合成与标记 参照 GenBank 上公布的 rpoB 基因序列对 PCR 引物中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 25 的序列进行设置，对 rpoB 基因的片段进行扩增处理，对含 81 bp 高突变的核心扩增区域进行选择，选择长度为 204 bp，F:5GTCCGGGAGCGGATGACCACCC3为上游引物序列,其中选择生物素标记下游引物 R:5-GCTCACGTGACAGACCGCCG-3，测 序 引 物 序 列Pseq1:GCGATCAAGGAGTTC，Pseq2:TCATGGACCAGAACAA。（3）DNA 提取和 PCR 扩增 将在罗氏培养基（改良版）中保存的结核分枝杆菌提取接种到培养基中，在 37的环境下对分离所得的结核杆菌进行培养，培养时间选择：2 周3 周，从培养皿中将 lml 液体培养物取出，在热水浴中进行灭活处理，灭活处理的时间：30min，结核杆菌菌株的离心时间时间：10min，离心速度设置为：10000r/min，在完成离心处理后对下沉物质进行提取，将结核杆菌菌体在双蒸水中进行沉淀和洗涤处理，沉淀后在 50l裂解液中进行重悬处理，放置在水浴中，放置时间：1h，设置温度：50，通过沸水浴对提取物进行处理，处理时间设置为：10min，最终得到的上清液，对获得的上清液进行 PCR 扩增处理，对 4 种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度进行调整，最终调整的浓度为 0.2mmol/L，最终获得的上、下游引物的终浓度为 0.4molL，提取DNA 模板 50 ng,94条件下与 DNA 聚合酶进行 5 min的预变性处理，然后静置在 95环境中，放置时间：30s，65环境中，放置时间：30s,72环境中，放置时间：30s，进行循环处理，次数为 50 次，最后 PCR扩增时间：10min，操作环境温度：72。取 PCR 产物2l 进行在电泳下进行处理，在 2%琼脂糖凝胶中以 12 V/cm 的速度将所获得的提取物进行电泳处理，处理时间：20 min，在紫外灯下将完成上述处理后的产物对扩增效果进行检查。（4）PCR 产物的焦磷酸测序 将 PCR 产物进行固定处理：分别加入到 PCR 板中获得混合物，在涡旋振荡器中在常温环境下振荡处理混合物，处理时间设置为：20 min，使 PCR 产物能够成功在磁珠上进行固定。单链模板的纯化处理：将空泵打开，提取样品放置在 PCR 板中，在真空样晶转移器上检查磁珠的吸附情况并记录，选择成功结合后的磁珠，将乙醇（浓度为 70%）放置到样品转移器中（真空环境），对提取物进行轻微的振荡处理，振荡时间设置为：5s，然后在变性缓冲液中抽吸产物，抽吸时间设置为：5s，将变性处理后获得的 DNA 进行纯化，最终得到单链的 DNA模板，最后对 DNA 单链模板进行清洗处理，清洗时间设置为：5s10s，继续对未固定的单链 DNA 进行洗涤，最终得到所需要的模板并进行测序操作。引物的杂交处理：焦磷酸测序微孔板孔中逐个先加入退火缓冲液（约 501），下调测序引物的浓度到 0.2mmol/L，将样品转移到微孔板中，关闭真空泵，混合引物,在 80的环境下对混合物进行变性处理，时间设置为 2min，然后冷却到室温后杂交处理引物和模板。焦磷酸进行测序：选择 PSQ96MA 测序仪和试剂盒，按顺序在试剂仓中加入底物、酶和 4 种 dNTPs，对碱基加入的顺序进行设定，进行测序，完成特异性的DNA 合成，同时通过酶促反应诱发光信号，通过检测发光信号的情况来对结核杆菌菌株的核苷酸序列进行确定。突变位点的确定：选择 ldentifire 软件进行位点分析，比较不同菌株基因序列的差别，对结核分枝杆菌突变的的位置进行定位，并对类型进行确定。直接测定 PCR 序列：按照上述的条件对所有需要检测的菌株进行 PCR 扩增处理，并进行 PCR 产物最后的测序验证。2 结果 2.1 试验结果 通过绝对浓度法测定 108 株临床分离所得到的菌株，其中 44 株属于利福平敏感，所占比例为 40.74%，64 株属于耐药，比例为 59.56%。2.2 扩增 rpoB 基因片段 分别用上、下游引物对含 81bp 高变区的 rpoB 基因片段对结核分枝杆菌菌株进行扩增处理，获得所需要的 204bp DNA 片段，取 2lPCR，选择琼脂糖凝胶对PCR 产物进行电泳处理，获得清晰可见的 DNA 条带。2.3 焦磷酸测序 最终只有 2 株未得到理想的结果，原始为由于制备的误差，其余临床株及 H37Rv 标准株均得到了较为准确的检测结果，其中有 44 株利福平敏感株未获取到rpoB 基因突变核心区,有 64 株都发生了不同程度的突变，突变的类型总共有 8 种，其中有 2 株属于 511 和516 位点的联合突变，最为常见的突变位点为 531 位和中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 26 526 位，531 位突变率为 68.75%,526 位的突变率为18.75%，所均获得的焦磷酸测序图谱均较为清晰。2.4 验证测序结果 未检测到突变的野生型菌株，测定结果未发现 DNA序列有突变的情况，所得到的 DNA 测序结果与Pyrosequencing 检测结果完全一致。