东方百合LoABI1基因的克隆及表达分析.pdf

西北植物学报,2 0 2 3,4 3(2):0 1 9 0-0 2 0 1A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 2.0 1 9 0 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 2-0 9-0 1;修改稿收到日期:2 0 2 2-1 2-1 8基金项目:国家自然科学基金(3 1 6 7 2 1 9 1);中央高校基本科研业务费专项(Y X 2 0 1 5-1 6)作者简介:赵一燃(1 9 9 9-),女,在读硕士研究生,主要研究方向为花卉种质资源创新与育种。E-m a i l:1 4 4 9 9 6 1 2 8 3q q.c o m*通信作者:何恒斌,副教授,主要从事花卉种质资源创新与育种研究。E-m a i l:h e n g b i n h e_1 2 2 0b j f u.c n东方百合L o A B I 1基因的克隆及表达分析赵一燃,胡钧舒,朱云涛,孙婷婷,何恒斌*(花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室,国家花卉工程技术研究中心,城乡生态环境北京实验室,教育部林木花卉育种实验室,北京林业大学 园林学院,北京 1 0 0 0 8 3)摘 要:该研究以东方百合 索邦 为材料,采用 R T-P C R 扩增方法克隆A B I 1基因,对其进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量 P C R 检测其组织表达特性和低温处理过程及定植后的表达特征,以明确A B I 1基因 的功能特性,为解析百合A B A 信号转导途径及其调控低温解除休眠过程的机理奠定基础。结果表明:(1)成功克隆得到东方百合L o A B I 1基因,其编码序列长度为1 3 4 1 b p,共编码4 4 6个氨基酸;L o A B I 1氨基酸序列中含有1个蛋白磷酸酶 2 C(P P 2 C)保守结构域。(2)系统进化分析显示,L o A B I 1蛋白与水稻P P 2 C家族成员O s P P 2 C 0 6的同源进化关系最近,且与拟南芥A t A B I 1聚为一支,同属于P P 2 C基因家族中的A亚群。(3)亚细胞定位发现,L o A B I 1蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞核和细胞质。(4)q R T-P C R荧光定量分析显示,L o A B I 1基因在百合茎生根、嫩茎、叶片及各花部组织中均有表达,且在幼嫩组织中表达量较高;L o A B 1 I基因在冷藏期间的表达量呈先升高后降低的趋势,并于 冷藏期第5周达到峰值,但在定植期间持续下降且保持较低水平。(5)经4 低温处理6 0 d的百合鳞茎在定植后1 4 2 8 d能发芽、2 8 4 8 d可见花蕾,而不进行低温处理的鳞茎既不萌芽也不开花。研究推测,百合L o A-B I 1 基因可能在低温解除种球休眠过程中具有重要作用,L o A B I 1蛋白可能在百合A B A信号转导过程中发挥作用。关键词:东方百合 索邦;A B I1基因;克隆;基因表达中图分类号:Q 7 8 5;Q 7 8 6文献标志码:AC l o n i n g a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f L o A B I 1 i n L i l i u m O r i e n t a l H y b r i dZ HAO Y i r a n,HU J u n s h u,Z HU Y u n t a o,S UN T i n g t i n g,HE H e n g b i n*(B e i j i n g K e y L a b o r a t o r y o f O r n a m e n t a l P l a n t s G e r m p l a s m I n n o v a t i o n a n d M o l e c u l a r B r e e d i n g,N a t i o n a l E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r f o r F l o r i c u l t u r e a n d B e i j i n g L a b o r a t o r y o f U r b a n a n d R u r a l E c o l o g i c a l E n v i r o n m e n t,C o l l e g e o f L a n d s c a p e A r c h i t e c t u r e,B e i j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 0 0 8 3,C h i n a)A b s t r a c t:I n t h i s s t u d y,A B I 1 g e n e