现代分子生物学(00002)市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

第第 五五 章章 分子生物学基本研究法分子生物学基本研究法（上）（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术第1页第2页重组重组DNADNA操作过程示意图操作过程示意图第3页Gregor Mendel(1822-1884).The Father of Genetics第4页第5页第6页第7页第8页当当代代分分子子生生物物学学快快速速发发展展，得得益益于于上上个个世世纪纪中中叶叶以以来来研研究究方方法法、尤尤其其是是基基因因操操作作和和基基因因工程技术进步。工程技术进步。基基因因操操作作主主要要包包含含DNA分分子子切切割割与与连连接接、杂杂交交、电电泳泳、细细胞胞转转化化、核核酸酸序序列列分分析析以以及及基基因因人人工工合合成成、表表示示、定定点点突突变变和和PCR扩扩增增等等，是分子生物学研究关键技术。是分子生物学研究关键技术。第9页基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，组成遗传物质新组合，使粒或其它载体分子，组成遗传物质新组合，使之进入原先没有这类分子寄主细胞内并进行连之进入原先没有这类分子寄主细胞内并进行连续稳定繁殖和表示。该技术是核酸操作一部分，续稳定繁殖和表示。该技术是核酸操作一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一个寄主细只不过它强调了外源核酸分子在另一个寄主细胞中繁衍与表示。胞中繁衍与表示。第10页实际上，这种跨越物种屏障、把来自其它生实际上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物基因置于新生物细胞之中能力，是基因工物基因置于新生物细胞之中能力，是基因工程技术区分于其它技术根本特征。程技术区分于其它技术根本特征。DNA操作技术操作技术基因克隆惯用载体系统基因克隆惯用载体系统基因分离与判定基因分离与判定第11页5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史上重大事件技术发展史上重大事件三大成就：三大成就：一、在一、在2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息携带年代确定了遗传信息携带者、即基因分子载体是者、即基因分子载体是DNADNA而不是蛋白质，而不是蛋白质，处理了遗传物质基础问题；处理了遗传物质基础问题；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子双螺旋结构模型分子双螺旋结构模型和半保留复制机制和半保留复制机制,处理了基因自我复制和处理了基因自我复制和世代交替问题；世代交替问题；第12页三三、5050年年代代末末至至6060年年代代，相相继继提提出出了了“中中心心法法则则”和和操操纵纵子子学学说说,成成功功地地破破译译了了遗遗传传密密码码，说说明了遗传信息流动与表示机制。明了遗传信息流动与表示机制。第13页表表5-15-1重组重组DNADNA技术史上主要事件技术史上主要事件年年 份份事事 件件1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发觉了从大肠杆菌中发觉了DNA聚合酶聚合酶I。1959-1960Ochoa发发 觉觉 RNA聚聚 合合 酶酶 和和 信信 使使 RNA，并并 证证 实实mRNA决定了蛋白质分子中氨基酸序列。决定了蛋白质分子中氨基酸序列。1961Nirenberg破破译译了了第第一一个个遗遗传传密密码码；Jacob和和Monod提出了调整基因表示操纵子模型。提出了调整基因表示操纵子模型。1964Yanofsky和和Brenner等等人人证证实实，多多肽肽链链上上氨氨基基酸酸序序列与该基因中核苷酸序列存在着共线性关系。列与该基因中核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完完成成了了酵酵母母丙丙氨氨酸酸tRNA全全序序列列测测定定；科科学学家证实细菌抗药性通常由家证实细菌抗药性通常由“质粒质粒”DNA所决定。所决定。第14页1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等等人人破破译译了了全全部部遗遗传传密密码。码。1967第一次发觉第一次发觉DNA连接酶连接酶1970Smith，Wilcox和和Kelley分分离离了了第第一一个个限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶，Temin和和Baltimore从从RNA肿瘤病毒中发觉反转录酶。