某校大学生梭状芽孢杆菌携带情况调查.pdf

28 医药前沿 2024年3月 第14卷第9期 论著某校大学生梭状芽孢杆菌携带情况调查刘梦昭1，苏诗洁1，黄贞维1，苏嘉雯1，容 欣1，王岐本2，谢 群1（通信作者）（1 湘南学院公共卫生学院 湖南 郴州 423000）（2 湘南学院基础医学院 湖南 郴州 423000）【摘要】目的：通过对湘南学院大学生粪便中梭状芽孢杆菌的分离培养及鉴定，了解大学生梭状芽孢杆菌的携带情况。方法：2022 年 36 月收集湘南学院大学生粪便样本 180 份，厌氧培养法分离艰难梭菌、产气荚膜梭菌和丁酸梭菌，血平板纯化菌株，通过聚合酶链式反应（PCR）法鉴定梭状芽孢杆菌，对可疑艰难梭菌进行毒素基因 A/B 检测。采用16SrDNA 技术对分离的菌株进行鉴定。结果：艰难梭菌 A/B 毒素基因检出 13 份阳性，均为+/+，30 份可疑菌株 16 S rDNA确认：11份产气荚膜梭菌、2份丁酸梭菌、2份艰难梭菌。结论：湘南学院大学生人群中，产气荚膜梭菌携带率较高，艰难梭菌感染率较高，需加强食品安全健康教育，避免食源性疾病发生。【关键词】大学生；梭状芽孢杆菌；艰难梭菌；产气荚膜梭菌；丁酸梭菌【中图分类号】R378.8【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2024）09-0028-03Investigation on Clostridium carrying of college students in A UniversityLIU Mengzhao1,SU Shijie1,HUANG Zhenwei1,SU JiaWen 1,RONG Xin1,WANG Qiben2,XIE Qun1(Corresponding author)1 School of Public Health,Xiangnan University,Chenzhou,Hunan 423000,China2 School of basic Medical Sciences,Xiangnan University,Chenzhou,Hunan 423000,China【Abstract】Objective To understand the carriage situation of Clostridium difficile among college students through isolation,culture,and identification of Clostridium difficile in fecal samples from Xiangnan University.Methods From March to June 2022,180 fecal samples were collected from Xiangnan University students.Anaerobic culture method was used to isolate Clostridium difficile,Clostridium perfringens,and Clostridium butyricum.The strains were purified on blood agar plates,identified using polymerase chain reaction(PCR),and suspected Clostridium difficile were tested for toxin genes A/b.16 S rDNA technology was used for strain identification.Results 13 samples were positive for toxin genes A/b of Clostridium difficile,all of which were+/+.16 S rDNA confirmed 30 suspected strains:11 were Clostridium perfringens,2 were Clostridium butyricum,and 2 were Clostridium difficile.Conclusions The carriage rate of Clostridium perfringens is high among Xiangnan University students,and the infection rate of Clostridium difficile is also high.It is necessary to strengthen food safety and health education to prevent foodborne illness.【Key words】College students;Clostridium;Clostridium difficile;Clostridium perfringens;Clostridium butyricum梭状芽孢杆菌是一群厌氧或微需氧的革兰阳性粗大芽孢杆菌的总称。人体肠道中常见的致病菌有艰难梭菌、产气夹膜梭菌等，而也有同属的丁酸梭菌是有益菌，艰难梭菌是一种革兰阳性粗大杆菌，是引起院内肠道感染的主要致病菌之一，艰难梭菌感染通常发生于长期接受抗菌药物治疗后引起肠道菌群失调的患者1，它不仅能产生引起机体免疫反应的表面层蛋白和鞭毛蛋白，还可以产生免疫原性的肠毒素 A（tcdA）和细胞毒素 B（tcdB）2，艰难梭菌给人类带来的危害在近些年来日益严重，是引起医院相关性腹泻的原因之一，占医院腹泻病例的 15%25%3。