基于上转换信标探针构建信号放大近红外激发荧光生物传感器用于microRNA检测.pdf

CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY137-1462024年1月应用化学第1期第41卷D0I:10.19894/j.issn.1000-0518.230083基于上转换信标探针构建信号放大近红外激发荧光生物传感器用于microRNA检测周学敏吕臻?张国芳1崔竹梅*上毕赛2*（青岛大学附属医院，青岛2 6 6 0 6 1）2（青岛大学化学化工学院，青岛2 6 6 0 7 1)摘要基于NaYF：Yb 3*,T m Na YF,上转换纳米颗粒（Upconversionnanoparticles，U CNPs）和DNA催化发夹组装（Catalytichairpinreaction，CH A）技术构建近红外激发（Near-infrared，NIR）荧光生物传感器，用于microRNA的高灵敏分析。靶标microRNA-21(miRNA-21）可与磁珠（Magneticbeads，M Bs）表面修饰的发夹H1发生toehold区域介导的链取代反应，发夹HI暴露新的toehold区域与UCNPs表面修饰的发夹H2发生反应，形成H1/H2复合物，同时miRNA-21被取代并与新的发夹H1反应，此过程将UCNPs固定于MBs表面，而且实现了信号的循环放大。接下来通过磁分离技术，将固定于MBs表面的UCNPs分离出来，在8 0 8 nmNIR的激发下产生上转换发光（Upconversionluminescence，U CL），对miRNA-21的检测范围为0.1 10 0 nmol/L，检出限为11.3pmol/L。此外，该荧光生物传感器成功应用于血清样本中miRNA-21的分析，表明其具有良好的实用性。关键词上转换纳米颗粒；催化发夹组装；荧光生物传感器；microRNA；近红外光中图分类号：0 6 55文献标识码：A文章编号：10 0 0-0 518(2 0 2 4)0 1-0 137-10microRNA（m i R NA)作为一种高度保守的非编码单链RNA,在多种恶性肿瘤中高表达，并在基因调控、细胞增殖分化、调亡和癌变过程中发挥重要作用2-3。目前，已发展多种miRNA的检测方法，如Northern印迹法 4、微阵列法 5和实时定量聚合酶链式反应 6 等，但这些方法多数存在灵敏度低、耗时长、易受环境影响和设备要求高等缺点 7-9。近年来，随着生物传感技术的快速发展，已建立多种新的miRNA的检测方法，如电致化学发光生物传感器 10、光电化学生物传感器 和荧光生物传感器12 等，具有成本低、灵敏度高等优点。其中，荧光生物传感器由于其重复性好、响应速度快和设备简单等优点而受到关注。然而，传统的荧光生物传感器多采用有机染料、量子点和贵金属纳米簇等荧光材料作为信号源，存在发光稳定性差、光漂白阅值低等问题1913-14。此外，大多数荧光生物传感器以及荧光材料多采用紫外-可见光作为激发光源。然而，紫外-可见光具有较高的能量，会对生物样品造成光损伤，且穿透力较差，从而限制了其在生物传感领域中的应用15上转换纳米颗粒(Upconversion nanoparticles，U CNPs)作为一种特殊的纳米发光材料，可在低能量的近红外光（Near-infrared，NIR）激发下，发射出能量更高的紫外及可见光，具有反斯托克斯发光特性 16-1。由于UCNPs的激发光为近红外光（通常为8 0 8 nm或98 0 nm）,其不仅能够有效避免紫外及可见光激发引起的光损伤，还能够降低自发荧光背景的干扰 18。因此，UCNPs在荧光生物传感领域具有广阔的应用前景。例如,Liu等 19利用UCNPs独特的上转换发光特性,基于荧光共振能量转移构建了一种荧光生物传感器用于次氯酸盐的高灵敏检测。Rong等 2 0 1基于内滤效应和UCNPs构建荧光生物传感器应用于食品中糠醛的检测，具有较高的灵敏性与特异性。核酸等温扩增技术凭借其分析效率高、反应速度快和特异性好等优点已用于构建多种荧光生物传感器 2 1。核酸等温扩增技术主要包括酶辅助扩增法和无酶扩增法两大类，其中酶辅助扩增法依赖于酶的活性，反应条件受到严格限制，并且存在成本高和储存困难等缺点，从而限制了其应用2-2 4。