肿瘤病毒中发觉反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等等人人发发展展了了DNA重重组组技技术术，于于72年年取取得得第第一个重组一个重组DNA分子，分子，73年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与与Maxam和和Gilbert等等人人创创造造了了DNA序序列列测测定定技技术术，1977年完成了全长年完成了全长5387bp噬菌体噬菌体174基因组测定。基因组测定。1978首首次次在在大大肠肠杆杆菌菌中中生生产产由由人人工工合合成成基基因因表表示示人人脑脑激激素素和和人人胰胰岛岛素。素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程能够被专利化。美国联邦最高法院裁定微生物基因工程能够被专利化。1981Palmiter和和Brinster取取得得转转基基因因小小鼠鼠，Spradling和和Rubin得得到到转基因果蝇。转基因果蝇。1982美美、英英同同意意使使用用第第一一例例基基因因工工程程药药品品胰胰岛岛素素，Sanger等等人人完成了入噬菌体完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。全序列测定。第15页1983取得第一例转基因植物。取得第一例转基因植物。1984斯坦福大学取得关于重组斯坦福大学取得关于重组DNA专利。专利。1986GMO首次在环境中释放。首次在环境中释放。1988Watson出任出任“人类基因组计划人类基因组计划”首席科学家。首席科学家。1989DuPont企业取得转肿瘤基因小鼠企业取得转肿瘤基因小鼠“Oncomouse”。1992欧欧共共体体35个个试试验验室室联联合合完完成成酵酵母母第第三三染染色色体体全全序序列测定列测定(315kb)。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所取得克隆羊。英国爱丁堡罗斯林研究所取得克隆羊。完完 成成 第第 一一 个个 高高 等等 植植 物物 拟拟 南南 芥芥 全全 序序 列列 测测 定定（(1.15108bp)。完成第一个人类基因组全序列测定完成第一个人类基因组全序列测定(2.7109bp)。第16页限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶能能够够识识别别DNA上上特特定定碱碱基基序列并从这个位点切开序列并从这个位点切开DNA分子。分子。第第一一个个核核酸酸内内切切酶酶EcoRI是是Boyer试试验验室室在在1972年年发发觉觉，它它能能特特异异性性识识别别GAATTC序序列列，将将双双链链DNA分分子子在在这这个个位位点点切切开开并并产产生生含含有有粘性末端小片段。粘性末端小片段。第17页图图5-1 几个主要几个主要DNA内切酶所识别序列及其内切酶所识别序列及其酶切末端酶切末端。第18页图图5-2 DNA连接酶能把不一样连接酶能把不一样DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 第19页体体外外利利用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶和和DNA连连接接酶酶进进行行DNA切切割割和和重重组组以以后后，还还要要将将它它们们连连接接到到具具备备自自主主复复制制能能力力DNA分分子子上上，才才能能在在寄寄主主细胞中进行繁殖。细胞中进行繁殖。具具备备自自主主复复制制能能力力DNA分分子子就就是是分分子子克克隆隆载载体体（vector）。病病毒毒、噬噬菌菌体体和和质质粒粒等等小小分分子子量复制子都是基因导入载体。量复制子都是基因导入载体。第20页取取得得了了用用外外源源DNA片片段段和和载载体体分分子子重重组组而而成成杂杂种种DNA分分子子后后，还还必必须须经经过过一一个个被被称称为为细细菌菌转转化化过过程程将将其其重重新新导导入入到到寄寄主主细细胞胞中中，才才能确保重组能确保重组DNA分子增殖（图分子增殖（图5-3）。）。第21页图图5-3 重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图 第22页5.2 DNA操作技术操作技术5.2.1核酸凝胶电泳核酸凝胶电泳自自 从从 琼琼 脂脂 糖糖（agarose）和和 聚聚 丙丙 烯烯 酰酰 胺胺（polyacrylamide）凝凝胶胶被被引引入入核核酸酸研研究究以以来来，按按分分子子量量大大小小分分离离DNA凝凝胶胶电电泳泳技技术术，已已经经发发展展成成为为一一个个分分析析判判定定重重组组DNA分分子子及及蛋蛋白白质质与与核酸相互作用主要试验伎俩。核酸相互作用主要试验伎俩。琼脂，琼脂糖，聚丙烯酰胺，核酸，蛋白质？琼脂，琼脂糖，聚丙烯酰胺，核酸，蛋白质？