解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠NLRP3炎症体调控作用的实验研究.pdf

医学理论与实践 年第卷第期 解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠 炎症体调控作用的实验研究唐秋媛 张荣臻 胡振斌 王挺帅 牙程玉 吕 超 陈月桥广西中医药大学第一附属医院广西南宁市 摘要 目目的的:观察解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠 炎症体的调控作用探索解毒化瘀颗粒治疗急性肝衰竭的作用机制 方方法法:级 大鼠 只随机分为解毒化瘀颗粒组 只、模型组 只和空白对照组 只 解毒化瘀颗粒组和模型组大鼠给予腹腔注射 /和 /制备急性肝衰竭大鼠模型空白对照组给予腹腔注射等体积生理盐水 造模前 周开始灌胃给药解毒化瘀颗粒组给予解毒化瘀颗粒灌胃模型组与空白对照组给予等体积生理盐水灌胃 于造模成功后第 天取材采集血液标本及大鼠肝组织 染色观察运用 、检测肝组织中、蛋白和 表达情况运用 检测血清、表达情况 结结果果:解毒化瘀颗粒组大鼠血清、水平低于模型组差异具有统计学意义(.)与模型组对比解毒化瘀颗粒组大鼠肝组织中、蛋白及 表达量降低差异具有统计学意义(.)结结论论:解毒化瘀颗粒能够下调 炎症体、和 等相关因子的表达对急性肝衰竭具有一定的治疗作用 基金项目:广西高校中青年教师科研基础能力提升项目()广西自然科学基金项目()国家自然科学基金项目()通信作者:陈月桥关键词 急性肝衰竭 解毒化瘀颗粒 炎症体中图分类号:文献标识码:/.:.:()()()./.:(.).(.).:.急性肝衰竭()是一种在短时间内肝脏细胞出现大量变性坏死及凋亡肝脏合成、解毒、排泄等功能受损甚至引起机体代谢功能紊乱而出现严重的临床综合征属临床上危重肝脏疾病之一 该病发病急骤进展迅速预后多与患者肝脏储备功能、凝血功能、肝病严重程度等多种因素相关但至今发病机制尚未完全阐明不少学者倾向于认同“二次打击学说”该学说以免疫炎症损伤为核心指出“内毒素巨噬细胞细胞因子风暴”为主要发病机制认为 等因素通过直接损伤肝脏 年第卷第期医学理论与实践细胞机体内毒素的增加从而诱导 等多种细胞因子的产生免疫炎症系统异常出现过度免疫炎症反应而对肝脏进行“二次打击”最终引发肝衰竭 改善肝脏炎症损伤是肝衰竭研究的热点和难点近年来研究发现 炎症体及其上下游因子在固 有 免 疫 中 发 挥 着 重 要 作 用 可 通 过 激 活促使白介素等炎症因子进行加工、释放引起炎症反应促使肝细胞坏死 本研究通过观察解毒化瘀颗粒对肝衰竭大鼠模型 炎症体及其上下游相关因子的表达探索其治疗肝衰竭的作用机制材料与方法.实验动物 级 大鼠 只雄性 周龄体重为()购于北京斯贝福生物技术有限公司许可证号(京)饲养条件:温度 通风且湿度为 进行适应性喂养(自由进食、饮水)周.药物解毒化瘀颗粒由茵陈 大黄 白花蛇舌草 赤芍 郁金 石菖蒲 组成采用配方颗粒(江阴天江药业有限公司)由我院提供 一服药使用双蒸水 充分溶解药物药物浓度设定为./按照体重及给药浓度稀释到适宜浓度进行灌胃 半乳糖、脂多糖分别购于上海麦克林生化科技有限公司、北京索莱宝科技有限公司.主要试剂和仪器 细胞裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)蛋白定量试剂盒()()超纯 提取试剂盒()核 酸 染 料()大鼠白细胞介素()试剂盒、大鼠白细胞介素()试剂盒(江苏酶免实业有限公司)()(/)()、()(/)(/)(/)(/)()紫外分光光度仪()荧光 仪 实时伯乐生命医学产品(上海)有限公司全自动酶标仪(北京六一仪器厂)蛋白垂直电泳仪(北京市六一仪器厂)全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司).造模与给药采用随机法将 只 级 大鼠分为模型组、空白对照组和解毒化瘀颗粒组每组 只记录各组大鼠体重采用腹腔联合注射 致急性肝衰竭小鼠模型使用前用生理盐水将 稀释成 配制成的/的溶液 用无菌生理盐水稀释成 配成/的溶液过滤除菌腹腔注射 溶液(溶液/溶液/)一次成膜 造模前 周按分组给药:空白对照组:.