3 讨论 耐药率高是我国结核病的特点之一，耐药结核病在初治患者中的发生率为 28.00%，复治患者中更是高达约 40.00%，因此研发出一种准确、快速耐药性检测方法有着较为重要的临床意义4。比例法或以培养为基础的绝对浓度法是目前临床最为常用的一种方法，所利用的仪器简单且不昂贵，但检查结果等待时间较长，约需要 4 周6 周，难以有效及时的为临床医生对患者的诊断与治疗提供依据。在最近几年，出现了许多的检测手段检测药敏基因，均可以在2d内得到检查结果，与传统方法相比能在短时间内获得检查结果，但有一定的缺点，PCR-SSCP 法不能有效定位突变部位，我不能确定突变的性质，LiPA 和基因芯片法不能有效降缺失突变和插入类型突变检查出来5-7。焦磷酸测序技术是运用四种不同的酶进行酶促反应作用于两个底物，属于一种实时分析的研究技术,4种酶为：荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sufurylase）、DNA 聚合酶（DNA polymerase），每添加一个 dNTP 在一轮测序反应中，引物末端与 dNTP 在 DNA 聚合酶的作用下产生共价键，释放出 1 分子焦磷酸（PPi），而且模板结合的 dNTP 的量与 PPi 的量关系互为正比，PPi 在酶的催化作用下与 APS 结合产生 ATP，在催化下 ATP又和荧光素结合获得氧化荧光素，氧化荧光素发出的可见光信号高低与 ATP 的水平互为正比，通过 CCD 光学系统的使用能够将可见光的信号转换为一个可以测量的峰值，通过对检测峰的检测与判读来确定样品碱基序列的组成8-10。目前焦磷酸测序技术已被广泛应用在分子诊断、药物基因组学等多个不同的临床领域11-12。本次我院最初进行的实验时设计的测序引物共 3条，出现了部分序列重叠，重新结合上述的结果对测序引物进行了改变，并对碱基加入的顺序进行调节，对 PCR 在保证单链质量的前提下进行扩增处理，也可以通过 Fl 和 F2 精读 80bp 以上的序列，能够在一定的程度上降低实验所花费的成本。通过绝对浓度法测定临床分离的108株结核分枝杆菌株，从研究结果可知，44 株（40.74%）为利福平敏感，64 株（59.56%）为耐药。最终只有 2 株的结果不太理想，造成此结果的原因为制备流程中产生的误差，其余临床菌株及标准株均的检测结果均较为准确，其中有 44 株利福平敏感株未得到 rpoB 基因突变核心区,有 64 株都发生了不同程度的突变，突变的类型总共有 8 种，其中有 2 株属于511 和 516 位点的联合突变，最为常见的突变位点为531 位和 526 位，531 位突变率为 68.75%,526 位的突变率为 18.75%，所均获得清晰的焦磷酸测序图谱。未检测到突变的野生型菌株，不存在 DNA 序列突变，所得到的 DNA 测序结果与 Pyrosequencing 检测结果完全一致，完全一致。在获取 PCR 扩增产物后，从本次研究的操作流程而言，我们的检测时间控制在了1.5h内，操作的流程快速，且操作高自动化、高通量，获得的结果较为理想。焦磷酸测序技术能够有效对满足临床的要求。综上所述，焦磷酸测序技术在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用有着较高的价值。参考文献 1许河南,杨红慧,赖聪娟,等.浙江省丽水市结核分枝杆菌临床分离株耐药性及基因突变情况J.疾病监测,2023,38(01):51-56.2胡琴琴,张金花,宋克玉,等.荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的价值J.中国人兽共患病学报,2022,38(12):1057-1062.3刘原园,石金,初平,等.应用二代测序方法检测痰标本中结核分枝杆菌耐药性的探索性研究J.中华结核和呼吸杂志,2022,45(06):552-559.4丘厦霞,张晓宇,李慧玲,等.结核分枝杆菌吡嗪酰胺 耐 药 性 检 测 方 法 的 研 究 进 展 J.微 生 物 学报,2022,62(05):1587-1599.5杨彩虹,张萍,买买提艾力艾合木提,等.结核分枝杆菌利福平耐药突变位点分析及耐药性快速检测J.中国病原生物学杂志,2021,16(12):1387-1392.6赵竟男,江友桥,伍文华,等.江西 1010 例 PCR-线性杂交酶显色法检测结核分枝杆菌耐药性结果分析J.现代预防医学,2021,48(23):4356-4360.中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 27 7陈晓光,董梅,滕新栋,等.焦磷酸测序技术快速检测青岛地区耐多药结核分枝杆菌embB基因J.热带医学杂志,2018,18(03):354-357+361.8赵竟男,江友桥,伍文华,等.江西省3个监测点结核分枝杆菌耐药性及耐药基因检测分析J.疾病监测,2022,37(01):127-131.9赵东阳,石洁,苏茹月,等.pncA rpsA 和 panD 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