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830安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 11：18：52 网络出版地址:h t t ps：/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1341.021.h t mlLncRNA HAGLR 激活 RUNX2并抑制NLRP3炎症小体对胫骨骨折愈合的影响王 文，陈新宇,黄兹艺，邓杨柳,崔红旺摘要 目的 研究长链非编码RNA(Ln c RNA)HAGLR对胫 骨骨折(IT)小鼠的NOD样受体蛋白3(NLRP 3)炎症小体表 达和骨折愈合的影响并探讨机制。方法体外对成骨细胞 MC3T3-E1沉默HAGLR,CCK-8法检测细胞活力，TUNEL法 检测细胞凋亡,q P CR法检测骨碱性磷酸酶(BALP)和骨钙素 的表达。West er n bl o t法检测RUNX2、磷酸化RUNX2(p-RUNX2)以及NLRP 3、半胱天冬酶1(Ca spa sel)、凋亡相关斑 点样蛋白(ASC)、白细胞介素-ip(IL-ip)的表达。通过小鼠 TF手术建立TF小鼠模型，在模型小鼠体内过表达HAGLR,并在过表达HAGLR的基础上沉默RUNX2或加入炎症小体 抑制剂MCC950。q P CR法检测HAGLR和RUNX2的表达,West er n bl o t法检测胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达。mic r o CT测量小鼠骨痂体积(MBV)，称量小鼠的全长胫骨湿 重。结果 沉默HAGLR导致MC3T3-E1细胞活力降低且凋 亡率增加(P 0.05),且RUNX2.p-RUNX2.BALP和骨钙素 表达量均降低(P 0.05),NLRP 3、Ca spa sel、ASC、IL-10 的表 达量都增加(P 0.05)。与健康组织比较,TF小鼠体内HA-GLR和RUNX2表达量降低(P 0.05)。过表达HAGLR促 进TF小鼠体内的HAGLR和RUNX2表达,并增加MBV和 全长胫骨湿重以及IGF-1的表达量(P 0.05)。在过表达 HAGLR的基础上沉默RUNX2导致TF小鼠的MBV、全长胫 骨湿重和IGF-1表达量都降低(P 0.05)。而在过表达HAGLR 的基础上加入NLRP 3炎症小体抑制剂MCC950导致 MBV、全长胫骨湿重和IGF-1表达又增加(P 0.05)o结论Ln c RNA HAGLR通过激活RUNX2并抑制NLRP 3炎症小 体促进TF的愈合。关键词 胫骨骨折;同源框D基因簇反义生长相关的长非 编码RNA；Ru n t相关转录因子2；NOD样受体热蛋白结构域 相关蛋白3；炎症小体中图分类号R683文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0830-08 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.021骨折愈合是一个复杂且漫长的过程，多种生长2022-11-20 接收基金项目：国家自然科学基金(编号=81760260)作者单位:海南医学院第一附属医院急诊和创伤外科，海口 570100 作者简介:王文，男，主治医师；崔红旺，男，博士，副主任医师，责任作者，E-ma il：c q c h w 2013 sin a.c o m因子和细胞炎症因子参与骨折的愈合过程，负责调 节细胞活化和成骨细胞增殖1-3o研究发现,NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-l ik e r ec ept o r py r in d o ma in-a sso c ia t ed pr o t ein 3,NRLP 3)炎症 小体不仅能激活炎症反应而且还参与了骨质疏松进 展的调控,在延迟骨折愈合的过程中扮演重要角色。然而，其上下游的调控机制并不清楚。