第23页 基基 本本 原原 理理一一个个分分子子被被放放置置到到电电场场中中，会会以以一一定定速速度度移移向向适适当当电电极极，把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场场作作用用下下迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳迁迁移移率率。它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子子本本身身所所携携带带净净电电荷荷数数成成正正比比，与与片片段段大大小小成反比。成反比。第24页生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，所所以以，DNA和和RNA又又被被称称为为多多聚聚阴阴离离子子（polyanions），在在电电场场中中向向正正电电极极方方向向迁移。迁移。因因为为糖糖-磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上重重复复性性质质，相相同同数数量量双双链链DNA几几乎乎含含有有等等量量净净电电荷荷（电电荷荷密密度度），所以它们能以一样速度向正电极方向迁移。，所以它们能以一样速度向正电极方向迁移。第25页琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段范围为片段范围为0.250kb之之间。间。聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1到到1000个碱基对个碱基对之间。之间。凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙大小，浓度越凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强，高，孔隙越小，其分辨能力就越强，越适合分越适合分离小分子量分子。离小分子量分子。第26页表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段能力段能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA大小范围（大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501第27页图图5-4 5-4 溴溴化化乙乙锭锭染染料料化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子插插入入作作用用。因因为为插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA条条带带便便展展现现出出橘橘黄黄色色荧荧光光，易于判定。易于判定。第28页图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 第29页5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子增殖分子增殖经过细菌转化方法将体外构建好杂种经过细菌转化方法将体外构建好杂种DNA分子分子导入宿主细胞中。外源导入宿主细胞中。外源DNA经过本身载体上复经过本身载体上复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长久制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长久保留下来，并能以完整形式从细胞中被分离纯保留下来，并能以完整形式从细胞中被分离纯化出来。化出来。第30页细菌转化（细菌转化（transformation），是指一个细菌菌），是指一个细菌菌株因为捕捉了来自供体菌株株因为捕捉了来自供体菌株DNA而造成性状特而造成性状特征发生遗传改变过程。征发生遗传改变过程。为提升效率，可对受体菌进行物理或化学处理，为提升效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取增加其获取DNA能力。经过这种处理细胞被称能力。经过这种处理细胞被称作感受态细胞（作感受态细胞（competent cells）。）。第31页图图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 第32页CaCl2法法将将快快速速生生长长久久大大肠肠杆杆菌菌置置于于经经0预预处处理理低低渗渗CaCl2溶溶液液中中，细细胞胞膨膨胀胀，膜膜通通透透性性改改变变，易易与外源与外源DNA相粘附。相粘附。将将该该体体系系转转移移到到42下下做做短短暂暂热热刺刺激激，外外源源DNA就就可可能能被被细细胞胞吸吸收收。将将经经过过转转化化后后细细胞胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转转化化效效率率可可到到达达51062107个个转转化化子子/g超超螺旋质粒螺旋质粒DNA。