相比于2023-03-31收稿；2 0 2 3-0 5-31接受北京康华中西医发展基金会项目（No.KH-2021-LLZX-014）、国家自然科学基金（No.22076087）和山东省杰出青年基金(No.ZR2020JQ08）资助*E-mail:;138第41卷应用化学酶辅助扩增法，无酶的toehold区域介导的链取代反应（Toehold-mediated stranddisplacement，T M SD）具有稳定性高、简单、反应迅速和成本低等优点。TMSD反应是通过互补的单链toehold区域介导三链迁移，将短双链DNA置换为热力学更稳定的长双链DNA。催化发夹组装技术（Catalytic hairpinreaction，CHA)是一种典型的TMSD反应，通过可编程的杂交反应实现靶标的等温循环利用，进而实现信号放大 2 4。近年来,将CHA信号扩增技术与新型纳米材料相结合，已开发出多种生物分析与疾病诊断新策略，用于体内外生物标志物的检测 2 5-2 6 本研究通过UCNPs与CHA信号放大策略结合，构建了一种NIR激发的荧光生物传感器，用于miRNA-21的高灵敏检测。信标探针H2-UCNPs的逐步构建过程如图1A所示，首先通过高温共沉淀法合成核心NaYF：Yb 3*，T mU CNPs，并采用壳层外延生长法合成核壳NaYF4:Yb3*，T m Na YF4U CNPs。接下来除去核壳UCNPs表面的油酸适配体后通过DNA磷酸基团与UCNPs中镧系元素间的配位与静电作用合成H2-UCNPs信标探针。CHA的工作原理如图1B所示，当miRNA-21存在时，可通过TMSD与MBs表面的H1杂交形成miRNA-21/H1复合物。被打开的发夹H1暴露出新的toehold区域可与连接在UCNPs表面的发夹H2杂交，形成H1/H2复合物并将miRNA-21置换下来打开新的发夹H1，从而实现信号放大。借助miRNA-21的循环利用，大量UCNPs被连接于MBs表面，在8 0 8 nmNIR激发下产生UCLmiRNA-21的浓度越高，荧光信号越强，从而实现miRNA-21的荧光检测。总之，本工作提出一种近红外光激发的信号放大荧光生物传感器，具有灵敏度高、操作简单和反应速度快等优点，为miRNA的检测提供了新方法和新思路。AYCI,HC1H2Heating atStirring for 24 hStirring for 12 h300Cfor90minCoreCore-shellNaYF.:Yb,Tm3+NaYF,:Yb3+,Tm*NaYF4OA-freeUCNPsH2-UCNPsBmiRNA-21H2-UCNPsH1-MBsCatalytic Hairpin Assembly(CHA)808 nmirradiationMagneticseparationFluorescenceDissolutionnmdetection图1基于UCNPs和CHA信号放大策略的荧光生物感器检测miRNA-21示意图Fig.1Schematic of fluorescence biosensor based on UCNPs and CHA amplification strategy for the detection of miRNA-211实验部分1.1仪器和试剂ME104E/02型电子天平（上海梅特勤-托利多仪器有限公司）；TGW16型台式高速微量离心机（济南普纳仪器设备有限公司）;Mimi1620型基因扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；Tanon2500R型凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；NanoBrook90PlusZeta型高灵敏Zeta电位及粒度分析仪（美国布鲁克139第1期周学敏等：基子号放大近外激发灾光生物传感器用microRNA检测海文仪器公司）；F-7000型荧光分光光度计（日本日立高新技术公司）；SZCL型电热套（上海力辰仪器科技有限公司）;HT7700型透射电子显微镜（TEM，日本日立高新技术公司）;Regulus8100型场发射扫描电子显微镜（SEM，日本日立高新技术公司）;ESCALABXi+型X射线光电子能谱仪（XPS，捷克赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；JEM2100F型高分辨透射电子显微镜（HETEM，日本电子株式会社）；SmartLab3KW型X射线衍射仪（XRD，日本理学公司）。