w a s c l o n e d f r o m L i l i u m o r i e n t a l h y b r i d S o r b o n n e b y R T-P C R,a n d t h e b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s w e r e p e r f o r m e d.M e a n w h i l e,t h e q R T-P C R w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n p a t t e r n s o f L o A B I 1 i n l i l y a t d i f f e r e n t t i s s u e s a n d i n t h e p r o c e s s o f l o w t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t a n d a f t e r t r a n s p l a n t i n g,f o r c l a r i f y i n g t h e f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f L o A B I 1 g e n e a n d l a y a f o u n d a t i o n f o r t h e a n a l y s i s o f t h e A B A s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y a n d t h e m e c h a n i s m o f b r e a k i n g d o r m a n c y a t l o w t e m p e r a-t u r e i n l i l y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t:(1)t h e L o A B I 1 g e n e o f l i l y w a s c l o n e d s u c c e s s f u l l y.T h e c o d i n g s e-q u e n c e o f L o A B I 1 w a s 1 3 4 1 b p l o n g a n d L o A B I 1 e n c o d e d 4 4 6 a m i n o a c i d s c o n t a i n i n g a c o n s e r v e d p h o s-p h a t a s e 2 C(P P 2 C)d o m a i n.(2)P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t L o A B I 1 w a s c l o s e s t t o O r y z a s a t i v a a n d c l u s t e r e d w i t h A t A B I 1,w h i c h i s a m e m b e r o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a P P 2 C g e n e f a m i l y,a n d b o t h o f t h e m b e l o n g t o P P 2 C A g r o u p.(3)T h e s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n r e s u l t s s h o w e d t h a t L o A B I 1 i s l o c a l i z e d i n t h e n u c l e u s a n d c y t o p l a s m o f t o b a c c o e p i d e r m a l c e l l s.(4)R e a l t i m e R T-P C R e x p r e s s i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t L o A B I 1 e x p r e s s e d i n s t e m r o o t,t e n d e r s t e m,l e a f,a n d f l o r a l o r g a n,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l i s h i g h-e r i n t e n d e r t i s s u e s;T h e e x p r e s s i o n o f L o A B I 1 i n c r e a s e d a t f i r s t r e a c h i n g t h e p e a k a t t h e f i f t h w e e k o f c o l d s t o r a g e,a n d t h e n d e c r e a s e d d u r i n g c o l d s t o r a g e.F i n a l l y,i t r e m a i n e d a t a l o w-l e v e l d u r i n g c o l o n i z a t i o n.