长非编码 RNA(l o n g n o n-c o d in g RNA,Ln c RNA)是一类大于 200个核昔酸的非编码转录本家族,通过调节 Ru n t 相关转录因子 2(r u n t-r el a t ed t r a n sc r ipt io n f a c t o r 2,RUNX2)和炎症小体密切参与骨折愈合的调 控6-80同源框D基因簇反义生长相关的长非编 码 RNA(h o meo bo x D g en e c l u st er a n t isen se g r o w t h-a sso c ia t ed l o n g n o n c o d in g RNA,HAGLR)是一种关键的 Ln c RNA9-11 0已知HAGLR在股骨颈骨折中表达 降低问，但对胫骨骨折(t ibia l f r a c t u r e,TF)的调控作 用仍不清楚。该研究拟建立TF模型，探讨HAGLR 对骨折的愈合作用和机制。1材料与方法11材料1.1.1 主要试剂 小鼠成骨细胞MC3T3-E1购于 武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM培养基购 于美国GIBCO公司;胎牛血清购于美国Mer c k Mil l i-po r e公司；沉默HAGLR的阴性对照(si-NC)、沉默 HAGLR 的小干扰 RNA 载体(si-HAGLR)、pc D-NA3.1 空载体(pc DNA-n u l l)、pc DNA3.1-HAGLR 过 表达载体(pc DNA-HAGLR)、短发夹RNA载体阴性 对照(sh-NC)、沉默RUNX2的短发夹RNA载体(sh-RUNX2)构建于上海吉玛制药技术有限公司；NL-RP 3炎症小体抑制剂MCC950购于美国MCE公司；Lipo f ec t a min e 2000 购于美国 Th er mo Fish er Sc ien t if ic 公司；CCK-8试剂盒、TUNEL染色试剂盒、RIP A裂 解缓冲液购于上海碧云天生物技术有限公司；TR Izo l 试剂购于美国 Th er mo Fish er Sc ien t if ic 公司；Tr a n sSc r ipt和c DNA合成试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；Un iv er sa l SYBR Gr een Fa st q P CR 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)831Mix Kit购于美国ABc l o n a l公司；GAP DH购于美国 Cel l Sig n a l in g Tec h n o l o g y 公司；HRP 标记的亲和山 羊抗兔鼠Ig G(H+L)二抗购于美国P r o t ein Tec h Gr o u p公司；P VDF购于上海碧云天生物技术有限公 司;RUNX2抗、P-RUNX2 一抗、胰岛素样生长因 子-1(in su l in-l ik e g r o w t h f a c t o r-1,IGF-1)抗购于美 国 Cel l Sig n a l in g Tec h n o l o g y 公司；NLRP 3、Ca spa sel、ASC、白细胞介素-1 p(in t er l eu k in-10,IL-1 p)的一抗 购于北京生工生物工程有限公司。1.1.2实验动物100只成年雄性C57BL/6小鼠，10周龄，体质量(31.25 1.66)g,购于海南药物研 究所有限责任公司(许可证号:SCXK2020-0007)。所有小鼠均在受控温度(21 23 C)下喂养,12 h/12 h光/暗周期模拟白天/夜晚变化,并自由获取食 物和水。本研究中使用的所有动物都按照机构动物 护理指南接受了人道护理。所有手术和实验程序均 通过海南医学院第一附属医院伦理委员会批准。12方法12.1动物分组与建模 TF小鼠建模方法按文 献提供的方法，用1%戊巴比妥钠按1 ml/k g腹 腔注射麻醉小鼠后，备皮、消毒小鼠右下肢,在小鼠 右侧膝关节下切开约0.5 c m纵行切口，由膑腱处插 入22 G/0.41 mm髓内固定针，于胫骨中上1/3处 分离肌肉及筋膜，使用锯片锯断胫骨骨干后立即使 用0.9%生理盐水冲洗胫骨表面，再将髓内固定针 完全插入并对合。逐层缝合切口，制成TF模型小 鼠。将20只小鼠按随机数表法分为健康组(No r ma l 组，正常饲养,=10)和TF组5=10)。