产气荚膜梭菌（clostridium perfringens,Cp）是条件致病菌，容易引起免疫力低下及易感人群致病，Cp 感染机体后迅速侵入局部组织，细菌迅速繁殖产生多种毒素和侵袭酶，机体出现溶血性贫血、多脏器功能损伤、循环衰竭等症状，诊断不及时，病死率高达 70%100%4。丁酸梭菌是革兰阳性专性厌氧芽孢杆菌，在肠道代谢的过程中可以产生丁酸、细菌素以及一些维生素等物质调节肠道菌群，促进肠道微生态平衡，同时在调节机体的炎症反应和免疫功能中也发挥着重要的作用。有研究表明，丁酸梭菌抑制艰难梭菌、大肠杆菌、肠道沙门菌等致病菌的生长5-6，但也有丁酸梭菌携带毒素基因引起食物中毒的报道7-8。为了解大学生人群中梭状芽孢杆菌携带情况，本研究采集湘南学院大学生粪便，根据 16 S rDNA 测序进行梭状芽孢杆菌的鉴定。1 资料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源 于 2022 年 36 月收集 2018 2021 级湘南学院大学生粪便标本 180 份。纳入标准：健康体检合格，且粪便采集当日未出现腹痛、腹泻等疾病症状。1.1.2 主要仪器与试剂 生物安全柜（型号 BSC-1604）、高压蒸汽灭菌器（型号 yyXQ-50A）、高速冷冻离心机（型号3-18KS）、聚合酶链式反应（polymerase 基金项目：国家级大学生创新训练项目（202210545003）；2021 年度郴州市技术研发中心（郴科发202157 号）。医药前沿 2024年3月 第14卷第9期 论著 29chain reaction,PCR）仪（型号 QuanStudi）、厌氧产气袋（Thermo）、环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂（cycloserine-cefoxitin-fructose agar,CCFA）培养基、强化梭菌培养基（reinforced clostridium medium,RCM）、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础（tryptose sulfite cycloserine agar base,TSC）培养基、哥伦比亚血平皿（贝瑞特生物技术公司），产毒艰难梭菌核酸检测试剂盒PCR-荧光探针法（圣湘生物公司）。1.2 方法（1）艰难梭菌的分离培养：取粪便样本与无水乙醇混合，震荡摇匀后，静置 60 min，3 000 rpm/min 离心 10 min，取沉淀全部倒入已烘干的 CCFA 艰难梭菌选择培养基上，均匀涂布，厌氧环境 37 培养 48 h9。（2）Cp 的分离培养：取粪便样本接种到 RCM 培养基中，37 温箱培养 24 h，三区划线接种在 TSC 培养基上，37 温箱厌氧培养 24 h10。（3）丁酸梭菌的分离培养：取粪便样本与磷酸盐缓冲液混合摇匀后，80 水浴 10 min，取稀释液于 RCM 中，并在 37 条件下厌氧培养 48 h，然后将培养后样品进行梯度稀释，涂布于琼脂梭菌选择性培养基中，并在 37 条件下厌氧培养 48 h11-12。（4）分纯培养物分离鉴定：先用无菌接种环挑取以上种可疑菌株分别接种至哥伦比亚血琼脂平板内，37 厌氧培养 48 h。然后挑取可疑单个梭状芽孢杆菌菌落，再次接种血平板分纯，37 厌氧培养 48 h，观察菌落形态特点及溶血情况；同时挑取可疑菌落革兰染色，显微镜观察染色颜色、形态和是否形成芽胞及芽孢位置。（5）菌株 16 S rRNA 基因序列测定和分析：PCR 模板 DNA 的制备。选取单一纯培养菌落悬浮于 50 L 无菌蒸馏水中，置于 100 水浴中加热 5 10 min，然后进行离心处理，并取上清液作为 PCR 模板 DNA。16 S rRNA 基因序列的 PCR 扩增与测序对挑取的可疑菌落用 PCR 方法鉴定，引物序列。上游：5-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游：5-ACGGCTACCTTCTTACGACTT-3，产物大小为1 500 bp。PCR 反应体系和反应条件见文献13。数据处理用 DNA Star 软件对正、反向引物序列进行拼接。序列提交至美国国立生物技术信息中心的核酸序列数据库进行比对，确定细菌的种属。（6）艰难梭菌毒力基因检测：用产毒艰难梭菌核酸检测试剂盒 PCR-荧光探针法（圣湘生物公司）检测艰难梭菌的 tcdA 和 tcdB。1.3 统计学方法采用 Excel 进行统计学处理，计数资料采用频数和百分率（%）描述。2 结果2.1 PCR 检测结果180 份标本中，3 种细菌培养可疑阳性分别为：艰难梭菌 18 份、Cp20 份、丁酸梭菌 7 份，将 45 株可疑菌株提取核酸，分别进行 PCR 检测，结果显示，30 份样品，梭状芽孢杆菌阳性。2.2 菌落特征18 株可疑艰难梭菌形态学特征在 CCFA 平板上的菌落呈黄色、干燥、有特殊马粪臭味、粗糙型、紫外线照射下呈黄绿色荧光，血平皿上不溶血。20 株可疑产气荚膜杆菌形态学特征为灰白色、光滑、凸起、不透明、两端钝圆、边缘整齐的菌落，菌落周围有较大的乙型溶血圈，其外围常又有一层不完全的溶血圈。7 株可疑丁酸梭菌形态学特征的形状为不规则圆形、白色或乳白色、表面湿润光滑的单个菌落，血平皿上不溶血。2.3 16SrDNA 测序结果30 份 PCR 检出梭状芽孢杆菌 16 S rDNA 测序，测出 2 株艰难梭菌，11 株产气荚膜杆菌，2 株丁酸梭菌，13 株粪肠球菌。