当归、红芪提取物对人肝癌S...-7721细胞辐射增敏作用_王玥.pdf

甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6基础研究恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病，放射治疗是治疗肿瘤的重要手段之一，临床上约 70%的恶性肿瘤患者需要放射治疗。但射线或者药物耐药性影响了肿瘤放化疗的效果1。化疗增敏剂能通过与化疗药物协同作用提高化疗药物的疗效。增敏药物属于抗癌药物的一个分支，通过克服肿瘤细胞对放射或抗癌药物的耐受性，提高对肿瘤细胞的杀伤效果，增强肿瘤药物或射线的作用2。目前常用的增敏剂主要有卤代嘧啶类增敏剂、铂类制剂、中药等。中药类制剂近年来广泛引起大家的关注3，中药类制剂通过改善血液循环、提高瘤体的氧效应、降低肿瘤细胞的氧耗量以及增强对肿瘤细胞 DNA 的辐射损伤起增敏作用4。现有实验表明，当归多糖能明显降低 K562 细胞的 bcl-2 蛋白表达5。红芪多糖通过诱导S180 瘤细胞凋亡而抑制肿瘤的生长6。但关于当归、红芪提取物协同辐射的增敏作用的文献未见报道。p21 在细胞周期控制与肿瘤发生中有重要作用，通过协调细胞周期、DNA 复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连。放射引起肿瘤细胞 DNA 损伤，引起 p53 蛋白增高，从而启动 p21 基因转录，使 p21 蛋白含量增加，并与相关细胞周期调节因子结合，阻止受损的 DNA 进入 S 期复制，从而引起 G1 期的阻滞，通过解除放射后出现的 G1或 G2 周期阻滞，使受损的 DNA 进入 S 期或 M 期复制，可以使肿瘤细胞出现异常增殖而死亡。因此，检测细胞中 p21 蛋白含量，可预测肿瘤细胞增殖周期变化，并可作为治疗靶点抑制肿瘤生长。本研究通过观察当归、红芪提取物协同直线加速器对体外培养的人肝癌 SMMC-7721 细胞的作用，从细胞、分子水平探讨当归、红芪提取物增敏机制，为其临床应用提供科学依据。1材料与方法1.1细胞株人肝癌 SMMC-7721 细胞株由兰州大学提供。1.2主要仪器及试剂二氧化碳培养箱（BB16UV 德国 Heraeus 公司）、倒置相差光学显微镜（IX71 型，日本Olympus 公司产品）、直线加速器、流式细胞仪、酶标仪、透射电镜等。新生牛血清（杭州四季青生物材料工程研究）、DMEM 培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）、胰蛋白酶消化液、MTT 溶液、PBS 溶液当归、红芪提取物对人肝癌 SMMC-7721 细胞辐射增敏作用王玥段惠春甘肃中医药大学第四附属医院/甘肃宝石花医院，甘肃 兰州 730060【摘要】目的：探讨当归、红芪提取物对直线加速器（X 射线）辐射后人肝癌细胞 SMMC-7721 的增敏作用。方法：96 孔板培养人肝癌细胞 SMMC-7721，设 9 个组，对照组（N）即正常对照组，纯辐射组（F）给以源皮距 100cm 4Gy 的 X 射线，另设 3 个纯药物组（DH），设高（H：8mg/mL）、中（M：6mg/mL）、低（L：4mg/mL）三个药物浓度梯度，3 个辐射加药组（F+DH）和 1 个空白组（只有培养液无细胞）。每组设 6 个复孔。采用 MTT 法计算当归、红芪提取物对人肝癌 SMMC-7721 细胞辐射前后增殖活性的影响。流式细胞术检测不同组细胞的周期情况，透射电镜及倒置显微镜分别观察各组细胞结构变化，用蛋白印记法检测不同组细胞中 p21 蛋白表达情况。结果：MTT 法证明当归、红芪提取物具有抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 增殖作用，对于辐射后的肝癌细胞具有很好的周期抑制作用。不同剂量当归、红芪提取物作用于细胞 24h 后，抑制人肝癌细胞 SMMC-7721 增殖呈剂量依赖关系，药物浓度越高，抑制作用越显著。SMMC-7721细胞经辐射后，细胞的抑制率为 37.58，辐射后加不同浓度当归、红芪提取物（4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL），联合作用对细胞的抑制率升高，分别为 45.27%、51.86%、59.34%，且呈药物浓度依赖关系，差异具有统计学意义（P0.01）。辐射组肝癌细胞较正常组细胞 G0/G1期细胞数明显增多，由 44.70升至 71.60（P0.01），S 期细胞减少，高浓度药物也可以使 G0/G1 期细胞比例有所升高（P0.01）。辐射加药组细胞 G0/G1 期阻滞最为明显，并呈药物浓度梯度关系。高浓度药物组、辐射组细胞 p21 蛋白表达较正常组升高，辐射组+高浓度药物组细胞 p21 蛋白表达较辐射组明显升高。