第33页电击法电击法电脉冲能够在细胞膜上造成小凹陷，形成疏电脉冲能够在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。伴随跨膜电压增加，大疏水性孔洞水孔洞。伴随跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中会转变为亲水性孔洞，介质中DNA进入细胞进入细胞质。质。将将生生长长至至对对数数中中期期E.coli菌菌液液冷冷却却至至4后后离离心心，洗洗菌菌后后用用10%甘甘油油悬悬浮浮，将将高高密密度度菌菌液液（21010/ml）置于特制电极杯中进行电击。）置于特制电极杯中进行电击。第34页取取 得得 最最 大大 转转 化化 效效 率率 时时 场场 强强 普普 通通 为为12.515kV/cm，时时间间跨跨度度普普通通为为4.55.5毫毫秒。秒。电电击击转转化化与与温温度度相相关关，普普通通在在04进进行行。因因为为转转化化载载体体上上常常带带有有LacZ基基因因，多多用用带带有有不不一一样样抗抗生生素素（惯惯用用抗抗生生素素包包含含氨氨苄苄青青霉霉素素、卡卡那那霉霉素素和和四四环环素素等等）选选择择性性培培养养基基结结合合-互补蓝白斑筛选法判定转化细胞。互补蓝白斑筛选法判定转化细胞。第35页利利用用噬噬菌菌体体颗颗粒粒能能够够有有效效地地将将DNA注注入入到到寄寄主主细细胞胞中中这这一一特特点点，科科学学家家又又创创造造了了重重组组体体DNA分子体外包装法。分子体外包装法。经经包包装装基基因因工工程程噬噬菌菌体体颗颗粒粒能能够够借借助助细细菌菌表表面面噬噬菌菌体体接接收收器器位位点点将将DNA注注入入受受体体细细菌菌，并在这些细胞中得到繁殖和表示。并在这些细胞中得到繁殖和表示。第36页图图5-6 噬菌体作为克隆载体构建基因文库流噬菌体作为克隆载体构建基因文库流程图程图 第37页5.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚聚合合酶酶链链式式反反应应是是快快速速扩扩增增DNA序序列列最最惯惯用用方法。方法。PCR反反应应模模板板DNA若若是是基基因因组组上上某某个个片片段段，就就称称为为genomic PCR，若若是是mRNA，反反转转录录产生产生cDNA，就称为，就称为RT-PCR。第38页PCR技术原理技术原理首首先先将将双双链链DNA分分子子在在临临近近沸沸点点温温度度下下加加热热分分离离成成两两条条单单链链DNA分分子子，DNA聚聚合合酶酶以以单单链链DNA为为模模板板并并利利用用反反应应混混合合物物中中四四种种脱脱氧氧核核苷苷三磷酸合成新生三磷酸合成新生DNA互补链。互补链。第39页 DNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNA相结合（退火）相结合（退火）DNA合成（链延伸）三步。合成（链延伸）三步。经经不不停停重重复复循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有双双链链DNA分分子子数数，即即两两条条引引物物结结合合位位点点之之间间DNA区段拷贝数，理论上最高值应是区段拷贝数，理论上最高值应是2n。第40页将将含含有有待待扩扩增增DNA样样品品反反应应混混合合物物放放置置在在高高温温（94）环环境境下下加加热热1分分钟钟，使使双双链链DNA变变性性，形成单链模板形成单链模板DNA。降降低低反反应应温温度度（退退火火，约约50），约约1分分钟钟，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNA结结合合在在靶靶DNA区段两端互补序列位置上。区段两端互补序列位置上。将将反反应应混混合合物物温温度度上上升升到到72左左右右保保温温1-数数分分钟钟，在在DNA聚聚合合酶酶作作用用下下，从从引引物物3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板分分子子按按53方方向向延延伸伸，合成新生合成新生DNA互补链。互补链。第41页图图5-16 聚聚合合酶酶链链式式反反应应示示意意图图。（a）起起始始材材料料，双双链链DNA；（b）反反应应混混合合物物加加热热后后发发生生链链分分离离，降降温温使使引引物物结结合合到到待待扩扩增增靶靶DNA区区段段两两端端退退火火位位点点上上；（c）Taq聚聚合合酶酶以以单单链链DNA为为模模板板在在引引物物引引导导下下利利用用反反应应混混合合物物中中dNTPs合合成成互互补补新新链链DNA；（d）将将反反应应混混合合物物再再次次加加热热，使使旧旧链链和和新新链链分分开开；（e）合合成成新新互互补补链链DNA；（f）重重复复b；（g）重重复复c、第42页图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 第43页图图5-8 PCR指指数数扩扩增增时时循循环环次次数数与与DNA产产物物数数量比较量比较第44页5.2.4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）因因为为PCR敏敏感感性性高高，扩扩增增产产物物总总量量变变异异系系数数大大，定定量量不不准准确确。