(5)T h e l i l y b u l b s t r e a t e d a t 4 f o r 6 0 d a y s c o u l d g e r m i n a t e a t 1 4-2 8 d a y s,a n d t h e b u d s c o u l d b e s e e n a t 2 8-4 8 d a y s a f t e r t r a n s p l a n t i n g,w h i l e t h e b u l b s w i t h o u t l o w t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t n e i t h e r g e r m i n a t e d n o r f l o w e r e d.I t i s s p e c u l a t e d t h a t L o A B I 1 g e n e m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e p r o c e s s o f b r e a k i n g b u l b s d o r m a n c y a t l o w t e m p e r a t u r e,a n d L o A B I 1 p r o t e i n m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n l i l y A B A s i g n a l t r a n s d u c t i o n.K e y w o r d s:L i l i u m o r i e n t a l h y b r i d S o r b o n n e;A B I 1 g e n e;c l o n i n g;g e n e e x p r e s s i o n 休眠是一个复杂的生理过程,是对环境条件和季节性气候变化的生物学适应的结果,表现为含有分生组织的植物组织暂时停止生长1-2。已有报道认为,休眠是由内源激素中促进生长的激素与抑制生长的激素之间的平衡状态来决定的,抑制生长的激素(如脱落酸(A B A)的积累是引起休眠的原因,而休眠过程中促进生长的激素 生长素(I AA)、赤霉素(GA)和细胞分裂素(C T K)的积累,是休眠解除的原因2。通常认为高水平的抑制物与鳞茎植物的休眠有关,其中以脱落酸为主,它存在于休眠组织和正在进入休眠的器官中,参与休眠的建立和维持,可能是引起休眠最重要的激素3。脱落酸在质体和细胞质中合成后,需要完成跨膜运输和信号转导,实现A B A信号由受体蛋白到转录因子最终到达靶基因的信号转导和应答4。拟南芥中,植物蛋白磷酸酶2 C(p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 C,P P 2 C)会抑制S n R K 2(s u c r o s e n o n-f e r m e n t i n g 1-r e l a t e d p r o t e i n k i n a s e 2)激酶活性,导致A B A信号途径无法被启动;当植物体内脱落酸含量升高时,脱落酸会被受体蛋白P Y R/P Y L/R C A R(p y r a b a c-t i n r e s i s t a n c e/p y r a b a c t i n r e s i s t a n c e-l i k e/r e g u l a t o r y c o m p o n e n t o f a b s c i s i c a c i d r e c e p t o r s)感知和结合,同时形成与P P 2 C结合的界面,从而阻碍其与金属离子的结合,最终导致P P 2 C的磷酸酶活性被抑制,S n R K 2被释放,进而激活了A B A信号途径下游基因的表达5。在高等植物中,P P 2 C蛋白磷酸酶通过A B A介导的信号途径参与调节多个生理过程6-1 0,包括种子的萌发与休眠,幼苗根系的伸长,保卫细胞及离子通道调控和气孔关闭,逆境胁迫的响应等1 1-1 2。目前,拟南芥中至少有8 0个P P 2 C 基因被挖掘和研究,其中主要 成员A B I 1(a b s c i s i c a c i d i n s e n s i t i v e 1)、A B I 2(a b s c i s i c a c i d i n s e n s i t i v e 2)、HA B 1(h y-p e r s e n s i t i v e t o A B A 1)、AHG 3(A B A-h y p e r s e n s i-t i v e g e r m i n a t i o n 3)等,均为A B A信号途径的负调控因子1 3-1 6。