另，将80 只雄性C57BL/6小鼠在TF术后10 d,随机分为8 组进行治疗：pc DNA-n u l l+TF 组pc DNA-n u l l 以 20 jJLg/(k g d)静脉注射;pc DNA-HAGLR+TF 组 pc DNA-HAGLR 以 20|x g/(k g-d)静脉注射;sh-NC+TF 组sh-NC以20|x g/(k gd)静脉注射;sh-RUNX2+TF 组sh-RUNX2 以 20k g d)静 脉注射;sh-NC+pc DNA-HAGLR+TF 组sh-NC 以 20|x g/(k g d)静脉注射，pc DNA-HAGLR 以 20|x g/(k g-d)静脉注射;sh-RUNX2+pc DNA-HA-GLR+TF 组sh-RUNX2 以 20 jjLg/(k g-d)静脉注 射,pc DNA-HAGLR 以 20 jig/(k g d)静脉注射;sa l in e+pc DNA-HAGLR+TF 组联合注射，其中 sa-l in e 以 100|x l/(k g d)静脉注射,pc DNA-HAGLR 以 20|ig/(k g d)静脉注射;MCC950+pc DNA-HAGLR+TF组联合注射:MCC950以20 mg 100 jjJ/(k g d)静脉注射,pc DNA-HAGLR 以 20 jx g/(k g-d)静脉注射。每组10只小鼠，连续注射4 周后分离全长胫骨并称湿重。随后将各组小鼠的胫 骨组织保存于-80七冰箱中。1.2.2 MC3T3-E1细胞培养 使用含10%胎牛血 清和1%青-链霉素的DMEM培养基在37咒下，含 95%空气和5%C02的培养箱中培养MC3T3-E1细 胞。细胞每2d换液一次，取处于对数生长期的细 胞用于后续实验。1.2.3 MC3T3-E1 细胞转染 si-HAGLR 采用 Lipof ec t a min e 2000 将 10 n mo l/L si-NC 或 si-HAGLR 转 染入MC3T3-E1细胞中。24 h后收集细胞用于 q P CR检测。1.2.4 q P CR 检测 HAGLR、BALP、骨钙素和 RUNX2的表达 收集si-NC组和si-HAGLR组细胞 用于检测HAGLR、骨碱性磷酸酶(bo n e a l k a l in e ph o sph a t a se,BALP)、骨钙素的表达。收集 No r ma l 组、TF 组、pc DNA-n u l l+TF 组、pc DNA-HAGLR+TF 组、sh-NC+TF 组、sh-RUNX2+TF 组、sh-NC+pc DNA-HAGLR+TF 组、sh-RUNX2+pc DNA-HAGLR+TF组骨组织(用于检测HAGLR和RUNX2的表达,骨组织研磨后浸入液氮粉化)。使用Tr izo l法提取 待测组织或细胞的总RNA。用DNa se I处理1趕 总RNA,进行逆转录。并根据制造商的说明，使用 SYBR Gr een P CR 进行 q P CR 分析。q P CR 引物序 列见表1。在96孔光学反应板中进行40个循环进 行扩增，1个循环中94 C变性5 s,63 C退火30 s,72 C延伸60 so以GAP DH作内参基0,2*法 计算分析目的基因的表达水平。表1 qPCR引物序列基因引物序列(5，-3，)HAGLRF:TCTGAAAGAAGGACCAAAGTAAR:ATTCAAGGGACAGTCACAGGBALPF:TTAGTCCGGTITAGAAAGGTR:TTGGAAGTAAAGCCCCTGGAo st eo c a l c inF:GTGTGGTGTATGTGGTCCR:CCCCTTAGAGAGGTGTGRUNX2F:TCGAAAGCATGAAGGACAACG R:AGCACTCAGTCAACGTCTCACGAP DHF:GAGTATGTGATITATGGTAAGR:AGATGTAGTATTAGTAGTATT1.2.5 CCK-8检测MC3T3-E1细胞的增殖 根据 生产商提供的说明，将转染si-NC或si-HAGLR的 MC3T3-E1细胞接种至96孔板中，培养24、48、72、96 h后去除培养液，在避光下向每孔加入100以含832安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)10%CCK-8溶液的DMEM完全培养液,37龙孵育4 h后终止培养,室温下置于摇床振荡5 mino在酶标 仪上测定450 n m处吸光度值。实验重复3次。