90年年代代末末期期出出现现了了Q-PCR，利利用用荧荧光光检检测测PCR仪仪绘绘制制DNA扩扩增增过过程程中中累累积积速速率率动动态态改改变变图图，基基本本消消除除在在测测定定终终端端产产物丰度时变异系数较大问题。物丰度时变异系数较大问题。第45页混混合合在在PCR反反应应液液中中荧荧光光探探针针只只有有与与大大片片段段DNA结合后，才能够被激发出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。伴伴随随新新合合成成DNA片片段段增增加加，因因为为结结合合到到DNA上荧光探针增加，被激发产生荧光对应增加。上荧光探针增加，被激发产生荧光对应增加。非非序序列列特特异异性性荧荧光光染染料料SYBR Green I,激激发发光波长光波长520nm。第46页SYBR Green I作作探探针针实实时时定定量量PCR试试验验过过程图示程图示 第47页为为确确保保荧荧光光检检测测确确实实实实是是靶靶DNA，又又设设计计了了仅能与目标仅能与目标DNA特异结合荧光探针。特异结合荧光探针。TaqMan探探针针是是一一段段与与靶靶DNA序序列列中中间间部部位位结结合合单单链链DNA，长长50bp-150bp，该该DNA5和和3端端带带有有短短波波长长和和长长波波长长两两个个不不一一样样荧荧光光基基团团，因因为为彼彼此此距距离离靠靠近近，在在荧荧光光共共振振能能量量转转移移（FRET）作作用用下下发发生生荧荧光光淬淬灭灭，因因而而检测不到荧光。检测不到荧光。第48页伴伴随随PCR反反应应进进行行，TaqMan 探探针针结结合合到到目目标标DNA序序列列上上，而而且且会会被被含含有有外外切切酶酶活活性性Taq DNA聚聚合合酶酶逐逐一一切切除除而而降降解解。切切下下来来荧荧光光基基团团解解除除了了荧荧光光淬淬灭灭束束缚缚，会会在在激激发发光光下下发发出出荧荧光光，所所以以，产产生生荧荧光光强强度度直直接接反反应应了了所扩增靶所扩增靶DNA总量。总量。第49页TaqMan探探针针 实实 时时 定定量量 PCR技技术术 第50页图图5-11用实时定量用实时定量PCR法分析未知样品靶基因法分析未知样品靶基因绝对表示量。绝对表示量。第51页Ct值值是是产产物物荧荧光光强强度度首首次次超超出出设设定定阈阈值值时时，PCR反反应应所所需需循循环环数数。利利用用标标准准曲曲线线，能能够够确确定样品中待检测靶定样品中待检测靶DNA绝对含量。绝对含量。第52页5.2.5 基因组基因组DNA文库构建文库构建把把某某种种生生物物基基因因组组DNA切切成成适适当当大大小小，分分别别与与载载体体组组合合，导导入入微微生生物物细细胞胞，形形成成克克隆隆。聚聚集集包包含含基基因因组组中中全全部部DNA序序列列克克隆隆（理理论论上上每每个个序序列列最最少少有有一一个个代代表表），这这么么克克隆隆片片段总汇，称为基因组段总汇，称为基因组DNA文库。文库。第53页Clark和和Carbon于于1975年提出公式：年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式式中中：N表表示示一一个个基基因因组组文文库库所所应应该该包包含含重重组组克克隆隆数数目目；p表表示示所所期期望望靶靶基基因因在在文文库库中中出出现现概概率率；f表表示示重重组组克克隆隆平平均均插插入入片片段段长长度度与基因组与基因组DNA总长比值。总长比值。为为取取得得整整个个基基因因簇簇或或一一个个基基因因及及其其两两翼翼延延伸伸序序列列，基基因因组组文文库库中中DNA片片段段常常大大于于20kb。以以 人人 为为 例例，其其 基基 因因 组组 大大 小小 为为 3109bp若若p=99%，平平均均插插入入片片段段大大小小为为20kb，则则N=6.7105。第54页构构建建基基因因组组文文库库最最惯惯用用是是噬噬菌菌体体载载体体（克克隆隆能能力力约约1520kb）和和限限制制性性内内切切酶酶部部分分消消化化法法。比比如如用用识识别别4个个核核苷苷酸酸核核酸酸限限制制性性内内切切酶酶Sau3A，与与BamHI是是一一对对同同尾尾酶酶消消化化DNA，由由Sau3A酶酶切切产产生生DNA片片段段可可插插入入到到经经BamHI消消化化噬菌体载体上。噬菌体载体上。第55页图图5-13 用用Sau3A限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化真真核核生生物物基基因因组组DNA并并利利用用 噬噬菌菌体体载载体体构构建建基基因因组文库过程图示。组文库过程图示。