东方百合品种花色丰富,浓郁芳香,具有很高的商业价值,其中 索邦 百合(L i l i u m O r i e n t a l H y-b r i d s S o r b o n n e)是最主要的切花品种之一1 7。百合鳞茎具有自然休眠的特性,休眠解除与否直接关系到种球质量和切花品质。未解除休眠的鳞茎种植后会出现发芽率低和盲花等现象,低温处理是最常用的解除百合鳞茎休眠的方法3,但休眠解除机理仍不明晰。本研究以东方百合 索邦 为材料,克隆得到A B I 1基因,并进行生物信息学分析,在此基础上分析了A B I 1基因在鳞茎低温处理过程及种植后的表达模式,以期了解A B I 1的有关特性,从而为解析百合A B A 信号转导途径及其调控的低温解除休眠过程提供分子生物学基础。1 材料和方法1.1 试验材料以2 0 1 8年1 2月底在北京市怀柔基地种植的东方百合 索邦 为试验材料,分别取茎生根、上部叶、下部叶、嫩茎、花被片、花药、花丝、柱头、花柱、子房1 0种组织,用于荧光定量表达分析,每个样品取至少3个生物学重复。以上所有材料经过液氮速冻后,立即放于-8 0 冰箱。根据前人的研究结果和课题组前期试验得到的百合种球解除休眠所需低温量为依据1 8-1 9,设置取材的时间节点和具体位置。设置常温对照组(2 3)和4 低温冷藏的实验组,于2 0 1 9年8月9日花谢采收前对茎尖进行第一次取材,然后将对照组和实验组分别置入2 3 温室和4 冷库中处理6 0 d,期间每隔7 d对茎尖取材1次,每次至少取3个生物学重复。于2 0 2 0年1 0月8日将对照组和实验组的百合种球定植于温室中(2 3),每隔1 4 d对百合茎尖取材1次,同时统计实验组和对照组植株1912期 赵一燃,等:东方百合L o A B I 1基因的克隆及表达分析的生长发育情况和成花情况。取材时按照百合种球鳞片的着生方式,将种球剥离至高度约1 c m,立即用解剖刀切下茎尖部分,并迅速速冻于液氮后,储存于-8 0 冰箱备用。取材部位见图1。1.2 试验方法1.2.1 总 R N A 的提取与 c D N A 的合成 将取材的组织在液氮条件下充分研磨,使用E A S Y S p i n P l u s植物R NA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总R NA,通过琼脂糖凝胶电泳检 测 合 格 后,保 存 于-8 0 冰 箱 中。使 用Q u a n t i t i e c t R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n K i t 试 剂 盒(Q I AG E N)对各样品的R NA进行反转录,合成c D-NA,并置于-2 0 冰箱保存。1.2.2 A B I 1基因编码序列的克隆 从课题组已有的东方百合 索邦 转录组数据筛选获得预期的A B I 1基因序列,设计克隆引物F 1和R 1(表1),以东方百合 索邦 上部叶片的c D NA为模板,使用KO D-P l u s-N e o高保真酶(东洋纺生物科技有限公司),对A B I 1基因编码区序列进行扩增。参照说明书配 置P C R反 应 液:1 0P C R b u f f e r 5 L,2 mm o l/L d NT P s 5 L,2 5 mm o l/L M g S O4 3 L,引物F 1和R 1 各1 L,模板c D NA 1 L,KO D-P l u s-N e o 1 L,d d H2O 3 3 L。P C R反应条件为:9 4 预变性5 m i n,9 8 变性1 0 s,5 4 退火3 0 s,6 8 延伸1 m i n,进行4 0个循环,最后在6 8 延伸1 0 m i n。将P C R产物在1 0 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳检测,并使用A i d Q u i c k 琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行胶回收和纯化。将纯化后的回收产物与p T O P O-B平末端克隆载体(北京艾德莱生物科技有限公司)进行连接,转化大肠杆菌D H 5 感受态细胞(北京艾德莱生物科技有限公司),在筛选培养基上挑选菌落进行P C R检测筛选阳性克隆后,送至睿博兴科公司测序,最终获得A B I 1基因的编码区序列。1.2.3 生物信息学分析 根据课题组转录组数据,利用在线网站(h t t p s:/b i o i n f o.u t.e e/p r i m e r 3-0.4.0/)设计克隆引物,在得到正确编码区序列后,设计特异性的荧光定量引物。利用h t t p s:/b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/B l a s t.c g i在线网站检索得到该基因的同源基因。