氢氧化钠（NaOH,分析纯）、油酸（OA，分析纯）、甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、环已烷（分析纯）、盐酸（H Cl，分析纯）购自国药集团化学试剂；氯化（YCl,，99.99%）、氯化（YbCl，99.99%）、氯化钰（TmCl,，99.99%）、十八烯（色谱纯）和氟化氢铵（NH,HFz，分析纯)购自上海麦克林生化科技有限公司。羧基修饰的磁珠购自天津倍思乐色谱技术开发中心。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，98%）与N-羟基丁二酰亚胺(NHS，分析纯）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。Tris+EDTA(TE)缓冲液（1,p H=8）与2-（N-吗啉代）乙烷磺酸（MES)购自上海生工生物工程股份有限公司。MES缓冲液的配置方法为称取2.132 5gMES溶于10 0 mL纯水中，并调节pH值至5.5。整个实验使用的去离子水来自Millipore水净化系统（18.2 MQ/cm）。实验中所用DNA链均由上海生工生物工程股份有限公司提供。DNA序列如表1所示。所有的DNA链在使用前进行退火处理（将DNA链加热到95保持5min，然后冷却至25保持2 h，冷却速度为0.1/s）。表1工作中用到的核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this studyNameSequence(5-3)miRNA-21UAGCUUAUC AGA CUGAUGUUGAmiRNA-155UUAAUGCUA AUCGUGAUAGGGGUH1AGA CTG ATG TTG ACT TAG CTT ATC GAT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA-NH,H2ACT TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG ATC GAT AAG CTA AGT CAA CTA CASingle-base mismatched miRNA-21UAT CUU AUC AGA CUG AUG UUG AThree-base mismatched miRNA-21UATCUAAUUAGACUGAUGUUGANote:The mismatched bases in miRNA-21 are highlighted by red underline.1.2实验方法1.2.1NaYF:Yb3+,Tm3NaYF,UCNPs的合成采用高温共沉淀的方法合成核壳NaYF:Yb*,TmNaYF,UCNPs27-28。首先,将0.7 95 mmol YCl,、0.2mmolYbCl、0.0 0 5mmo l T mCl，、15mL十八烯和6 mL0A加人三口烧瓶中，升温至16 0，保持30 min，得到淡黄色溶液。待溶液冷却至室温后，将4mmol NaOH、2.5mmo l NH,H F,和10 mL甲醇混匀后加人三口烧瓶中。将反应体系加热至7 0，保持40 min以除去甲醇，随即升温至2 90,保持90 min，得到核心NaYF:Yb3+,Tm3+UCNPs。将所得悬浊液离心，收集白色沉淀，用环已烷洗涤3次后，再次分散于环已烷中，以备下一步使用。接下来将1mmolYCl，、30 mL十八烯和6 mL0A加入三口烧瓶中，加热至16 0，反应30 min得到淡黄色溶液。待溶液冷却至室温后，将上一步反应所得的NaYF:Yb3*,Tm3+环已烷分散液缓慢加入三口烧瓶中，随即将4mmolNaOH、2.5mmo l NH,H F,和10 mL甲醇混匀后加人，并加热至12 0 反应6 0 min以去除环已烷和甲醇。接下来将溶液迅速加热至30 0 保持90 min，得到棕褐色溶液。最后，将所得溶液离心，得到的白色沉淀用环已烷和乙醇分别洗涤3次，得到核壳NaYF4：Yb 3+，T m 3 Na YF4U CNPs，分散在纯水中备用。上述所有步骤均在N，气保护下进行。