结论：当归、红芪提取物对于人肝癌 SMMC-7721 细胞具有很好的抑制作用，对经 X 线辐射后的细胞具有很好的增敏作用。【关键词】当归、红芪提取物；细胞周期；X 射线辐射；人肝癌 SMMC-7721 细胞；p21 蛋白中图分类号：R285文献标志码：A文章编号：1004-2725（2023）06-0485-05第一作者：王玥，女，主治医师，从事心律失常及冠心病等心血管疾病的药物及介入治疗工作通信作者：段惠春，女，副主任医师，从事肝硬化、肝癌等消化疾病的诊治工作。E-mail：485DOI:10.15975/ki.gsyy.2023.06.012甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6注：与 N 组相比，aP0.01表 1当归、红芪提取物对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用（x-s）等。当归、红芪提取物（当归、红芪超滤膜提取物采用超滤膜分离技术提取，药材按 1 5 的比例混合，经过煎煮、粗滤、微滤、浓缩。浓缩后的每 mL 药液含生药量为1g，最后将浓缩后的药液经喷雾干燥仪喷成干燥粉末分装，干燥阴凉处贮藏备用）。1.3人肝癌 SMMC-7721 细胞培养细胞培养置37、5%CO2的培养箱中，用含 10%新生牛血清以及浓度为 0.1%青链霉素的 DMEM 培养液培养，倒置显微镜观察细胞生长情况，2.5%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。1.4MTT 法测定药物及辐射对 SMMC-7721 细胞的增殖活力影响采用 96 孔培养板，设 9 个组，对照组（N），纯辐射组（F）给以源皮距 100cm 4Gy 的 X 射线，另设 3个纯药物组（DH），设高、中、低三个药物浓度梯度，分别为 8mg/mL（DHH 组）、6mg/mL（DHM 组）、4mg/mL（DHL 组），3 个辐射加药组（F+DH，分别为 F+DHH 组，F+DHM 组，F+DHL 组）和 1 个空白组（只有培养液无细胞）。每组设 6 个复孔。取对数生长期的 SMMC-7721细胞，浓度调整为 1105个/mL，每孔加入 150 L，37、5%CO2培养箱中培养，细胞完全贴壁后吸去上清液，N 组加入 DMEM 培养液 50L。DH 组分别加入不同浓度的药物 50L，F+DH 组为辐射后立刻加入不同浓度的药物 50L。各组细胞均培养 24 小时后，加入 MTT溶液（5mg/mL）20L，孵育 4h，吸取上清，加入 DMSO150L 震荡混匀，空白调零孔操作和上述一样。酶标分析仪 492nm 波长处测 OD 值，按下面公式计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率（%）=（N 组 OD 值-加药各组 OD值）/N 组 OD 值100%。1.5倒置显微镜观察细胞形态的变化倒置显微镜下观察培养瓶内正常组细胞、辐射组（辐射后继续培养24h）及辐射加药组（辐射后立刻换成高、中、低浓度药物培养 24h 后）细胞形态变化，并拍照。1.6电镜观察细胞内部超微结构的变化不同组细胞经 0.25%的胰酶消化，用 PBS 洗两遍后，离心收集到EP 管中，加入固定液（含 2.5 的戊二醛等），过夜，再用10mg/mL 锇酸固定，逐级乙醇脱水，氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，于透射电子显微镜下观察细胞形态学变化并拍照。1.7药物协同 X 射线对体外培养的 SMMC-7721 细胞的作用1.7.1流式细胞术检测细胞周期情况。各组细胞培养24h 小时后用胰酶消化，经 PBS 洗三遍，离心 1000 转5 分钟收集（15）106细胞 2mL 在 EP 管中加入 70%的预冷乙醇 2mL，吹散后 4保存，每管细胞加入碘化比定 10L，避光染色 30min 上机检测。1.7.2Western-blot 检测细胞中 p21 蛋白含量的情况。实验分组与前述相同，各组细胞经胰酶消化，用 PBS洗两遍，每瓶细胞加入 400L 含 PMSF 的细胞裂解液。裂解 30 min，在 4低温离心机 12000 转离心 5min，取上清液。提取蛋白后，用 BCA 试剂盒检测蛋白含量，每孔上样蛋白量保持一致，电泳，经后转 PVEF 膜，封闭后加入 p21 一抗（1 200 稀释），4孵育过夜，加入二抗（1 5000 稀释）再孵育 2h，化学发光法显色。1.8数据统计处理采用 SPSS22.0 统计学软件处理本研究获取数据。