对克隆得到的A B I 1基因编码序列,利用h t-t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/t r a n s l a t e/在线网站翻译获图1 索邦 百合茎尖取材位置(A)和示意图(B)F i g.1 L o c a t i o n(A)a n d s c h e m a t i c d i a g r a m(B)o f t h e s t e m t i p o f L i l i u m O r i e n t a l H y b r i d s S o r b o n n e表1 实验所用引物序列表T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s i n t h e e x p e r i m e n t引物名称P r i m e r n a m e引物序列P r i m e r s e q u e n c e(5 3)F 1G T G T A G C AA T G T GA G C T C T T A T GA TR 1C A T C T G TAA T C AAA C T G C A T C T AAF 2A C C G T G T T T T T G G T G T G C T TR 2C C G T T C T T T T T G T G C C A GA CF 3C C C A T T GA G C A C G G C A T T G T CR 3G GA T T GA GA G GA G C T T C G G T GA GAF 4C C AAA T C GA C T C TA GAA T GA T C A C T GA T G T T G G T A C A C C GR 4TA C C G GA T C C A C T AG T AA C T G C A T C T AA G T T A C T C G G291西 北 植 物 学 报 4 3卷得其氨基酸序列;利用D N AMA N软件进行不同物种A B I 1氨基酸序列的比对,并在此基础上用M E G A 7.0软件构建A B I 1基因的分子系统进化树;利用h t-t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t s c a l e/在线网站对A B I 1基因 氨 基 酸 序 列 进 行 亲/疏 水 性 分 析;通 过TM-HMM-2.0(h t t p s:/s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v-i c e.p h p TMHMM-2.0)和S i g n a l P 4.1(h t t p s:/s e r v-i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p S i g n a l P-4.1)在线网站分别对其蛋白的跨膜结构和信号肽序列进行预测;利用h t t p s:/n p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/s e c p r e d_s o p m a.p l在 线 网 站 和S W I S S-MO-D E L软 件(h t-t p s:/s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g)预测蛋白质的二级结构和三维蛋白质模型;利用h t t p:/s m a r t.e m b l-h e i-d e l b e r g.d e/进行保守结构域的预测,并使用G S-D S 2.0(h t t p:/g s d s.c b i.p k u.e d u.c n/i n d e x.p h p)绘制蛋白保守结构域预测图。1.2.4 实时荧光定量P C R(q R T-P C R)以低温处理过程及定植后的 索邦 种球茎尖反转得到的c D-NA为模板,设计特异引物F 2、R 2(表1),内参基因为L o A c t i n,其特异性引物为F 3、R 3(表1)。根据S Y B R P r e m i x ET a q TM 说明书,配制P C R反应液:正向引物和反向引物等体积混合后稀释1 0倍后添加8 L;c D NA模板稀释1 0倍后添加2 L;酶1 0 L。使用q P C R s o f t V 4-0_q TOWE R 3_G程序进行P C R扩增反应,每份样品进行3次重复。在正式实验开始前,先进行退火实验筛选出各引物合适的退火温度,得到A c t i n内参基因合适温度为6 0.5,A B I 1基因退火温度为5 6.5。P C R反应程序为:9 5 预变性3 m i n;9 5 变性1 0 s,6 0.5(A c-t i n)/5 6.5(A B I 1)退火5 s,7 2 延伸1 5 s,4 0个循环;以每5 s升温0.5 的速度升温至9 5,得到 扩 增 产 物 的 熔 解 曲 线。使 用q P C R s o f t V 4-0_q TOWE R 3_G软件进行数据处理和表达量分析。1.2.5 亚 细 胞 定 位 瞬 时 表 达 载 体 构 建 提 取p TO P O-B-A B I 1重组质粒,并将其作为亚克隆的模板。