1.2.6 TUNEL检测MC3T3-E1细胞的凋亡 根据 生产商提供的说明，于细胞爬片上培养MC3T3-E1 细胞并转染si-NC或si-HAGLR,培养24 h后去除培 养液,在避光下向每孔加入50|x l TUNEL试剂盒工 作液，并继续孵育12 ho DAP I核染15 min后加入 抗荧光淬灭液封片，荧光显微镜上观察拍照。细胞 凋亡率=TUNEL阳性细胞/总细胞x 100%。1.2.7 West er n bl o t 检测 RUNX2 和 NLRP 3 炎症小 体相关蛋白的表达收集各组细胞和各组小鼠股骨 组织,将组织匀浆后，在冰上于RIP A裂解缓冲液中 裂解细胞和组织。BCA法测定细胞与组织中的蛋 白浓度。取50 jig蛋白样品，SDS-P AGE凝胶进行 分离。随后，转移蛋白到P VDF上。将P VDF膜用 5%脱脂奶粉封闭后，加入RUNX2和p-RUNX2.NL-RP 3、Ca spa sel、ASC、IL-1|3、IGF-1 抗，并在在 4 V 下孵育过夜。次日，加入HRP标记二抗在室温下孵 育2h。随后用增强的化学发光试剂显色,并使用 Ima g e J软件进行分析。1.2.8 微计算机断层扫描(mic r o-c o mpu t ed t o mog r a ph y,mic r o-CT)测量小鼠骨痂骨体积(mo u se bo n e v o l u me,MBV)近端干聽端区域内的骨形态测量使 用mic r o-CT对胫骨进行量化。在背腹方向扫描250 个切片(厚度13 Fx m)o使用三角测量算法进行骨 骼的三维重建。测量小鼠骨痂骨尺寸，并生成MBV 值。1.3统计学处理 采用SP SS 22.0统计软件进行 数据分析。数据采用 s表示，/检验分析两组的 差异，使用单因素方差分析多组间差异，组间两两比 较采用LSD-f检验分。P 0.05为差异有统计学意 义。2结果2.1 TF小鼠骨折组织中HAGLR的表达 图1A 为TF后不同周的TF小鼠的X光片。在第1周和 第2周无骨愈合特征，第4周出现了骨愈合组织和 骨折形态,这表明TF模型小鼠造模成功。q P CR法 检测结果显示:与No r ma l组比较,HAGLR在TF组 小鼠骨组织中表达下调(7.05 1.21)”s(2.61 0.49),t&662,P=0.031,差异有统计学意义,见 图IB。B B蛊眾fe礙善DVH-frDVH-fr番血11周A图1 TF模型观察及骨折组织中HAGLR的表达A：TF小鼠第1、2、4周代表性X光片,箭头指示骨折部位;B:q P CR法检测小鼠骨折组织中HAGLR的表达，与No r ma l组比较：*P 0.052.2 敲低HAGLR诱导小鼠成骨细胞的凋亡和NLRP3炎症小体的表达 q P CR结果显示:与si-NC 组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞中HAGLR表 达显著降低(1.00 0.12)vs(0.46 0.03)=13.216,P=0.002,图 2A。CCK-8 实验结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR组MC3T3-E1细胞的增 殖活力明显降低(F=9.662,P=0.014,图2B)。TUNEL染色结果显示：与si-NC组比较,si-HAGLR 组MC3T3-E1细胞的凋亡率显著升高(4.12 0.43)%仍(&51 0.92)%,211.602,P=0.003,图2C)。随后，通过q P CR检测BALP mRNA和骨 钙素mRNA的表达水平来评估HAGLR对成骨细胞 活性的调节作用,结果显示:与si-NC组比较,si-HAGLR 组MC3T3-E1细胞BALP和骨钙素的mRNA水 平均明显下调(BALP：t=15.236,P=0.002；骨钙 素：t=13.251,P=0.003,图 2D、E)o West er n bl o t 检测NLRP 3炎症小体相关蛋白NLRP 3、Ca spa sel、ASCJL-ip表达,结果显示:与si-NC组比较,si-HA-GLR 组 MC3T3-E1 细胞中 NLRP 3、Ca spa sel、ASC、IL-1 B蛋白表达均明显升高(NLRP 3：t=9.503,P=0.035；Ca spa se l:t=15.446,P=0.003；ASC:t=10.305,P=0.007；IL-1 p：z=&528,P=0.022,图 2F J)o2.3 HAGLR 调控 RUNX2 的表达 在 MC3T3-E1 细胞中，与si-NC比较，si-HAGLR组中RUNX2的 mRNA和蛋白水平均显著降低(t=17.089、12.887,P=0.001、0.019,图 3A、B)，且 p-RUNX2 蛋白水平 也降低Q=12.007,P=0.008,图3C)。