1.2.2H2-UCNPs信标探针的制备首先，将制备好的UCNPs分散于10 mLHCl溶液（1mmol/L）中，搅拌2 4h除去OA。将除去OA的JCNPs以12 0 0 0 r/min的转速离心30 min，并用乙醇和纯水分别洗涤分散于TE缓冲液中。最后，将发夹140第41卷应用化学H2加人去除油酸的UCNPs悬浊液中,搅拌12 h制1.2.3H1-MBs捕获探针的构建备得到H2-UCNPs复合物，将其作为信标探针备用将6 0 L羧基修饰的MBs（1mg/mL)用2 0 0 LMES缓冲液（pH=5.5)通过磁性分离的方法洗涤3次，并重新分散于150 LMES缓冲液中。接下来加人50 0 L含有EDC(0.1mol/L)和NHS(0.01mol/L)的水溶液，在37 下反应30 min以活化MBs表面的羧基。活化后的MBs用TE缓冲液洗涤2 次后分散于150LTE缓冲液中。取30 0 L氨基修饰的发夹H1(2mol/L)与活化的MBs于37 下反应12 h得到H1-MBs,将H1-MBs洗涤3次后分散于TE缓冲液中备用。1.2.4近红外荧光生物传感器的构建将2 0 L不同浓度的miRNA-21、50 LH1-MBs和50 LH2-UCNPs于离心管中混匀，在2 5下反应2 h。磁分离后，将所得沉淀用纯水洗涤2 次后重新溶解于12 0 L纯水中，使用荧光分光光度计检测UCL强度。2结果与讨论2.1材料表征首先，对羧基修饰的MBs进行SEM表征。如图2 A所示，羧基修饰MBs为球形，形貌均一，平均直径约为2 30 nm。接下来对合成的UCNPs进行TEM表征。如图2 B所示，核心NaYF：Yb+,T m 3U CNPs 为球形，分散性好，平均粒径约为2 4nm。为了增强UCNPs的UCL性能，采用介导壳层外延生长法，以NaYF:Yb*，T m为种子，在其表面生长一层惰性NaYF,外壳，合成NaYF：Yb 3，T m Na YF,U CNPs。TEM结果显示，所合成的核壳UCNPs为椭圆形，长径约为38 nm，短径约为2 8 nm，大小均匀，分散性好（图2 C）。进一步，利用XPS对NaYF：Yb+,T m Na YF,U CNPs 进行元素表征（图2 D）。结果表明，Na、F、Y、Yb 和Tm这5种元素均存在于UCNPs的XPS全谱中。Y3d和F1s的高分辨XPS谱图如图2 E和2 F所示。158.35和16 0.35eV处的峰分别归属于Y3ds,和Y3d，2 7；6 8 5.2 e V处的峰归属于F1s2。通过TEM和XPS分析，证明了核壳NaYF:Yb+,TmNaYF,UCNPs的成功制备。在UCNPs的合成过程中,以疏水性OA作为稳定剂,可有效阻止UCNPs的聚集，但同时也阻止了UCNPs与DNA的连接，因此本研究使用HCI除去UCNPs表面的OA。如图2 G所示，去除OA后的UCNPs的形貌和粒径均未发生明显变化，但分散性变差。进一步,利用DNA磷酸基团与UCNPs中镧系元素(Ln*)间的配位与静电作用 30)，制备得到H2-UCNPs信标探针。如图2 H所示，UCNPs连接发夹DNA发夹H2后，其分散性较去除OA后增强。同时，对所制备的H2-UCNPs进行HRTEM表征（图2 I），晶格条纹宽度为0.51nm，与NaYF,的（10 0)晶面参数一致。采用能量色散X射线光谱（EDS)对H2-UCNPs信标探针进行进一步表征。如图2 J所示，Na、F、Y、Yb、T m和P等元素均匀分布于UCNPs中，其中P元素来源于DNA，表明H2-UCNPs信标探针的成功制备。接下来采用Zeta电位分析仪对连接发夹H2前后UCNPs的电位进行测定。由于DNA带负电，其连接到去除OA的UCNPs后，电位从2 8.37 mV下降至-17.6 mV（图2 K），表明H2成功连接于UCNPs表面。为验证晶型变化，采用XRD同时对NaYF：Yb 3+，T m 3+U CNPs、NaYF：Yb 3+,T m Na YF,U CNPs 和H2-UCNPs进行表征。三者在17.12、30.7 0、31.7 0、43.36 和53.58（）处均有相同的衍射峰，分别归属于NaYF的（10 0）（110）、（10 1）（2 0 1）和（2 11）晶面（图2 L），表明H2的修饰未对UCNPs的晶格产生影响。UCNPs具有优越的发光性能，其中Yb3作为敏化剂吸收8 0 8 nm近红外光，Tm作为激发剂产生紫外UCL(UCLuv）和可见UCL(UCLvi）。