中性粒细胞胞外诱捕网在急性缺血性脑卒中发生及诊治中作用的研究进展.pdf

30 医药前沿 2024年1月 第14卷第2期 综述中性粒细胞胞外诱捕网在急性缺血性脑卒中发生 及诊治中作用的研究进展齐 鹏，朱鸿佳，张淑萍（通信作者）（佳木斯大学附属第一医院神经内科 黑龙江 佳木斯 154000）【摘要】急性缺血性脑卒中（AIS）具有病死率高、致残率高的特点，是世界范围内的主要死亡及残疾原因之一。近年来有研究证实，活化的中性粒细胞可产生一种特殊的网状结构被称为中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），其具有促动脉粥样硬化以及血栓形成的作用，同时也在AIS发生发展中具有重要作用，但具体机制尚未阐明。本文围绕最近的研究，详述 NETs 作为脑卒中的潜在生物标记物、在急性缺血性脑卒中的病理生理作用，以及缺血性脑卒中治疗的意义。【关键词】综述；中性粒细胞胞外诱捕网；急性缺血性脑卒中；血栓形成；动脉粥样硬化【中图分类号】R742【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2024）02-0030-05Research progress of meutrophil extracellular traps in the pathogenesis and treatment of acute ischemic strokeQI Peng,ZHU Hongjia,ZHANG Shuping(Corresponding author)Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi,Heilongjiang 154000,China【Abstract】Acute ischemic stroke(AIS)has the characteristics of high mortality and disability rates,and is one of the main causes of death and disability worldwide.In recent years,studies have confirmed that activated neutrophils can produce a special network structure called neutrophil extracellular trap nets(NETs),which can promote atherosclerosis and thrombosis,and also play an important role in acute ischemic stroke,but the pathogenesis has not been clarified.This article will focus on recent research,and detail NETs as a potential Biomarker of stroke,its pathophysiological role in acute ischemic stroke,and its significance in the treatment of ischemic stroke.【Key words】Review;Neutrophil extracellular traps;Acute ischemic stroke;Thrombosis;Atherosclerosis急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke,AIS），是指各种脑血管病变所致脑部血液供应障碍，导致局部脑组织缺血、缺氧性坏死而迅速出现相应神经功能缺损的一类临床综合征。据全球疾病负担 2016 报告1显示，脑卒中已成为世界上最常见和最严重的疾病之一，全球每年有 1 300 多万人患有脑卒中，每年有 550 万人因此丧命，其中缺血性脑卒中占比可达到 80%以上。脑卒中的全球病死率仅次于缺血性心脏病。卒中的发病机制复杂，涉及多种病理过程，其中炎症反应是卒中过程中的关键事件之一2。2004 年 Brinkmann 等3首次发现白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）、佛波酯（phorbol myristate acetate,PMA）或脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激中性粒细胞时，后者可产生一种由核内 DNA 与胞浆蛋白结合而成的新型网状结构，将其命名为中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）。