在小鼠骨组 织中，与No r ma l组比较,RUNX2的mRNA在TF组 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)833织中的表达水平明显降低(t=7.669,P=0.025,图 3D)。在小鼠体内沉默RUNX2或者过表达HAGLR,q P CR 结果显示：与pc DNA-n u l l组比较,pc D-NA-HAGLR 组的 HAGLR 和 RUNX2 mRNA 表达水 平均明显升高(HAGLR：t=12.606,P=0.003；RUNX2：i=14.662,P=0.002)。但与sh-NC组比CA*旳夜si-NC 组 si-HAGLRf f lDAP Isi-NC 组TUNELsi-HAGLRf f lE E 赳来径叙E u o s寸l-5r.s i-NC组 si-HAGLRe e rgrg e e M M7272时24246 69 9()口理凰01-1-1si-NC 组 si-HAGLRf f lFsi-NCf f l si-HAGLRMD*瑕*w日.5.5E 1.5NLRP 3.o.oo o.5.5 o.o.T*si-NC 组 si-HAGLRf f l.O.5O.O.5O1o.1o.siNC组 si-HAGLR组Ca spa se3ASCIL-l pGAP DHsiNC 组 si-HAGLRMsi-NC 组 siHAGLR 组*善是 粥*G3 23 21 o1 o*故略决是皿Mosv3210*T图2敲低HAGLR诱导小鼠成骨细胞的凋亡和NLRP3炎症小体表达的影响A：q P CR检测HAGLR的表达；B：CCK-8实验检测细胞增殖活性；C：TUNEL实验检测细胞凋亡(红色荧光:TUNEL阳性，蓝色荧光:DAP I染 色，X400)；D、E：q P CR检测BALP和骨钙素的表达;FJ：West er n bl o t法检测NLRP 3、Ca spa sel、ASC、IL-10蛋白的相对表达量;与si-NC组比 f t：0.05834安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)B,5,5山.5.51 1 1 1 O Osi-NC组 si-HAGLR组RUNX2GADP Hsi-NC 组 si-HAGLR 组si-NC 组 si-HAGLRMli pc DNA-n u l l组-盪 pc DNA-HAGLR组*c si-NC组 si-HAGLRf f lP-RUNX2GADP H*故*友異山WZX5 0 5 05 0 5 011 1111 11E*朮fe婆 V N M*HAGLR RUNX2O O5 5F*常翼V25 51111A*图3 HAGLR对RUNX2表达的影响A C：q P CR 和 West er n bl o t 检测 RUNX2 和 p-RUNX2 的表达,与 si-NC 组比较:*P 0.05;D：q P CR 法测 TF 小鼠骨折组织中 RUNX2 mRNA 的表达,与No r ma l组比较:*P 0.05;E：TF组小鼠用pc DNA-n u l l和pc DNA-HAGLR静脉治疗,q P CR检测RUNX2和HAGLR的表达,与pc D-NA-n u l l组比较：*P 0.05;F：TF小鼠用sh-NC和sh-RUNX2静脉治疗,q P CR检测RUNX2和HAGLR的表达，与sh-NC组比较：*P 0.05)o与pc DNA-n u l l+TF组比较，pc DNA-HAGLR+TF 组和 sh-NC+pc DNA-HAGLR+TF组的MBV、全长胫骨湿重.IGF-1蛋白表达水平 均明显增加(P 0.05)。而与 sh-NC+pc DNA-HA-GLR+TF 组比较，sh-RUNX2+pc DNA-HAGLR+TF 组MBV、全长胫骨湿重.IGF-1蛋白表达均降低(P 0.05)。见图 4。2.5 抑制NLRP3炎症小体促进HAGLR对小鼠 骨组织的愈合作用 用NLRP 3炎症小体选择性抑 制剂MCC950抑制NLRP 3炎症小体的表达后比较 各组小鼠骨组织愈合指标。