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中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 53 结核分枝杆菌耐药基因检测在耐药肺结核治疗中的价值分析 薛 倩 安顺职业技术学院，贵州 安顺 561000 摘要摘要：目的 探究在耐药肺结核的治疗中结核分支杆菌耐药基因所起到的作用。方法此次纳入人员均选择于 2020年 6-2021 年 6 月份本院收治的 882 例涂阳患者，采用随机数字法，将其分成两组，一组是对照组（41 例），另一组 是 观察 组（41 例），分 别 给予 常规 药敏 试验法 及 结核 分枝 杆菌 耐药基 因 检测 聚合 酶链 式反应（polymerasechainreaction,PCR）熔解曲线法。结果 经过分析可以看出，在观察组中，检测到 1 种药物耐药的有 4 例，占 9.75%(4/41),2 种药物的有 2 例，占 4.8%(2/41)，而在对照组中，检测到 1 种药物耐药的有 5 例，占 12.19%(5/41),2 种药物、3 种药物的有 3 例、1 例，占 7.31%(3/41）、2.43%(1/41)，两组之间没有显著性（P0.05)；在 82 名病人中，发现 14 耐药株为利福平，6 突变株，占 42.8%；其中，有 18 个菌株为异烟肼，10个菌株发生突变，占 55.6%；16 个菌株为乙胺丁醇耐药株，8 个菌株发生突变，占 50.0%。三种抗药性基因的变异频率无显著性差别（P0.05）。结论 将结核分支杆菌耐药基因检测应用于耐药肺结核的治疗中应用价值可观，可持续跟进研究。关键词关键词：；Mtb 抗性基因测定；抗性肺结核；临床应用 中图分类号：中图分类号：R4R4 0 引言 耐药性肺结核是目前世界上结核病防控的重点和难点问题，根据最新的统计数据，2017 年世界范围内估计新发利福平耐药性肺结核（RRTB）病人约 558,000人，而目前已知的 MDR/RRTB 病人与估计病例的差距仍然为 39.8,000 人，约为估计病例的 71.3%。中国是我国最大的肺结核发病国家，目前对肺结核的抗药性控制工作正在逐步开展，但仍然面临着巨大的挑战。当前，抗性联合治疗的关键是要在临床上进一步提高临床试验的覆盖面，提高临床对抗性肺结核病人的筛查水平，从而建立一种更加简便、可持续的抗性肺结核治疗新方法。结核病是一种常见的疾病，而我国又是结核病高发的国家，根据有关数据，我国大约占全世界结核病病人的 1/4。目前，该病的治疗以药物为主，但随着临床上用药的增多，耐药肺结核的发病率也在不断上升，为了更好地保证其确诊的准确性，加强对其的检测技术的研发至关重要。本文对结核分支杆菌耐药基因检测进行了研究和分析，并对其在临床上的作用进行了分析。1 资料和方法 1.1 一般资料 这一次的受试者都是从 2020 年 6-2021 年 6 月份本院住院的涂阳病人中选取 82 例患者，用随机数字方法将他们分成两个组，一个是对照组 41 名，另一个是观察组 41 名。对照组 23 名男性，18 名女性，年龄 27-76 岁；观察组男性 24 名，女性 17 名，年龄 28-76 岁。入选条件：全部病人都是在临床上达到了结核病的确诊，并且是自愿参加本试验的。排除条件：有其他严重疾病，精神失常，数据残缺不全的患者。在试验之前，病人和病人的家人都已经事先知道相关信息，并且已经签订了相关的知情同意书。两组患者的临床表现及一般资料均无明显差别（P0.05)，有一定的可比性。1.2 方法 具体来说，就是使用了一些常用的药物，如：乙胺丁醇，利福平，异烟肼。对照组采用 K-B 试纸漫射法，在无菌条件下，采用 NCCIS 检测标准，判断、鉴定病原菌的抗药性。观察组实施结核分枝杆菌耐药基因检测聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）熔解曲线法，取患者痰样品，进行细菌培养，将病原菌分离，用符合标准的试剂盒进行 DNA 提取，在设计好的引物下进行 PCR 扩增，进行 DNA 单链构象多态性分中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 54 析，电泳处理无变性聚丙烯酰胺凝胶孔，将温度、电压分别设定为 4、130150 V,45 h 后将凝胶板取出，通过银染法进行染色，以结核分枝杆菌标准株h37Rv为对照。1.3 统计学分析 对全部数据进行统计和分析，采用 SPSS20.0 统计软件进行了 t 和 x2的检验，分别对计量资料和计数资料进行了 t 和 x2的检验，P0.05)，如表 1 所示。