对核心NaYF：Yb+,T m和核壳NaYF:Yb*,TmNaYFUCNPs的UCL特性进行了对比。如图2 M所示，NaYF:Yb*，T m*U CNPs 在2 7 0.0 nm和40 6.4nm处产生UCL峰（图2 M曲线a)。包覆NaYF,外壳后，由于NaYF：Yb+,T mU CNPs 的表面缺陷减少，NaYF:Yb+,TmNaYF,UCNPs的UCL明显增强（图2 M曲线b）。在UCNPs表面连接DNA后，由于颗粒表面的水结合状态发生改变，H2-UCNPs的UCL强度略有下降 30（图2 M曲线c）。位于40 6.4nm处的UCL明显强于2 7 0.0 nm处，因此，使用40 6.4nm处的UCL作为荧光生物传感平台的检测信号。141周学敏等：基上转换信标探针构建信号放大近红外激发荧光生物传感器用于microRNA检测第1期Bum200mmDYb4dF1sEY3ds2F1sNalsTm4dY3d32i00200Y3d03006009001200156158160162680682684686688690Bingdingenergy/eVBindingenergy/evBindingenergy/eV100nm100nmNaFYbTmK30LM20104004054104150nm10JCPDSNo.16-03342020406080250400450OA-freeH2-UCNPs20/()/nm图2（A)M Bs 的SEM图。（B)NaYF:Yb3*,Tm+UCNPs和(C)NaYF:Yb3*,Tm+NaYF UCNPs的TEM图。(D）Na YF:Yb 3*,T m Na YF,U CNPs 的XPS表征。（E）Y3d 和(F)F1s轨道的高分辩XPS图谱。（G)去除OA的UCNPs和(H）H 2-U CNPs 的TEM图。H2-UCNPs的（I)HRTEM和(J)EDS表征。（K)去除OA的UCNPs和H2-UCNP的Zeta电位表征。(L)NaYF,:Yb3*,Tm3+UCNPs(a)、Na YF:Yb 3*,T m*Na YF,U CNPs(b)和H2-UCNPs(c)的XRD表征。（M）8 0 8 n m NIR 激发下NaYF:Yb*,Tm3+UCNPsa）、Na YF,:Yb*,T m Na YF,U CNPs(b)和H2-UCNPs(c)的UCL光谱Fig.2(A)SEM image of MBs.TEM images of(B)NaYF,:Yb*,Tm*UCNPs and(C)NaYF,:Yb*t,Tm*NaYFUCNPs.(D)XPS survey spectrum of NaYF,:Yb3*,Tm*NaYF,UCNPs.High-resolution XPS spectra of(E)Y3dand(F)F1s.TEM images of(G)OA-free UCNPs and(H)H2-UCNPs.(I)HRTEM and(J)EDS elementalmapping of H2-UCNPs.(K)Zeta potential of OA-free UCNPs and H2-UCNPs.(L)XRD spectrum of NaYF,:Yb*,Tm*UCNPs(a),NaYF:Yb*,Tm*NaYF,UCNPs(b)and H2-UCNPs(c).(M)UCL spectra of NaYF,:Yb*,Tma+UCNPs(a),NaYF4:Yb3*,Tm3*NaYF,UCNPs(b)and H2-UCNPs(c)under 808 nm NIR142第41卷应用化学2.2可行性分析为了验证本研究的可行性,采用非变性聚丙烯凝胶电泳(PAGE)对miRNA-21触发的CHA过程进行分析。如图3所示，泳道1与泳道2 中的条带分别代表miRNA-21和Hl。当miRNA-21与H1孵育后，通过TMSD反应打开发夹H1,形成miRNA-21/H1复合物（泳道3）。当miRNA-21与H1与H2共同孵育后，泳道4出现H1/H2复合物的条带，迁移速率较miRNA-21/H1复合物进一步减慢，并在泳道4的下方出现miRNA-21的条带，表明miRNA-21的释放以及其触发CHA过程的成功进行。在无miRNA-21时，H1与H2不发生反应，保持稳定状态（泳道5）。