其生成过程被称为 NETosis4。NETosis 是一种区别于凋亡、坏死的新型死亡程序5。研究表明 NETs 在动脉粥样硬化形成及动脉血栓形成的中起着重要作用，并且在缺血性脑卒中的发生发展中扮演着重要角色。本文对 NETs 与 AIS、动脉粥样硬化、动脉血栓形成关系的研究进展作一综述。1 NETs 概述1.1 NETs 的结构NETs 是一种强负电荷的网状结构，主要由 DNA、组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）、高迁移率族蛋白 B1（high mobility group box protein 1,HMGB1）和组织蛋白酶 G 等蛋白质所构成6。DNA 是 NETs 的骨架，组蛋白起到促进微生物和病原体黏附的作用。颗粒蛋白中的 MPO、NE 等发挥消灭病原体的作用。NETs 可以捕获细菌并分泌抗菌分子，从而降解致病因子并杀死细菌。NETs 发挥杀灭病原体的作用，还通过激活自身免疫或炎症反应加剧某些非传染性疾病等作用7。此外，NETs 与AIS 的发生发展也息息相关。1.2 NETs 的形成过程近年来，人们对 NETs 的形成机制进行了大量的研究，目前认为 NETosis 大致分为 3 种。（1）suicidal NETosis：通常发生在中性粒细胞激活后 2 4 h。当中性粒细胞受到 PMA、IL-8 或胆固醇晶体的刺激时，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶复合物通过 PKC-Raf MERK-ERK 途径被激活。一方面，其通过产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）将 NE 和 MPO 转移到细胞核来促进染色质去凝聚8。另一方面，细胞外 Ca2+的流入激活了蛋白精氨酸去亚胺酶 4（peptidylarginine deiminase 4,PAD4），导致组蛋白瓜氨酸化，并削弱组蛋白与 DNA 的静电结合，从而导致染色质去凝聚9。促使核膜破裂，核内容物被排出并与细胞质颗粒融合形成 NETs。（2）vital NETosis：通常发生在中性粒细医药前沿 2024年1月 第14卷第2期 综述 31胞激活后的 5 60 min。当用金黄色葡萄球菌、LPS和白色念珠菌刺激中性粒细胞时，产生 Toll 样受体 2（Toll-like receptor 2）、Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）和 C3 补体蛋白触发激活 PAD4，使得 NE 向细胞核移位，参与染色质去凝集，随后蛋白质修饰的染色质通过小泡排出而不破坏细胞膜。不同于 suicidal NETosis，vital NETosis 在 NETs 释放后，中性粒细胞仍然可以存活并发挥吞噬病原体的功能，其寿命不会缩短10。（3）mitochondrial NETosis：通常发生在中性粒细胞激活后 15 min 内。当粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）、LPS 或补体 C5a 刺激时，线粒体 DNA 被释放以形成 NETs，并且没有中性粒细胞死亡11。以上 3 种NETosis 各有不同特点，属于公认的 NETs 的形成机制。但 NETs 的形成机制仍然存在争议，需要进一步研究。2 NETs 在 AIS 诊断及预测中的作用生物标志物可以提高诊断准确性，预测临床结果，并监测疾病进展。Dring 等12试验得出急性冠状动脉综合征、缺血性脑卒中和急性外周动脉疾病患者血栓中存在的NETs。Shi等13对卒中患者血栓的组织学分析显示，NETs 存在于所有血栓中，尤其是血栓外层。Savchenko等14证明了 NETs 是血栓形成初始阶段的标志物，其水平升高与 AIS 的发展有关。2.1 瓜氨酸组蛋白 H3（citrullinated histone H3,citH3）CitH3 被认为是 NETs 特异性生物标志物15。它是心肌梗死、脑卒中、支架血栓形成和心血管死亡的独立预测因子16。Valls 等17首次证明，与健康受试者相比，AIS 患者的血浆 NETs 标志物显著增加，CitH3 增加 70%，在随后 1 年的随访调查中，发现 CitH3 水平与AIS 患者的全因病死率独立相关。Thlin 等18提出了血浆中 CitH3 可作为判断 AIS 患者预后不良的标志物。然而，CitH3 作为 NETosis 的生物标志物的局限性在于只有PAD4 依赖性 NETosis 是可检测的，其应该与其他生物标志物联合 MPO 用于指示 NETosis。2.2 MPO-DNAMPO 是中性粒细胞的特异性标志物，MPO-DNA 是NETs 的典型结构19。