表 1 两组患者的耐药情况对比 n（%）组别 n 耐 1 种药物 同时耐 2 种药物 同时耐 3 种药物 观察组 41 4（9.75）2（4.8）0（0.0）对照组 41 5（12.19）3（7.31）1（2.43）P/0.05 0.05 0.05 2.2 基因检查 在 82 名病人中，发现 14 菌株为利福平耐药菌，6株突发变异；异烟肼变异株为 18 株，10 个菌株突发变异；16 个菌株为乙胺丁醇耐药株，8 个菌株发生突变。三种抗药性基因的变异频率无显著性差别（P0.05）。如表 2 所示。表 2 两组患者的基因检测情况对比 类别 株数 其中突变株数 占比/%利福平耐药株 14 6 42.8 异烟肼耐药株 18 10 55.6 乙胺丁醇耐药株 16 8 50.0 P -0.05 3 讨论 肺结核疾病对人们来说，一种具有很高危险性的重大传染病，它会对人民的身体和生命质量造成很大的影响。根据有关报告显示，与发达国家相比，中国结核病的发病率、死亡率和细菌抗药性都很高，每年有 13万人死于结核病。临床上常用的抗菌药有：乙胺丁醇，利福平，异烟肼等，可以有效地控制结核病的发病和扩散。然而，随着病原体对抗药菌的抗性增强，其对抗菌药物的抗性水平也有不同程度的影响，因此，为了更好地保证临床疗效，必须加强对抗药菌的抗性判定，并对临床用药具有明确的指导意义。已有报道表明，Mtb 对乙胺丁醇的抗性与 embB及 306 基因位点的突变相关；对异烟肼具有较强的抗性，这可能与其编码的氧化氢-过氧化物酶 KatG 的丢失有关；而耐利福平的出现，可能和 rpoB 的基因序列有关。因此，开展肺结核病原体的测定和抗性研究，将为肺结核的预防和治疗提供更为精确的理论基础。根据治疗的数量和抗性之间的关系，可以说是成正比的，因为有临床研究发现，二次复发的肺结核病人，抗性要比第一次治疗的病人更高。从这一点来看，执行药物的耐药性分析，可以对药物的使用起到一定的指导作用。以往的临床治疗中，由于忽视了病人就诊和治疗的时间，造成了对病人的耐药评价存在一定的偏颇和偏差，从而影响了分析的精度。最近几年，关于治疗次数和耐药率的研究不断增多，我们可以看到，在第一次诊断不成功的病人进行二次治疗后，其耐药率显著高于第一次诊断时，这一现象被认为是由于抗结核药物的用量存在着某种联系，这就导致了结核分支杆菌的耐药性的增加。所以，对于肺结核病人，应注意采取合理的治疗方式，尽量减少疗程，注意防止病情反复，减少细菌的抗性。目前临床上常使用比例法、浓度法等来检测 MTB的耐药，但也有研究表明，这种检测所需的周期很长，通常为 6-8 周，个别病例可能更久，很难保证疗效。近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究报道了与分枝杆菌耐利福平和耐异烟肼有关的新的基因。有研究表明，在对 rpsL、KatG 等基因进行图片测试的过程中，我们可以看到，rpsL、KatG 等基因的突变率比较高，高达 90%以上，在这里，有关药物抗药株的基因也比较高，这与有关的文献报导相符合。从这一点就可以看到，在对抗药基因进行检测的过程中，荧光 PCR 熔解曲线法有着非常显著的优点，它的优点主要表现在灵敏性高、特异性高等方面。但是，需要指出的是，尽管该方法有着较高的使用价值，但是在具体的操作过程中仍然会遇到许多迫切需要解决的问题，比如，该方法的操作比较麻烦，并且很有可能会产生交叉感染的现象等。据报道，LAMP 法，荧光 PCR 熔融曲线法中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 55 用于基因分析，都具有很高的特异性和敏感性，不需要使用特别的药剂，也不需要事先进行双链 DNA 的变性，而荧光 PCR 熔化曲线法的优点就是快速、简便和准确。其中，荧光聚合酶链反应（FPCR）的熔融曲线分析方法，对实验条件和实验试剂的要求比较高，特别是对实验设备和实验条件的要求比较高。另外，针对耐药结核株的变异，采用荧光 PCR 的熔融曲线，可以实现一线和二线抗结核药的同步监测，从而避免了传统的药敏试验的缺陷，实现了快速、准确的测定。在 EMB,SM 等表型耐药性中，该方法并不具有很好的稳定性，因此，相对于表型检验，采用荧光 PCR 溶出曲线方法具有较高的实用价值。然而，这种检测方式也有其局限性，因为在检测过程中，很容易出现不含氨基酸的变异，进而判断为突变。此外，如果所测试样本中的抗药性不均匀，或者抗药性太少，都有可能被认为是敏感类型，从而导致错误的结果。总结来说，结核病属于比较普遍的一种慢性传染疾病，其病因是结核分枝杆菌感染，治疗以药物为主，一般有乙胺丁醇、异烟肼等，可以有效地抑制病人的病情发展，降低病人的死亡率。所以，在进行肺结核的治疗过程中，就需要将对结核病分枝杆菌的抗药性进行测试和分析，选择合适的测试技术，才能保证测试结果的正确性，进而为病人的诊断和治疗提供依据，这也是防止病人错失了最好的治疗机会的重要因素，应该受到足够的关注。参考文献 1陈秋景,覃勇民,罗文昭.2 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