2.3实验条件优化MBs上固载H1的数量对所构建的荧光生物传感器的灵敏度具有重要影响。H1浓度过低将导致固定的UCNPs减少；而H1饱和后，继续增大浓度并不会增强UCL。因此，首先对H1的浓度进行优化，此时选定miRNA-21的浓度为10 nmol/L。如图4A所示，当H1的浓度较低时，随着其浓度的增大荧光信号逐渐增强；当H1的浓度达到23图3非变性聚丙烯凝胶电泳表征CHA反应过程。泳道1：miRNA-21；泳道2：H1；泳道3：miRNA-21+H1；泳道4:miRNA-21+H1+H2；泳道5:H1+H2Fig.3Native PAGE for the characterization ofCHA process.Lane 1:miRNA-21;lane 2:Hl;lane 3:miRNA-21+H1;lane 4:miRNA-21+H1+H2;lane 5:H1+H22mol/L后，荧光强度达到平台，继续加大浓度对荧光强度无影响。因此，选择2 mol/L作为H1的最佳浓度。此外，CHA的反应时间对传感器的灵敏度也会产生较大影响。如图4B所示，当miRNA-21为10nmol/L时，随着CHA反应时间的延长，荧光强度增强，并在2.0 h达到最大值，之后荧光信号基本保持不变。因此，选择2.0 h作为CHA反应的最佳反应时间。2.52.5AB2.02.01.51.51.01.00.50.50.00.00.51.01.52.02.50.51.01.52.02.5c(HI)/(mol L-)Time/h图4（A）M Bs 上H1浓度优化和（B）CH A 反应时间优化Fig.4(A)Optimization of H1 concentrations on MBs and(B)reaction time of CHA reaction2.4近红外荧光生物传感器检测miRNA在最佳实验条件下，采用所构建的近红外荧光生物传感器对不同浓度的miRNA-21进行检测。如图5A所示，随着miRNA-21浓度的增大，UCL信号逐渐升高。在0.1 10 0 nmol/L范围内，UCL强度与miRNA-21浓度的对数值（lgCmiRNA-21）呈线性关系，线性方程为F=918.53xlgCmiRNA-21+1050.68，R=0.998（图5B），检出限为11.3pmol/L(3S/N,S为5次空白试验测得的标准偏差，N为线性方程的斜率）。与已报道的miRNA检测方法相比，本研究所构建的近红外荧光生物传感具有相对较宽的检测范围和较低的检出限表2)。143第1期周学敏等：基于上转换信标探针构建信号放大近红外激发荧光生物传感器用于microRNA检测33A0B0.1nmol/L0.2nmol/L0.5nmol/L1nmol/LF=918.53xlgCmRNA-21+1050.6822nmol/L2R2-0.9985nmol/L10nmol/L20nmol/L50nmol/L100 nmol/L003904004104200.1110100入/nmIg CmiRNA-21图5（A)采用所构建的近红外荧光生物传感检测不同浓度miRNA-21的UCL光谱。（B）U CL 强度与miRNA-21浓度对数的线性关系图Fig.5(A)UCL spectra toward miRNA-21 with dfferent concentrations using the proposed NIR fluorescencebiosensor.(B)Corresponding linear relationship between UCL intensity and logarithm of miRNA-21 concentration表2不同传感体系的检测性能比较Table 2Comparison of performance of different sensing systemMethodsLinear range/(nmolL-)Detection limit/(pmolL-l)Ref.Fluorescence0.11693.816Fluorescence0.515083.031Fluorescence0.130067.032Fluorescence2.580250.033Electrochemistry0.110483.034Fluorescence0.110011.3This work为验证该荧光生物传感器的特异性，分别对单碱基错配miRNA-21(SM）、三碱基错配miRNA-21(TM)和miRNA-155等3种干扰物进行检测（图6 A）。