根据p S U P E R 1 3 0 0-G F P载体的酶切位点设计A B I 1基因的亚克隆引物F 4、R 4(表1),P C R扩增程序同1.2.2。扩增产物回收后,根据I n f u s i o n HD(T a K a R a)说 明 书 将 目 的 基 因 与 酶 切 后 的p S U-P E R 1 3 0 0-G F P载 体 进 行 连 接,再 转 化 大 肠 杆 菌DH 5 感受态细胞。筛选阳性克隆后送至睿博兴科公司 测 序,测 序 正 确 后 提 取 p S U P E R 1 3 0 0-A B I 1-G F P重 组 质 粒。将p S U P E R 1 3 0 0-A B I 1-G F P和p S U P E R 1 3 0 0-G F P空 载 质 粒 分 别 转 化 农 杆 菌GV 3 1 0 1(北京博迈德生物技术有限公司),筛选阳性菌落并扩大培养。将菌液重悬后从本氏烟草(N i c-o t i a n a b e n t h a m i a n a)叶背注射进行瞬时侵染2 0,在培养箱中黑暗培养4 8 h后,在激光共聚焦显微镜下观测蛋白表达的定位结果。2 结果与分析2.1 索邦L o A B I 1基因的克隆以 索邦 上部叶片的c D NA为模板,P C R扩增获得清晰的目的片段条带(图2),条带位于M a r k e r的1 0 0 02 0 0 0 b p指示带之间。经纯化回收、连接转化和测序后,得到 索邦L o A B I 1基因的编码区序列,长度为1 3 4 1 b p,共编码4 4 6个氨基酸(图3)。以此 序 列 进 行B l a s t n检 索,发 现 与 玉 米(Z e a m a y s)、水稻(O r y z a s a t i v a)等单子叶植物的A B I 1基因具有较高的相似性(7 5%),因而确定该基因为东方百合 索邦A B I 1基因,并命名为L o A B I 1。2.2 L o A B I 1蛋白的生物信息学分析在 线 软 件 预 测L o A B I 1蛋 白 分 子 式 为C3 9 7 1H6 6 0 3N1 3 4 1O1 6 9 0S2 5 2,分子相对质量为4 8 0 1 1.0 0 D a,等电点为4.6 1,正电荷残基数3 7,负电荷残基数6 8,不稳定系数为6 7.8 1(0),表明该蛋白质稳定,脂肪系数8 8.4 5。总平均疏水性-0.1 1 6,该蛋白为亲水性蛋白。进一步通过TMHMM-2.0和S i g n a l P 4.1软件分别对L o A B I 1蛋白的跨膜结构和信号肽序列进行预测,结果显示,L o A B I 1蛋白无跨膜结构,无信号肽,因此推测L o A B I 1不定位于膜上,且为非分泌蛋白。在线预测L o A B I 1蛋白质的二级结构,结果显示(图4),在L o A B I 1蛋白质结构中,包含大量的螺旋、折叠和无规则卷曲,经统计发现,-螺旋(a l p h a h e l i x)占3 6.3 2%,-折叠(e x t e n d e d s t r a n d)占1 5.0 2%,-转角(b e t a t u r n)占5.1 6%,无规则卷曲(r a n d o m c o i l)图2 L o A B I 1 P C R 扩增F i g.2 P C R a m p l i f i c a t i o n o f L o A B I 13912期 赵一燃,等:东方百合L o A B I 1基因的克隆及表达分析A T G和T GA分别为起始密码子和终止密码子图3 L o A B I 1基因的全长核苷酸及氨基酸序列A T G a n d T GA r e p r e s e n t t h e i n i t i a t i o n c o d o n a n d t e r m i n a t i o n c o d o n,r e s p e c t i v e l yF i g.3 N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d d e d u c e d s e q u e n c e o f a m i n o a c i d r e s i d u e s o f L o A B I 1蓝色表示螺旋;紫色表示无规则卷曲;绿色表示转角;红色表示延伸链图4 L o A B I 1蛋白质的二级结构预测B l u e i n d i c a t e s a l p h a h e l i x;P u r p l e i n d i c a t e s r a n d o m c u r l s;G r e e n i n d i c a t e s b e t a t u r n;R e d i n d i c a t e s e x t e n d e d s t r a n dF i g.4 P r e d i c t i o n o f s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f L o A B I 1 p r o t e i n图5 L o A B I 1蛋白三维结构预测F i g.5 T h r e e-d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f d e d u c e d L o A B I 1 p r o t e i n图6 L o A B I 1蛋白保守结构域预测F i g.6 P r e d i c a t e d m a p o f L o A B I 1 p r o t e i n c o n s e r v e d d o m a i n最多,占4 3.5 0%。