MPO-DNA 水平对于所有 NETosis途径形成的 NETs 都可检测。Witsch 等20检测到 MPO-DNA 作为 NETs 的生物标志物，可指示延迟性脑缺血的早期阶段。Denorme 等21发现血浆 CitH3 和 MPO-DNA含量均与卒中结果呈正相关。MPO-DNA 似乎是目前监测 NETosis 最特异、最客观、最定量的生物标志物22。除此之外，细胞游离 DNA（cell-free DNA,cfDNA）作为 NETs 的主要成分也常用于 NETs 的检测，并且 NE等 NETs 的蛋白组分也被广泛应用于 NETs 的检测。在许多情况下，MPO-DNA 与 cfDNA 或 CitH3 联合检测，以更好地指示 NETs 水平23。总之，与 NETs 相关的成分，如 CitH3、MPO-DNA、cfDNA 和 NE，均可能成为诊断卒中、预测卒中严重程度和评估预后的生物标志物，但NETs 作为生物标志物的临床应用仍面临一些困难，需要进一步开发、验证和标准化12。3 NETs 在动脉粥样硬化发生及治疗中的作用2012 年，Megens 等24首次通过免疫组织化学染色证明了NETs在小鼠和人类动脉粥样硬化斑块中的存在。Borissoff 等25关于细胞外 DNA 形成与动脉粥样硬化关系的研究还发现 NETs 参与动脉粥样硬化的病理发展。NETs 直接激活并损伤动脉粥样硬化的内皮细胞，在人类冠状动脉上皮细胞中产生组织蛋白酶G和白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）诱导细胞凋亡26。NETs 的DNA 骨架激活动脉粥样硬化斑块中的浆细胞样树突状细胞并加重动脉粥样硬化27。NETs 的组织蛋白酶介导动脉粥样硬化单核细胞的聚集并促进内皮细胞增殖28。自身抗原蛋白-DNA 复合物刺激血管壁上的浆细胞样树突状细胞，导致型干扰素反应和动脉粥样硬化27。在富含平滑肌细胞的动脉粥样硬化斑块中，大量中性粒细胞和 NETs 积聚，通过 TLR2 依赖性机制诱导氧化应激和内皮细胞凋亡和动脉粥样硬化29。NETs 刺激巨噬细胞释放细胞因子，激活辅助 T 细胞 17，并使免疫细胞在动脉粥样硬化斑块中积累30。Tall 等31的研究表明，炎症小体的激活导致细胞膜孔的形成，细胞膜孔释放 IL-1、IL-18 和 NETs，以促进动脉粥样硬化。Knight 等32发现，PAD4 抑制剂 Cl-amidine 通过抑制 NETs 形成改善了小鼠的动脉粥样硬化病变。用 DNase 治疗糖尿病小鼠的动脉粥样硬化斑块 4 周，NETs 减少68%，并抑制巨噬细胞诱导的炎症小体和糖酵解途径33。针对性调节NETs的形成和降解可以缓解动脉粥样硬化。NETs 可能是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点，抑制 NETs可以缓解动脉粥样硬化并预防卒中。4 NETs 在动脉血栓形成中的作用NETs 可通过激活内外凝血途径来促进血栓形成。炎症细胞和 NETs 诱导血管损伤后，内皮下的组织因子(tissne facfor TF)暴露并启动外源性凝血途径。它作为血浆因子/a 的细胞受体。因子 a-TF 复合物激活因子和因子。激活的因子 a 与其辅因子 a 构成凝血酶原复合物（prothrombin complex），将凝血酶原切割成凝血酶，进而将纤维蛋白原切割成纤维蛋白34-35。NETs 的网络结构为血小板、红细胞、纤维蛋白原、血管性血友病因子（von Willebrand factor,vWF）等物质的沉积提供了支架，这些物质有助于血栓形成34。此外32 医药前沿 2024年1月 第14卷第2期 综述NETs 中的组蛋白可以通过纤维蛋白原、TLR2 和 TLR4的相互作用吸引血小板聚集和活化，并促进凝血酶的产生。组蛋白还可以促进组织因子在血管内皮和巨噬细胞上的表达，并促进凝血35。NE 和组织蛋白酶 G 通过水解组织因子途径抑制剂（tissue factor pathway inhibitor,TFPI）促进组织因子和凝血因子诱导的内源性凝血途径。凝血因子也可以通过与 NETs 的连接与周围的血小板和 DNA 结合来扩大凝血，促进血栓形成12。NETs 可以与纤连蛋白和 vWF 相互作用，以吸引和促进血小板黏附和活化。NETs 与血栓中纤维蛋白原的连接也可以促进纤维蛋白沉积，提高血栓稳定性。在小鼠模型中使用脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）可以有效地防止血管内微血栓的形成，这表明 NETs 对血栓形成有明显作用36。Nouboussie 等37指出，NETs 对血栓形成的促进作用是通过其 DNA 及组蛋白成分实现的。活化的血小板可以通过选择素 P（P-selectin）和 HMGB1 等机制促进 NETs 的形成和释放38。