在相同实验条件下，与目标物miRNA-21相比，干扰物未引起明显的UCL信号变化，表明所构建的近红外荧光生物传感器对miRNA-21的检测具有良好的特异性。为验证该荧光生物传感器的储存稳定性，对10 nmol/L的miRNA-21进行检测，并记录分别于4保存1、3、5和7 d后的荧光信号（图6 B）。在储存1、3、5和7 d后，检测到的平均荧光强度分别为初始值的9 9.34%、9 9.11%、9 6.6 5%和9 7.56%，表明该近红外荧光生物传感体系具有良好的储存稳定性。BlankAB2.525002000工2.0Mixture1500SM10001.55001.00.5miRNA-21TM0.01357miRNA-155Storagetime/day图6所构建近红外荧光生物传感器的(A)特异性和(B)储存稳定性Fig.6(A)Specificity and(B)storage stability of the constructed NIR fluorescence biosensor2.5实际样本分析为了验证该近红外荧光生物传感器的实用性，对血清中的miRNA-21进行检测。在稀释10 0 倍的健康人血清中分别加入不同浓度的miRNA-21（0、0.7、7 和7 0 nmol/L），并对其进行加样回收率实验，结果如表3所示。血清中miRNA-21的回收率为10 1.14%10 3.41%，相对标准偏差均小于1.0 2%，表明所构建的荧光生物传感器可实现血清等复杂生理条件中miRNA-21的准确检测，具有良好的实用性。144第41卷应用化学表3买采用所构建的近红外荧光传感器检测血清中miRNA-21Table 3Detection of miRNA-21 in human serum by NIR-driven fluorescence biosensorNumAdded/(nmol.L-l)Measured value/(nmol.L-)RSD/%(n=3)Recovery/%100.060.5520.70.720.84103.41377.130.41101.8647070.791.02101.143结论本研究基于UCNPs的上转换发光特性，结合CHA信号放大策略构建了一种NIR荧光生物传感器用于miRNA-21的灵敏检测。在miRNA-21的触发下，发夹HI与H2发生CHA反应，将UCNPs固定于MBs表面，实现了信号的转导与放大；同时，反应在恒温无酶的条件下进行，可有效抵抗外界环境的干扰，增强传感体系的稳定性。MBs表面的UCNPs在NIR的激发下产生UCL,实现对miRNA-21检测。本工作采用NIR作为UCNPs的激发光，可有效避免自发荧光的干扰以及对生物样品的光损伤，且UCNPs在检测过程中表现出较高的荧光稳定性。将CHA信号放大策略与荧光传感方法相结合，实现信号放大的同时兼具响应速度快、检测成本低和设备简单等优点，在miRNA-21的检测中表现出良好的选择性和稳定性,并实现了血清样本中miRNA-21的准确检测，表现出较高的实用性。总之,所构建的NIR荧光生物传感体系为临床肿瘤标志物的检测提供了新的研究思路，在肿瘤早期诊断中具有广阔的应用前景参考文献1 ALI SYDA Z,LANGDEN S,MUNKHZUL C,et al.Regulatory mechanism of microRNA expression in cancerJ.Int JMol Sci,2020,21(5):1723.2牛亚倩，刘芳，陈彻：纳米生物传感器在肿瘤microRNA-21检测中的应用 J中国生物制品学杂志，2 0 2 2，35(6):759-762.NIU Y Q,LIU F,CHEN C.Application of nano-biosensors in detection of tumor microRNA-21JJ.Chin J Biol,2022,35(6):759-7623 LI F,ZHOU Y,YIN H,et al.Recent advances on signal amplification 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