2.4 艰难梭菌毒力基因检测产毒艰难梭菌核酸检测试剂盒检测 30 份梭状芽孢杆菌，结果 13 份检出艰难梭菌 tcdA+、tcdB+。2.5 180 份标本中梭状芽孢杆菌检出情况180 份标本中，艰难梭菌感染 13 例（7.22%），其中男 3 例，女 10 例；7 例有长时间抗生素服用史，8 例易腹泻；Cp 检出 11 例（6.11%），其中女 10 例，男 1 例；丁酸梭菌检出 2 例（1.11%），男女各 1 例。不同年级检测情况见表 1。表 1 180 份标本中三种梭状芽孢杆菌检测情况 单位：例年级采样人数艰难梭菌感染丁酸梭菌 16 S rDNACp 16 S rDNA2018 级403042019 级509132020 级450012021 级45113合计180132113 讨论抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhea,AAD）已成为重要的公共卫生问题，艰难梭菌是已知的引起 AAD 最常见的因素，有 25%的病例归因于艰难梭菌感染14，贾筱溪等15的研究中检测艰难梭菌、Cp、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌 4 种主要病原菌，发现 Cp的阳性率最高 33.5%，这提示除艰难梭菌以外其他细菌30 医药前沿 2024年3月 第14卷第9期 论著在 AAD 中的作用也应引起关注。李颖等调查发现，婴儿人群梭状芽孢杆菌暴露水平，检出率较高的梭状芽孢杆菌分别为生胞梭菌（8.4%）、双酶梭菌（6.2%）和丁酸梭菌（4.6%）。本研究发现，湘南学院大学生梭状芽孢杆菌携带调查中，艰难梭菌感染率为 7.22%（13/180），Cp 携带率为 6.11%（11/180），丁酸梭菌携带率为 1.11%（2/180）。虽然 16 S rRNA 测序广泛用于细菌的鉴定但 16 S rRNA 克隆测序结果并不能确定分离到的菌株是否产生毒素基因，本研究仅检测到 13 株艰难梭菌毒素基因，均为 tcdA+、tcdB+。因艰难梭菌培养时杂菌多，易受粪肠球菌的干扰，导致测序失败17，测序只测出 2 株艰难梭菌，今后需优化检验方法，提高艰难梭菌分离率。丁酸梭菌是产芽孢严格厌氧的杆菌，有良好地促进动物肠道发育及提高畜禽生产性能的效果，是益生菌。然而李颖等报道了一起新生儿坏死性小肠结肠炎（neonatal necrotizing enterocolitis,NEC）暴发与院内感染丁酸梭菌密切相关的事件18，因此对分离到的丁酸梭菌，有必要进行毒力基因检测。Cp 是重要的食源性致病菌，李红新等19发现北京顺义区 87 名健康人粪便中 Cp 检出率较高，且 2 毒力基因携带率较高，87 份健康人群粪便标本中分离的 Cp 均不携带 epe 基因，验证了 epe 基因是 Cp 是否致病的一个重要的生物标志。本次调查结果显示，湘南学院大学生Cp 携带率为 6.11%（11/180），但未进行 2 和 epe 毒力基因检测，且本次调查未对分离的 Cp 和丁酸梭菌进行毒力基因检测，不能反映这两种菌的感染状况。综上所述，本次调查结果显示，湘南学院大学生人群中，Cp 携带率较高，丁酸梭菌、艰难梭菌均有检出，且艰难梭菌感染率较高，需对大学生人群加强食品安全健康教育，预防食源性疾病发生。【参考文献】1 SMITS W K,LyRAS D,LACy D b,et al.Clostridium difficile infectionJ.Nat Rev Dis Primers,2016,2:16020.2 SOLOMON K.The host immune response to Clostridium difficile infectionJ.Ther Adv Infect Dis,2013,1(1):19-35.3 GOyAL H,PERISETTI A,REHMAN M R,et al.New and emerging therapies in treatment of Clostridium difficile infectionJ.Eur J Gastroenterol Hepatol,2018,30(6):589-597.4 HASHIbA M,TOMINO A,TAKENAKA N,et al.Clostridium perfringens infection in a febrile patient with severe hemolytic anemiaJ.Am J Case Rep,2016,17:219-223.5 HAGIHARA M,ARIyOSHI T,KUROKI y,et al.Clostridium butyricum enhances colonization resistance against Clostridioides difficile by metabolic and immune modulationJ.Sci Rep,2021,11(1):15007.6 ARIyOSHI T,HAGIHARA M,TAKAHASHI M,et al.Effect of Clostridium butyricum on gastrointestinal infectionsJ.biomedicines,2022,10(2):483.7 CASSIR N,bENAMAR S,LA SCOLA b.Clostridium butyricum:from beneficial to a new emerging 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