结果显示:与No r ma l组 比较,TF 组、pc DNA-n u l l+TF 组、pc DNA-HAGLR+TF 组、sa l in e+pc DNA-HAGLR+TF 组和 MCC950+pc DNA-HAGLR+TF 组的 MBV(F=254.889,P=0.001)、全长胫骨湿重(F=90.065,P=0.022)、IGF-1的蛋白表达水平(F=108.254,P=0.005)差 异均有统计学意义；与pc DNA-n u l l+TF组比较,pc DNA-HAGLR+TF 组和 sa l in e+pc DNA-HAGLR+TF组的MBV、全长胫骨湿重.IGF-1的蛋白表达水 平差异均有统计学意义(P 0.05)；与sa l in e+pc D-NA-HAGLR+TF 组比较，MCC950+pc DNA-HAGLR+TF组MBV、全长胫骨的湿重.IGF-1的蛋白相对 表达量均明显增加(P 0.05)。见图5。3讨论本实验在体内外水平探究了 HAGLR调控TF安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)8353*&工iB 0.4*工 b 工 aA 80(UIUI)AH養 W图4沉默RUNX2逆转HAGLR对小鼠骨组织愈合的促进作用A：各组小鼠MBV的比较;B：各组小鼠全长胫骨湿重的比较;C：West er n bl o t检测各组小鼠骨组织中IGF-1的蛋白表达水平；a：No n n a l组;b：TF 组;c：pc DNA-n u U+TF 组;d：pc DNA-HAGLR+TF 组；e：sh-NC+pc DNA-HAGLR+TF 组；f：sh-RUNX2+pc DNA-HAGLR+TF 组；与 No r ma l 组比较:*P 0.05；与 pc DNA-n u l l+TF 组比较：#P 0.05；与 sh-NC+pc DNA-HAGLR+TF 组较：&P 0.05A(8旦 AHWsgB(8)删嗚*伺平畑sgw*旳*衩蚩，4 3 2 1 0图5抑制炎性小体促进HAGLR对小鼠骨组织愈合的促进作用A:各组小鼠MBV的比较;B：各组小鼠全长胫骨湿重的比较;C：West er n bl o t检测各组IGF-1的蛋白表达水平；a：No r ma l组;b：TF组;c；pc DNA-n u U+TF 组；d：pc DNA-HAGLR+TF 组；e：sa l in e+pc DNA-HAGLR+TF 组；f：MCC950+pc DNA-HAGLR+TF 组；与 No r ma l 组比较:*P 0.05；与 pc DNA-n u l l+TF组比较：#P 0.05；与 sa l in e+pc DNA-HAGLR+TF组比较；&P 0.05愈合的潜力，结果表明HAGLR在TF小鼠骨组织中 表达降低，沉默HAGLR后小鼠成骨细胞中成骨标 志物和RUNX2的表达均降低，但细胞凋亡率和NL-RP 3炎症小体表达水平增加。在TF小鼠中过表达 HAGLR后不仅可促进RUNX2的表达增加,还明显 改善了 MBV、全长胫骨湿重和IGF-1的蛋白表达 量。沉默RUNX2则可明显抑制过表达HAGLR对 TF小鼠MBV、全长胫骨湿重、IGF-1表达的上调功 能,而抑制NLRP 3炎症小体则进一步促进了 TF小 鼠MBV、全长胫骨湿重JGF-1的表达，提示HAGLR 在TF骨折愈合中扮演重要角色。既往研究报道称HAGLR在股骨骨折组织中 下调，且可通过调控细胞增殖和凋亡参与调控骨折 的愈合。本研究结果同样表明，HAGLR在TF组织 中的表达降低，且过表达HAGLR可以明显促进骨 痂生长，而沉默HAGLR可以明显抑制前成骨细胞 的增殖并促进凋亡，提示过表达HAGLR可能具有 促进骨折愈合的功能。836安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)影响骨折愈合的主要因素为骨折端的血供不 良，导致骨营养缺乏。RUNX2是促进骨折愈合的关 键标志物，其可通过激活骨形态发生蛋白2通过 Sma d信号通路诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞 分化，从而促进骨折愈合。