氯化钠注射液(灌胃).氯化钠注射液(注射)模型组:.氯化钠注射液(灌胃)造模药物(注射)解毒化瘀颗粒组:解毒化瘀颗粒药液(灌胃)造模药物(注射)每只大鼠每次灌胃体积为/每天灌胃 次(:、:)给药浓度./造模后 进行取样用 戊巴比妥钠麻醉大鼠腹主动脉采血收集血清进行 检测剖取肝脏用 洗净滤纸吸干称重后分别予 甲醛液固定及液氮保存用于病理检测、及荧光定量 检测.病理检测取大鼠肝组织包埋切片烤片脱蜡水化 苏木精水溶液染色 盐酸乙醇分化 返蓝 流水冲洗伊红染色 冲洗脱水封片镜检.检测大鼠肝组织中、表达提取各组大鼠肝组织总 测定总 浓度 /(浓度)./.(纯度)反转录合成 在 的 管中配制如下混合液:加入 上、下游引物各.合成 引物序列见表 预变性 变性 退火 延伸(个循环)扩增反应在 荧光定量 仪上进行采用 法计算目的基因表达量表 引物序列引物名称引物序列()产物长度()退火温度().检测肝组织中、蛋白表达提取各组大鼠肝组织总蛋白测定蛋白浓度配置 胶加入制胶板中缓慢加入至板的/的位置加入无水乙醇压胶待分离胶凝固后加入浓缩胶进行电泳 压缩蛋白 分离蛋白 将样本蛋白转移至 膜 用 转膜液 恒流转膜用 配置 的脱脂牛奶封闭液封闭 洗膜用 浸泡 后弃掉重复 次 分别加入一抗:(/)(/)(/)孵育过夜 加入相应的过氧化物酶标记的二抗孵育 洗膜 次 配置发光液成像凝胶成像系统拍照分析 软件分析蛋白医学理论与实践 年第卷第期 条带灰度值.检测按照试剂盒说明设置样本孔和标准品孔分别加入待测样本及标准品各 空白孔不加 除空白孔外样本孔和标准品孔每孔加入辣根过氧化物酶()标记的检测抗体 封板膜封闭反应孔 水浴或恒温箱温育 弃去液体吸水纸拍干每孔加入洗涤液 静置 甩去洗涤液吸水纸拍干重复洗板 次每孔加入底物、各 避光孵育 每孔加入终止液 内在 波长处测定各孔的 值.统计学方法所有数据均用 统计分析两组之间定量数值比较采用独立样本 检验多组之间定量数值比较采用单因素方差分析两两比较采用 法 检验水准 .以 .作为显著性差异结果.染色如图 所示空白对照组:肝脏细胞围绕中央静脉排列呈放射状肝脏组织肝小叶结构清晰致密未见明显变性坏死、纤维组织增生及炎性细胞浸润 模型组:肝脏组织肝小叶结构紊乱肝索排列紊乱肝细胞变性坏死严重可见出血灶 解毒化瘀颗粒组:肝小叶、肝索结构稍紊乱细胞坏死程度较轻 空白对照组 模型组 解毒化瘀颗粒组图 染色效果.检测如图 所示模型组大鼠肝组织中的、均较空白对照组升高差异具有统计学意义(.)解毒化 瘀 颗 粒 组 大 鼠 肝 组 织 中 的、的表达明显低于模型组具有统计学意义(.)结果显示解毒化瘀颗粒可降低肝衰竭大鼠肝组织中、表达水平图 、基因在各组的相对表达情况与空白对照组相比.与模型组相比.检测如图 所示模型组、解毒化瘀颗粒组大鼠肝组织中的、蛋白表达均较空白对照组升高差异具有统计学意义(.)解毒化瘀颗粒组大鼠肝组织中的、蛋白表达较模型组下降差异具有统计学意义(.)结果显示解毒化瘀颗粒可下调肝衰竭大鼠肝组织中、蛋白表达水平.检测如图 所示模型组大鼠血清中、的表达均高于空白对照组差异具有统计学意义(.)且解毒化瘀颗粒组大鼠血清中、的表达较模型组下降差异具有统计学意义(.)结果显示解毒化瘀颗粒可下调肝衰竭大鼠血清中的、表达水平讨论肝衰竭是临床病死率极高的严重肝病具有起病急、进展迅速、并发症多等特点可导致多器官功能障碍愈后极差 急性肝衰竭的病因复杂发病机制尚未明确结合现有的研究认为免疫炎症损伤、肠道微生态失衡和肝脏微循环障碍在内的直接损伤和间接损伤多种因素等为其主要的发病机制 近年来的研究陆续发现 家族成员(如、和 等)能通过炎症体多蛋白复合体激活 释放多种炎症因子和细胞因子参与不同类型的炎症反应炎症体是一种蛋白复合体 参与形成的 炎症体介导促炎因子、的产生 年第卷第期医学理论与实践图 、在各组的蛋白相对表达情况 与空白对照组相比.与模型组相比.图 检测、的含量与空白对照组相比.与模型组相比.