第56页另另外外，还还有有很很多多大大容容量量克克隆隆载载体体，如如柯柯斯斯质质粒粒、细细菌菌人人工工染染色色体体（BAC）、P1源源人人工工染染色色体体（PAC）、酵酵母母人人工工染染色色体体（YAC）等等都都可可用用于基因组文库构建。于基因组文库构建。它它们们优优点点是是能能够够插插入入更更大大片片段段DNA，不不过过稳稳定定性性普普通通较较差差，在在大大量量复复制制过过程程中中轻轻易易出出现现缺缺失失现象。操作也相对较困难。现象。操作也相对较困难。第57页5.3 RNA基本操作技术基本操作技术真真核核生生物物基基因因组组DNA庞庞大大，有有大大量量重重复复序序列列，极极难难直直接接分分离离得得到到靶靶基基因因片片段段。而而cDNA来来自自反反转转录录mRNA，无无冗冗余余序序列列，经经过过筛筛选选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。文库，可较快地分离到相关基因。第58页细细胞胞中中总总RNA包包含含mRNA，rRNA，tRNA以以及及一一些些小小RNA（sRNA）。一一个个经经典典动动物物细细胞胞约约含含10-5g RNA,其其中中80%-85%为为rRNA、15%-20%为为tRNA及及sRNA，这这些些RNA分分子子含含有有确确定定大大小小和和核核苷苷酸酸序序列列，尤尤其其是是rRNA电电泳泳后后28S和和18S特特征征性性条条带带是是判判定定总总RNA纯纯度度和和完整性主要参数。完整性主要参数。mRNA约占总约占总RNA 1%-5%。第59页第60页图图5-14 PolyATtract mRNA分离纯化分离纯化过程简图。过程简图。第61页RNA浓浓度度和和纯纯度度能能够够经经过过测测定定其其OD260和和OD280 来来判判断断。OD260为为1时时相相当当于于浓浓度度为为40g/ml，而而OD260/OD280比比值值假假如如在在1.8-2.0之之间间，表表示示所所提提取取RNA纯纯度度很很好好，假假如如样样品品中中有有蛋蛋白白质质或或酚酚污染，则污染，则OD260/OD280比值将显著低于比值将显著低于1.8。第62页因因为为RNA分分子子敏敏感感脆脆弱弱，在在自自然然状状态态下下难难以以被被扩扩增增，为为了了研研究究mRNA所所包包含含功功效效基基因因信信息息，普普通通将将其其反反转转录录成成稳稳定定DNA双双螺螺旋旋（cDNA，complementary DNA），再再插插入入到到能能够够自自我我复制载体中。复制载体中。第63页图图5-15 cDNA合合成过程示意图。成过程示意图。第64页图图5-16 定向定向cDNA 合成及分子修饰合成及分子修饰第65页因因为为绝绝大大多多数数大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞都都会会切切除除带带有有5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶外外源源DNA，所所以以试试验验中中常常选选取取mcrA-mcrB-菌株以预防菌株以预防cDNA被降解。被降解。第66页cDNA文库构建文库构建cDNA长度普通在长度普通在0.5-8 kb之间，质粒载体之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库惯用文库惯用Uni-zap XR（一个（一个噬菌粒噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体高效性和质粒载体）做载体，它具备噬菌体高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选便利，可容纳载体系统利用蓝白斑筛选便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有插入片段，含有pBluescript载体全载体全部序列。部序列。重组后可经过体内剪切反应（重组后可经过体内剪切反应（In Vivo Excision）将）将cDNA插入片段转移到质粒系插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。统中进行筛选、克隆和序列分析。第67页基因文库筛选基因文库筛选基基因因文文库库筛筛选选是是指指经经过过某某种种特特殊殊方方法法从从基基因因文文库库中中判判定定出出含含有有所所需需重重组组DNA分分子子特特定定克克隆隆过过程程。筛筛选选方方法法有有很很各各种种，如如核核酸酸杂杂交交法法，PCR筛选法和免疫筛选法等。筛选法和免疫筛选法等。第68页1、核酸杂交法：、核酸杂交法：核核酸酸杂杂交交法法以以其其广广泛泛适适用用性性和和快快速速性性成成为为基基因因文文库库筛筛选选中中最最惯惯用用一一个个方方法法，用用放放射射性性标标识识特特异异DNA探探针针适适合合用用于于高高密密度度菌菌落落杂杂交交筛筛选。选。将将待待筛筛选选菌菌落落转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，适适当当温育。