符合正态分布的计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比较采用 t 检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用 2检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1当归、红芪提取物对 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用影响不同浓度当归、红芪提取物作用于细胞24h，SMMC-7721 细胞 OD 值下降，说明药物对细胞生长具有抑制作用。低、中、高浓度药物对细胞的抑制率分别为 4.72、9.78、15.71，各组抑制率差异具有统计学意义，且呈药物浓度依赖关系（P0.01）。见表 1。2.2当归、红芪提取物联合辐射对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用SMMC-7721 细胞经辐射后，OD 值下降，辐射对细胞的抑制率为 37.58，照射后加药细胞的 OD 值进一步下降，F+DHL 组、F+DHM组、F+DHH 组抑制率分别为 45.27%、51.86%、59.34%，且呈药物浓度依赖关系，差异具有统计学意义（P0.01）。见表 2。2.3当归、红芪提取物及辐射处理前后倒置显微镜下SMMC-7721 的形态学变化镜下正常组细胞形态规则呈花瓣状，密度较高，细胞膜完整光滑（图 1）；辐射组细胞外形无明显改变，但密度明显下降（图 2）；辐射加低浓度药物组细胞密度进一步下降（图 3）；辐射加组别DH 浓度（mg/mL）nOD抑制率（）N060.9100.0140DHL460.8670.014a4.72aDHM660.8210.018a9.78aDHH860.7670.022a15.71a486甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6图 10正常组（N）图 11辐射组（F）图 5辐射加高浓度药物组细胞形态（F+DHH）图 9辐射加高浓物药物组细胞形态（F+DHH）表 2 当归、红芪提取物联合辐射对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖抑制作用（x-s）注：与 N 组相比，aP0.05；与 F 组相比，bP0.05中药物浓度组细胞形态不规则，细胞体积明显缩小（图4）；辐射加高浓度药物组细胞大多已成圆形，丧失本来细胞形态，核染色质边集（图 5）。2.4当归、红芪提取物及辐射处理前后透射电镜下SMMC-7721 的形态学变化正常组细胞形态规则，核染色质分布均匀，核仁清晰，细胞膜完整（图 6）；辐射组细胞核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，细胞膜皱缩粗糙不完整（图 7）；高浓度药物组细胞核染色质边集、浓缩，线粒体肿胀，内质网扩张，出现空泡变性（图8）；辐射加高浓物药物组细胞线粒体进一步肿胀，空泡变性加重，细胞形态改变明显（图 9）。2.5流式细胞仪检测细胞周期分布辐射组肝癌细胞较正常组而言 G0/G1期细胞数明显增多，由 44.70升至 71.60（P0.01），S 期细胞减少，高浓度药物也可以使G0/G1期细胞比例有所升高（P0.01），辐射加药组细胞G0/G1期阻滞最为明显，虽然 F+DHL 组细胞 G0/G1期阻滞百分比与 N 组比无统计学意义，但 F+DHM 组与F+DHH组G0/G1期细胞比例较N组显著升高（P0.01），并呈药物浓度梯度关系。见图 1015。组别DH 浓度（mg/mL）nOD抑制率（）N060.9100.0140F060.5680.065a37.58aF+DHL460.4980.049ab45.27abF+DHM660.4380.042ab51.86abF+DHH860.3700.028ab59.34ab图 1正常组细胞形态（N）图 2辐射组细胞形态（F）图 3辐射加低浓度药物组细胞形态（F+DHL）图 4辐射加中药物浓度组细胞形态（F+DHM）图 6正常组细胞形态（N）图 7辐射组细胞形态（F）图 8高浓度药物组细胞形态（DHH）487甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6注：与 N 组比aP0.05，与 F 组比bP0.05表 3细胞周期 DNA 含量分布表图 12高浓度药物组（DHH）图13辐射加低浓度药物组（F+DHL）图 15辐射加高浓度药物组（F+DHH）图 14辐射加中药物浓度组（F+DHM）2.6细胞周期 DNA 含量分布表F 组较 N 组 G0/G1期细胞数明显增多，DNA 含量升高（P0.01），S 期细胞减少，高浓度药物组 G0/G1期细胞比例有所升，DNA含量升高（P0.01）。见表 3。2.7当归、红芪提取物及辐射对细胞内 p21 蛋白表达的影响DHH、F 组、F+DHH 组细胞 p21 蛋白表达较N 组升高，差异有统计学意义（P0.05）。从而分别证实辐射、高浓度药物均能增加细胞内 P21 蛋白的含量，F+DHH 组细胞内 p21 蛋白含量最高，其抑制肿瘤作用最强。