炎症体具有识别机体受损或危险信号被证实参与痛风、重症肌无力、急性肾损伤等多种自身免疫性疾病的发病机制 此外 炎症体还参与急慢性肝病的发病机制 该炎症体涵盖有、和 等被激活后 被活 化进 一 步 促 进 等促炎细胞因子等分泌释放至细胞外而发挥炎症效应进而促进肝细胞坏死 随着研究的深入人们逐渐意识到炎症体在炎症反应中扮演着重要角色是炎症反应的核心在炎症的启动及维持上起关键性作用作为一种极具应用潜力的治疗新靶点炎症体正迅速成为国际研究的热点 并且随着研究不断深入越来越多的研究表明 炎症体参与了急性肝衰竭的发病过程 因此深入探索炎症体参与的免疫应答分子机制对阐明及丰富肝衰竭“免疫炎症二次打击学说”具有重要意义毛德文教授打破了因“湿热发黄、瘀热成毒”形成肝衰竭的传统中医理念首次提出以“毒邪致病”的新理念形成了“毒邪病因”学说 该学说认为“热毒内蕴、瘀血内阻”为核心病机“毒”“瘀”“痰(浊)”胶结为其主要的病理因素 由于毒邪多在各种急性传染病后期治病加之其发病急、病程短往往不能及时控制病情发展因此对于 所致的急性肝衰竭的早期诊断应从毒邪出发为此毛德文教授结合其多年临床经验创制了解毒化瘀颗粒组成:茵陈、大黄(后下)、白花蛇舌草、赤芍、郁金、石菖蒲 具有解毒化瘀、开窍醒神、生新见长之功效本研究证实了解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠 炎症体、和 因子具有调控作用能够下调 炎症体、和 等相关因子的表达极大丰富及支撑肝衰竭“免疫炎症二次打击学说”的科学内涵为肝衰竭的治疗提供新的靶标深刻揭示中药解毒化瘀颗粒缓解肝脏炎症损伤拮抗肝衰竭的分子机制对促进中医药发展具有重要意义参考文献 .:.():.():.:.():./.():./.:./.()():.:.():.姚元谦吕建林毛德文等.解毒化瘀颗粒对肝衰竭的疗效与作用机制研究.中医药导报():.:.():.():.:.():.(下转第 页)医学理论与实践 年第卷第期 表达量显著高于正常人结肠上皮细胞系 结合已有的研究报道我们猜测 在结肠癌中可作为促癌因子 我们将 转染至结肠癌细胞中进行细胞功能学实验结果显示 的上调可以促进结肠癌细胞的增殖迁移并抑制细胞凋亡 说明 在体外结肠癌细胞中有促进细胞表型恶化的作用目前对于 的研究报道显示其可以通过作用于多个靶基因发挥肿瘤调控作用 如、和 等 我们利用多个靶向预测网站发现 与 的 靶向结合并利用双荧光素酶实验验证了两者的靶向结合关系 可以将成纤维细胞重编程为神经元 的调控机制与它的锌指结构有关可能是通过 与 特殊位点结合发挥生物学活性 研究表明在人类成胶质细胞瘤细胞系中 的表达降低 的表达上调会抑制成胶质细胞瘤细胞系的增殖激活与神经元分化相关的基因表达程序并限制细胞迁移和上皮间充质转化基因集的表达 所以我们推测 很可能通过靶向下调 的表达来调控结肠癌的发生和发展 因此 我们比较只转染了 和转染了 和 两组的细胞表型结果可以得出 表达的上调抑制了 的表达并且抑制了 对结肠癌细胞的增殖和迁移的下调作用 表明 可以靶向下调 的表达从而促进结肠癌细胞的发生发展综上所述本研究确定了 对 在结肠癌细胞中的靶向调控作用 今后的研究中会探究 与信号通路之间的作用并在其他结肠癌细胞系中进行研究 本研究可能为结肠癌的发生和发展过程的作用机制提供了一条新的见解望能对其诊断、治疗提供新的思路 本研究的不足之处为仅以结肠癌细胞株为研究对象通过体外实验对分子机制进行研究后续还有待利用动物实验等进行进一步验证和完善参考文献 .():.():.():.:.().():.():.:.()():.().():.():./.:.():.():.():.(本文通信作者:方铠宁)收稿日期 (编辑 羽飞)(上接第 页).():.():.:.毛德文.肝衰竭毒邪病因学说辨析.中医药导报():.毛德文韦艾凌姚春等.毒浊理论在慢性重型肝炎中的应用浅析.四川中医():.唐秋媛龙富立覃艳新等.肝衰竭毒邪毒浊学说及其临床应用拾遗.辽宁中医杂志():.毛德文陈月桥余晶等.解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭小鼠肝细胞 表达的影响.时珍国医国药():.收稿日期 (编辑 倩楠)