同时保留原来菌落平板作对照。温育。同时保留原来菌落平板作对照。第69页取取出出已已经经长长有有菌菌落落膜膜，用用碱碱液液处处理理，使使菌菌落落发发生生裂裂解解，DNA随随之之变变性性。用用蛋蛋白白酶酶K处处理理硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜去去除除蛋蛋白白质质，形形成成菌菌落落DNA印印迹。迹。80烘烘烤烤滤滤膜膜，将将DNA固固定定在在膜膜上上。将将滤滤膜膜与与放放射射性性标标识识DNA或或RNA探探针针杂杂交交，经经过过放放射射性性自自显显影影显显示示杂杂交交结结果果。经经过过对对应应于于平平板板上位置找到对应克隆。上位置找到对应克隆。第70页图 5-17 通过核酸杂交筛选目克隆流程图第71页2、PCR筛选法筛选法将将整整个个文文库库（以以质质粒粒形形式式或或者者细细菌菌形形式式均均可可）保保留留在在多多孔孔培培养养板板上上，用用设设计计好好目目标标基基因因探探针针对对每每个个孔孔进进行行PCR筛筛选选，判判定定出出阳阳性性孔孔，把把每每个个阳阳性性孔孔中中克克隆隆再再稀稀释释到到次次级级多多孔孔板板中中进进行行PCR筛筛选选。重重复复以以上上程程序序，直直到到判判定定出出与与目目标标基因对应单个克隆为止。基因对应单个克隆为止。第72页3、免疫筛选法、免疫筛选法该该法法仅仅适适合合用用于于对对表表示示文文库库筛筛选选。若若试试验验中中靶靶基基因因序序列列完完全全未未知知不不过过有有针针对对该该基基因因产产物物特特异异性抗体，就能够采取免疫筛选法。性抗体，就能够采取免疫筛选法。第73页图图5-18 噬噬菌菌体体表表示示文文库库免免疫疫化化学学筛筛选选法法示示意意图图 第74页5.4 SNP理论与应用理论与应用SNP是是Single Nucleotide Polymorphism缩缩写写，即即单单核核苷苷酸酸多多态态性性，指指基基因因组组DNA序序列列中中因因为为单单个个核核苷苷酸酸（A，T，C和和G）突突变变而而引引发多态性。发多态性。第75页5.4.1 SNP概述概述科科学学上上把把染染色色体体DNA同同一一位位置置上上每每个个碱碱基基类类型型叫叫做做一一个个等等位位位位点点。SNP是是基基因因组组中中最最简简单单最最常常见见多多态态性性形形式式，含含有有很很高高遗遗传传稳稳定定性性。SNP检检测测和和分分析析技技术术已已经经成成为为继继限限制制性性片片段段长长度度多多态态性性（RFLP）和和微微卫卫星星标标识识（SSR）之之后后第第三代遗传标识。三代遗传标识。第76页图5-19 5-19 染色体上共同染色体上共同遗传SNPSNP组合。合。图中图中SNP1和和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点有等位位点A和和G，SNP2有等位位点有等位位点G和和T。所。所以，染色体对有两种可能以，染色体对有两种可能SNP组合。组合。第77页单倍倍型型基因基因型型外外显子子IV内含子内含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米玉米globulin1不一样单倍型和基因型之间多态性比较不一样单倍型和基因型之间多态性比较 第78页据据预预计计，人人类类DNA中中每每300-1000个个碱碱基基对对就就有有一一个个SNP，所所以以，一一个个人人类类个个体体大大约约携携带带300万万-1000万万个个SNPs。位位于于染染色色体体上上某某一一区区域域一一组组相相关关联联SNP等等位位位位点点被被称称作作单单倍倍型型（haplotype），相相邻邻SNPs等等位位位位点点倾倾向向于于以一个整体遗传给后代。以一个整体遗传给后代。第79页依据依据SNP在基因组中分布位置分为编码区在基因组中分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区），调控区SNP（pSNP）和非）和非编码区编码区SNP（rSNP）三类。）三类。编码区内变异率仅占周围序列编码区内变异率仅占周围序列1/5，cSNP总量总量显著少于其它两类显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义分为同义cSNP（synonymous cSNP），编码序列改变不影响所翻译氨基酸），编码序列改变不影响所翻译氨基酸序列）和非同义序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSNP），碱基序列改变使氨基酸序列发生改），碱基序列改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质功效。变，可能影响蛋白质功效。第80页5.4.2 SNP检测技术检测技术经过经过DNA测序法取得新测序法取得新SNP。