可以看出 NETosis 和血栓形成之间作用是相互的，这种相互加强的级联反应可能在血栓形成过程中发挥重要作用。NETs 在不同病因和不同起源中的血栓中是否可能具有不同的作用机制，组织微环境和血管差异是否可以在血栓形成中改变 NETs，以及 NETs 在动脉血栓形成中的其他作用，还有待进一步探索。5 NETs 在 AIS 治疗中的作用5.1 耐 NETs 和 tPA 血栓血管再通是卒中治疗的主要目标。目前血管再通主要有两种方法：静脉溶栓和机械取栓术。但两者的治疗效果不尽如人意。尤其是在闭塞性富含血小板的血栓的情况下，这种血栓几乎不含纤维蛋白，因此对溶栓药物具有极强的耐药性39。研究者使用无纤维蛋白血栓的小鼠卒中模型证明，通过给予 DNase 以促进 NET 裂解和用 PAD4 抑制剂预防性治疗以防止 NETs 形成，可以消除上述 tPA 抗性血栓形成39。Dring 等12证明，DNase 能有效溶解从缺血性卒中患者身上回收的新鲜富含血小板的血栓。当 DNase 与标准 tPA 治疗相结合，患者血栓的离体溶解更成功。总之，主要由 NETs 以血小板TLR4 依赖方式形成的富含血小板的血栓对 tPA 的裂解具有抗性，但对 DNase 的裂解没有抗性。Ducroux 等40证明，血栓 NETs 含量高可能是再灌注阻力的原因。瓜氨酸化 HMGB1 的其他功能可能与 NETosis 和血栓形成有关，需要进一步研究。5.2 NETs 对神经元的潜在影响脑卒中病变中 NETs 的存在对本已脆弱的神经组织产生了不利影响。Cai 等41研究表明，神经元缺血促进了 NETs 的形成，并且 NETs 进一步增加了缺血性损伤后的神经元死亡。一项研究表明，缺血性脑卒中腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）的积累可能介导NETosis 和神经元损伤之间的循环，从而加剧炎症和随后的脑损伤38。此外，NETs 成分可能对脑实质中的神经细胞有害，其能酶解细胞外基质蛋白，激活炎症小体途径和线粒体凋亡途径42-43。NETs 作用于各种神经细胞的直接机制尚未得到彻底研究。尽管中性粒细胞是缺血性损伤后暂时存在于大脑中的细胞，但中性粒细胞释放的 NETs 可能会在梗死区持续存在，并继续攻击脆弱的神经元。目前的研究集中在 NETs 在缺血性脑卒中急性期的作用上，未来的研究需要集中在恢复期的 NETs 上，这可能为缺血性卒中患者后期的功能恢复提供治疗靶点。总的来说，这些发现有力地表明，NETs 可能对卒中后延迟阶段的退行性变化至关重要。6 小结NETs 在血栓形成及 AIS 的发生发展中具有重要作用。NETs 可以诱导血栓形成，其特有的网状结构也为血栓提供了支架，并促进凝血级联，有助于卒中的发展。脑卒中后，组蛋白、MPO 和 NE 等 NETs 的主要成分可诱导炎症反应，损伤脑血管内皮，抑制血管生成，促进动脉粥样斑块生成。血栓和外周血中 NETs 的主要成分可以预测卒中的严重程度，可能是卒中诊断和预后的潜在生物标志物。PAD4 抑制剂通过抑制 NETs 的形成在卒中治疗中发挥重要作用，并有潜力被开发为卒中治疗药物。tPA 和 DNase 的结合可以同时降解血栓中的纤维蛋白和 NETs，并进一步提高 tPA 的溶栓耐药性。目前，临床上用于脑卒中治疗的药物主要是溶栓药物和神经保护药物。抑制 NETs 不仅可以影响血栓的形成和溶解，还可以发挥神经保护作用，具有重要的临床开发价值，是理想的脑卒中治疗药物靶点。综上所述，更加深入细致地研究 NETs 形成的确切机制，以及 NETs 在脑卒中发生发展中扮演的角色，对于阐明缺血性脑卒中的发生机制及发现新的诊疗手段具有重要的临床意义。【参考文献】1 GBD 2016 NEUROLOGY COLLABORATORS.Global,regional,and national burden of neurological disorders,1990-2016:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016J.Lancet Neurol,2019,18(5):459-480.2 CHAMORRO,DIRNAGL U,URRA X,et al.Neuroprotection in acute stroke:targeting excitotoxicity,oxidative and nitrosative stress,and inflammationJ.Lancet Neurol,2016,15(8):869-881.3 BRINKMANN V,REICHARD U,GOOSMANN 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