已有研究发现Ln-c RNA KCNQ1OT1可上调RUNX2和骨钙素，而 且In c RNA MEG3也具有类似效果则，表明Ln c RNA 可作为一种潜在的成骨细胞分化的重要分子。有研 究口报道RUNX2表达与骨形成密切相关，并且 RUNX2的表达水平升高代表骨折愈合增加。本研 究结果观察到TF骨组织中RUNX2表达降低，而过 表达HAGLR则可以恢复RUNX2和p-RUNX2的表 达，但沉默HAGLR则可以抑制成骨细胞中的 RUNX2和p-RUNX2,表明HAGLR会促进骨折愈 合，与RUNX2的调控密切相关。研究M发现，骨骼 生长刺激因子IGF-1的缺乏对骨骼结构发育具有负 面影响，如在快速生长和骨骼成熟的青春期,循环系 统中IGF-1的含量明显增加,而敲除IGF-1表达则 能抑制骨骼的生长。本研究在体内观察到TF小鼠 过表达HAGLR不仅导致MBV和全长胫骨重量的 明显增加，且过表达HAGLR也可导致IGF-1的表达 量明显增加；而在过表达HAGLR基础上沉默 RUNX2则可以明显抑制过表达HAGLR对TF小鼠 MBV、全长胫骨湿重.IGF-1表达的上调功能，提示 过表达HAGLR可能通过激活RUNX2促进TF的愈 合。研究表明，特异性抑制NLRP 3炎症小体可 明显增加糖尿病诱导的骨折模型中的MBV、骨体积 分数并抑制骨折组织中IFN-y、TNF-(x和IL-6的表 达，抑制小鼠NLRP 3炎症小体还可以促进牙槽骨缺 损的愈合，表明NLRP 3炎症小体的抑制药可能是骨 折愈合的潜在治疗药物。本研究发现沉默HAGLR 后小鼠成骨细胞的凋亡率和NLRP 3炎症小体均明 显增加，在过表达HAGLR的基础上使用NLRP 3炎 症小体选择性抑制剂MCC950抑制NLRP 3炎症小 体的激活后TF小鼠的MBV、全长胫骨的湿重和 IGF-1的蛋白相对表达量都明显增加，表明过表达 HAGLR可通过抑制NLRP 3炎症小体促进TF的愈 合。综上所述,HAGLR在TF中的表达明显降低,且其可通过促进RUNX2表达和抑制NLRP 3炎症小 体促进骨折愈合。本研究仍然存在一些局限性，如 缺乏对小鼠骨折愈合过程中HAGLR分子机制深入 探讨,下一步课题组将进一步开展研究探讨。参考文献1 P esc ia l l o C A,Ga r a ba n o G,Al a min o L P,et a l.Ef f ec t iv en ess o f n a il d y n a miza t io n in d el a y ed u n io n o f t ibia l sh a f t f r a c t u r es:r el a t io n sh ip bet w een f r a c t u r e mo r ph o l o g y,c a l l u s d ia met er,a n d u n io n r a t es J.In d ia n J Or t h o p,2021,56(3)：386-91.2 Ta r r a n t S M,Ba l o g h Z J.Th e g l o ba l bu r d en o su r g ic a l ma n a g emen t o f o st eo po r o t ic f r a c t u r es J.Wo r l d J Su r g,2020,44(4):1009 一 19.3 曾昭池，汤 勇，张先慧，等.外源性Apel in-13通过调控 VEGF/P BK/Ak t信号通路促进大鼠股骨骨折愈合J.安徽医 科大学学报,2021,56(1):48-53.4 Jia n g N,An J,Ya n g K,et a l.NLRP 3 in f l a mma so me:a n ew t a r g et f o r pr ev en t io n a n d c o n t r o l o f o st eo po r o sis?J.Fr o n t En d o c r in o l,2021,12(1)：1231-42.5 Br id g es M C,Da u l a g a l a A C,Ko u r t id is A.LNCc a t io n:In c RNA l oc a l iza t io n a n d u n c t io n J.J Cel l Bio 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