基基因因分分型型（genotyping）是是指指利利用用数数据据库库中中已已经经有有SNP进进行行特特定定人人群群序序列列和和发发生生频频率率研研究究，主主要要包包含含基基因因芯芯片片技技术术、Taqman技技术术、分分子子信信标标（molecular beacons）技技术术和和焦焦磷酸测序法（磷酸测序法（pyrosequencing）等。）等。第81页1基因芯片技术基因芯片技术经过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互经过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补序列杂交而不与含有单个错配碱基序列杂补序列杂交而不与含有单个错配碱基序列杂交。交。优点是高通量，一次可对多个优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模进行规模性筛选，被检起始材料也极少，操作步骤简性筛选，被检起始材料也极少，操作步骤简单。单。缺点是芯片设计成本高。而且，因为缺点是芯片设计成本高。而且，因为DNA样样品复杂性，有些品复杂性，有些SNP不能被检测。不能被检测。第82页2Taqman技术技术PCR反反应应系系统统中中加加入入2种种不不一一样样荧荧光光标标识识分分别别与与两两个个等等位位基基因因配配正正确确探探针针。伴伴随随PCR进进行行，与与模模板板完完全全配配正正确确探探针针逐逐步步被被Taq DNA聚聚合合酶酶53外外切切活活性性所所切切割割，荧荧光光基基团团与与3端端淬淬灭灭基基团团分分离离，荧荧光光基基团团被被激激活活。不不完完全全配配正正确确探探针针（代代表表另另一一个个等等位位基基因因）不不能能被被有有效效切切割割，供体荧光基团依然被淬灭。供体荧光基团依然被淬灭。第83页3分子信标（分子信标（molecular beacon）技术）技术是是一一个个呈呈茎茎环环结结构构荧荧光光标标识识寡寡核核苷苷酸酸，环环状状区区与与靶靶序序列列特特异异性性结结合合，茎茎干干区区由由5-8个个碱碱基基对对组组成成，5端端带带有有荧荧光光发发生生基基团团，3端端带带有有荧荧光光淬淬灭灭基基团团。自自由由状状态态时时，分分子子信信标标呈呈发发卡卡式式结结构构，荧荧光光几几乎乎完完全全淬淬灭灭。与与靶靶分分子子相相结结合合时时，荧荧光光基基团团和和淬淬灭灭基基团团之之间间距距离离增增大大，分子信标荧光恢复。分子信标荧光恢复。第84页Taqman技技术（上）及（上）及分子信分子信标技技术（下）原（下）原理示意理示意图。第85页5.5 基因克隆（基因克隆（clone）技术）技术在在多多细细胞胞高高等等生生物物个个体体水水平平上上，克克隆隆表表示示由由含含有有相相同同基基因因型型同同一一物物种种两两个个或或数数个个个个体体组组成成群群体体。从从同同一一受受精精卵卵分分裂裂而而来来单单卵卵双双生生子子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。）便是属于同一克隆。第86页在在细细胞胞水水平平上上，克克隆隆一一词词是是指指由由同同一一个个祖祖细细胞胞（progenitor cell）分分裂裂而而来来一一群群带带有有完完全全相相同遗传物质子细胞。同遗传物质子细胞。在在分分子子生生物物学学上上，人人们们把把将将外外源源DNA插插入入含含有有复复制制能能力力载载体体DNA中中，使使之之得得以以永永久久保保留留和复制这种过程称为克隆。和复制这种过程称为克隆。第87页5.5.1 RACE技技术术（rapid amplification of cDNA ends）在在已已知知cDNA序序列列基基础础上上克克隆隆5或或3端端缺缺失失序序列列技技术术。依依据据已已知知序序列列设设计计基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物，由由该该片片段段向向外外侧侧进进行行PCR扩扩增增得得到到目目标标序序列列。用用于于扩扩增增5端端方方法法称称为为5RACE，用于扩增用于扩增3端称为端称为3RACE。第88页5 RACE1、在反转录酶作用下，以、在反转录酶作用下，以基因片段内部特异性引物启基因片段内部特异性引物启始始cDNA第一条链合成。第一条链合成。2、RNase混合物降解模板混合物降解模板mRNA，纯化第一链。，纯化第一链。3、用、用末端转移酶末端转移酶在在cDNA链链3端加入连续端加入连续dCTP。4、以连有、以连有oligo(dG)锚定引锚定引物和基因片段内部特异物和基因片段内部特异nested引物进行引物进行PCR扩增，扩增，得到目标片段，用得到目标片段，用nest PCR检测。检测。第89页3RACE1、用用oligo(dT)锚锚定定引引物物启启始始cDNA第第一一链合成链合成.2、降解模板、降解模板mRNA.3、用用通通用用锚锚定定引引物物和和基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物进进行行PCR扩扩增增得得到到 目目 标标 3