见图 16。3讨论放疗是一种有效的治疗肿瘤的手段，由于放射线的电离破坏作用对肿瘤细胞和正常组织细胞无选择性，因此，采用放疗治疗肿瘤的过程中，放射线不仅可以杀伤肿瘤细胞，同时也会破坏正常细胞，产生不良反应，而在放疗同时，如何有效地降低放射剂量，减少放射对正常细胞的损伤是放疗最需要解决的问题之一7。20 世纪 80 年代，我国开始进行有关中医药防治放疗不良反应的研究，大量临床研究表明中医药配合肿瘤放疗应用，具有减轻放射性炎症损伤、控制放疗后骨髓抑制、减轻消化系统反应、提高放疗完成率及临床疗效等辅助作用。本实验 MTT 证实当归、红芪提取物能抑制肿瘤细胞的活性，在辐射后加入药物能进一步提升辐射对肿瘤细胞的抑制率，随着药物浓度的增加，抑制率呈浓度依赖关系（后续实验由于经费原因故选择电镜观察形态学改变明显的高浓度药物组和辐射加高浓度药物组）。干预后，通过显微镜及电镜观察肝癌细胞外部形态及内部超微结构的变化也表明了当归、红芪提取物具有很好的细胞抑制作用。流式结果显示，4GyX 射线辐射后 24h 可使肝癌细胞 G0/G1期细胞数明显增多，药物也可以使 G0/G1期细胞比例有所升高，中低药物组较正常组对细胞周期影响不大，故选择高药物浓度组及辐射加药组细胞 G0/G1期阻滞最为明显并呈浓度梯度关系。由此我们可得知辐射及药物抑制细胞生长作用的靶点主要在于使细胞阻滞在 G0/G1期。我们知道在细胞周期的调控中，G1/S 期限制点起着极为重要的限制和调控作用，决定着细胞是继续进入 S 期完成细胞分裂还是退出细胞周期进入静止期（G0期），在增殖周期的细胞一旦越过 G1/S 期限制点，细胞周期的进程就具有了自主性8。肿瘤是细胞周期疾病，细胞周期受到细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期依赖性蛋白激酶（CDKs）及其抑制剂 CDKIs 的共用调控。这些调控因子活性的改变直接影响细胞周期进程，进而影响细胞增殖，与肿瘤的发生密切相关9。而细胞周期基因调控的中心环节就是周期依赖性蛋白激酶（CDKs）10。p21 蛋白作为主要的一种抑制调节因，可特异的抑制 CDKs 的活性，使其不能解除 Rb 基因对转录因子的抑制从而阻止细胞从 G1期进入 S 期，抑制细胞的增殖，在细胞增殖与凋亡平衡条件中起重要作用11。研究表明，p21 与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关，具有判断预后的价值12。实验结果表明当归、红芪提取物能提高肝癌细胞中组别细胞周期（）细胞数量G0/G1S+G2/MN44.712.3055.362.309021110F71.630.80a28.420.80a705897DHH51.551.93ab48.511.93ab445186F+DHL74.362.19ac25.732.20ac897357F+DHM78.321.32ab21.721.32ab7988106F+DHH80.891.11ab19.161.28ab884064-actin-p21N 组F+DHH 组 DHH 组F 组图 16当归、红芪提取物及辐射对细胞内 p21 蛋白表达的影响（下转第 496 页）488甘肃医药 2023 年 42 卷第 6 期Gansu Medical Journal，2023，Vol.42，No.6p21 蛋白的含量，其中 DHH 组及 F+DHH 组细胞 p21 蛋白含量明显升高，故选择这两组较单辐射组细胞及正常组细胞，可能使癌细胞内 p21 蛋白含量增加从而使细胞停留在 G0/G1期，抑制其进一步的分化有关。由此我们可得知当归、红芪提取物为一种能够有效抑制体外培养肝癌细胞生长的药物，同时也是一种有效的辐射增敏剂，能够有效提高肿瘤细胞的辐射敏感性，作为放射治疗的辐射增敏剂，具有广泛的应用前景。参考文献1 卿晨.恶性肿瘤化疗研究耐药及克服耐药的研究 J.昆明医科大学学报，2013，34（1）：1-3.2 郑芸，吴敬波.肿瘤化疗增敏剂的研究现状及应用进展 J.西南军医，2010，12（3）：506-508.3 张荣新.新型放疗增敏多肽 ANTP-SmacN7 对肺癌细胞的辐射增敏作用及机制研究 D.天津：天津医科大学，2020.4 周水洪，戴利波，范骏，等.姜黄素单独及联合 GLUT-1 siRNA 通过活化的 AMPK 通路诱导喉癌细胞自噬的辐射增敏作用 M.浙江：2020 年浙江省医学会耳鼻咽喉头颈外科学学术大会论文汇编，2020：135-136.5 宋姝丹，华自森，王亚平，等.当归多糖对 K562 细胞 EpoR 介导的信号转导通路研究 J.生物技术，2009，19（2）：15-18.6 雷丰丰，赵建雄红芪总多糖诱导 S180 瘤细胞凋亡的实验研究 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