利用SW I S S-MO-D E L软件在线构建其三维蛋白质模型(图5)。M o t i f S c a n 分析表明,L o A B I 1蛋白含有3个491西 北 植 物 学 报 4 3卷N-糖基化位点(第 3 8 4-3 8 7、4 2 0-4 2 3、4 3 6-4 3 9 位氨基酸),1个依赖于 c AMP 和 c GMP 的蛋白激酶磷酸化位点(第 4 1 4-4 1 7位氨基酸),7个酪蛋白激酶磷酸化位点(第 4 5-4 8、5 1-5 4、1 0 6-1 0 9、3 2 5-3 2 8、3 4 7-3 5 0、3 6 5-3 6 8、4 4 1-4 4 4 位氨基酸),1 1个 N-豆蔻酰化位点(第 1 7-2 2、6 0-6 5、7 8-8 3、9 9-1 0 4、1 4 6-1 5 1、1 6 0-1 6 5、1 6 7-1 7 2、1 9 2-1 9 7、2 2 8-2 3 3、3 8 5-3 9 0、4 1 6-4 2 1 位氨基酸),1个蛋白激酶 C 磷酸化位点(第 2 0 0-2 0 2 位氨基酸),这说明该蛋白可能存在多种翻译后水平的调控作用,以此来调控自身的表达情况2 1。2.3 L o A B I 1同源比对和系统进化分析将 L o A B I 1的氨基酸序列进行比对,结合其他植物已报道的 A B I 1氨基酸序列分析结果,结果表明,L o A B I 1属于P P 2 C 蛋白磷酸酶家族,且其氨基酸序列中第1 1 5-4 2 8位为P P 2 C蛋白磷酸酶催化活性的保守结构域(图6)。植物P P 2 C基因家族的成员中大多都具有典型的P P 2 C催化结构域,且大多数都位于氨基酸序列的C端,P P 2 C s可能通过该结构域与底物或其他信号成分发生相互作用,从而获得其特定的功能1 4。在拟南芥P P 2 C基因家族中,已经证实这些结构域主要与细胞内信号转导相关,如跨膜跨区和激酶相互作用基序等,可以从各种蛋白质中去除磷酸基,广泛参与A B A信号调控、植物生长发育及逆境胁迫应答等信号途径1 2,2 2-2 5。在水稻2 6、二穗短柄草2 7中也有类似的研究。为了探讨L o A B I 1与P P 2 C基因家族编码蛋白氨基酸序列之间的关系,将甘蓝(B r a s s i c a o l e r a-c e a)、南瓜(C u c u r b i t a m o s c h a t a)和模式植物拟南芥等共1 4种植物的P P 2 C基因与 索邦 的L o A B I 1基因编码蛋白的氨 基 酸 序 列 进 行 比 对。结 果 显示,L o A B I 1和其他P P 2 C蛋白均具有P P 2 C型磷酸酶蛋白共有的特点,在蛋白质的催化结构域存在1 1个较保守的基序2 8(图8),这与蛋白质保守结构域的预测基本符合。已知拟南芥中有8 0个基因能够编码P P 2 C蛋白磷酸酶,被分为1 3个亚群1 3-1 4,而大多数已鉴定的与脱落酸信号转导相关的基因都在A亚群中1 4。为了进一步研究L o A B I 1和P P 2 C基因家族间氨基酸序列的关系,引入拟南芥和水稻P P 2 C基因家族不同亚群的基因1 3-1 4,将L o A B I 1氨基酸序列与多个物种的P P 2 C蛋白的氨基酸序列建立系统进化树(图7)。进化树的结果显示,L o A B I 1与拟南芥和水稻的P P 2 C家族成员聚成3个分支,分别对应了P P 2 C c l a d e A/B/C亚家族。L o A B I 1与单子叶植物水稻P P 2 C家族成员O s P P 2 C 0 6的同源进化关系最近;在拟南芥P P 2 C基因家族中,L o A B I 1与A t A B I 1 的同源进化关系最近,L o A B I 1与 拟 南 芥 中 的A t A B I 1、A t A B I 2、A t H A B 1、A t H A B 2、A t H A I 1、A t H A I 2、A t H A I 3、A t A H G 1和A t-P P 2 C A同处于C l a d e A亚家族分支,这些成员均能够参与A B A信号转导过程1 4,因此推测L o A B I 1蛋白也可能具有相似的功能,在 索邦 百合A B A信号转导过程中发挥作用。2.4 L o A B I 1蛋白的亚细胞定位利用激光共聚焦显微镜对亚细胞定位结果进行观察,结果显示,在本氏烟草叶片中空载质粒的荧光信号出现在细胞质与细胞核中,L o A B I 1蛋白的绿色L o.东方百合 索邦;T c.可可;H u.哥伦比亚锦葵;D z.榴莲;G h.陆地棉;A t.拟南芥;O s.水稻图7 不同植物A B I 1蛋白的系统进化树分析L o