沉默TUFM通过AMPK_mTOR信号通路调控线粒体自噬对肺源性心脏病模型大鼠肺动脉高压的影响.pdf

【】./.论著基础沉默 通过/信号通路调控线粒体自噬对肺源性心脏病模型大鼠肺动脉高压的影响崔本科王岩卢云凤杜鹃翟羽涵基金项目:辽宁省自然科学基金项目()作者单位:沈阳辽宁省人民医院呼吸与危重症科(崔本科、王岩、杜鹃、翟羽涵)沈阳辽宁省金秋医院 心内科(卢云凤)通信作者:王岩:.【摘 要】目的 探讨线粒体翻译延伸因子()通过线粒体自噬促进肺动脉高压()血管重塑的作用机制 方法 年 月 年 月于辽宁省人民医院中心实验室进行实验 将 只健康雄性 大鼠随机分为空白对照()组、模型()组、过表达()组、阴性对照()组、短发夹()敲除()组和 阴性对照()组每组 只 除 组外其余大鼠均一次性腹腔注射 野百合碱(/)诱导心源性肺水肿 大鼠模型大鼠肺动脉平滑肌细胞()在低氧()条件下培养 模拟体内肺动脉高压微环境分为常氧()组、低氧()组、小干扰()组、组、组、组和 组 右心导管插管和脉冲多普勒超声检测大鼠肺血流动力学苏木素伊红染色检测肺小动脉病理结构免疫荧光共染检测 组织定位细胞计数法检测细胞增殖透射电镜观察线粒体结构和自噬小体蛋白免疫印迹检测、自噬、凋亡和磷酸腺苷活化蛋白激酶()/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()通路相关蛋白表达结果 与 组比较 组大鼠 蛋白表达升高且主要与 标志物 平滑肌肌动蛋白()在肺小动脉内膜存在共定位而与内皮细胞标志物 无共定位肺动脉收缩压()升高肺动脉血流加速时间()缩短远端肺小动脉管壁呈向心性增厚管腔狭窄几乎堵塞、苄氯素 重组蛋白()、人微管相关蛋白轻链()/和 淋巴细胞瘤()蛋白表达升高、相关 蛋白()和凋亡酶激活因子()蛋白表达降低(.)与 组比较 组 升高 缩短肺小动脉管壁厚度升高肺动脉、/和 表达升高、和 表达降低(.)与 组比较 组 降低 延长肺小动脉管壁厚度和管腔狭窄度有所改善、/和 表达降低、和 表达升高(.)与 组比较 组 细胞 蛋白表达升高与 组细胞相比 和 组、蛋白表达升高、/、表达降低线粒体结构完整 细胞增殖活性降低细胞表达降低 表达升高(.)与 组比较 组细胞 和 蛋白表达降低、/、和 表达升高部分线粒体损伤崩解嵴断裂消失 细胞增殖活性明显升高细胞 表达升高 表达降低(.)结论沉默 可通过激活/信号通路促进线粒体自噬加速 肺动脉平滑肌细胞凋亡【关键词】肺动脉高压线粒体翻译延伸因子 平滑肌细胞线粒体自噬/通路大鼠【中图分类号】.【文献标识码】/.:():.【】To explore the mechanism by which mitochondrial translation elongation factor Tu(TUFM)promotes vascular remodeling in pulmonary arterial hypertension(PAH)through mitochondrial autophagy.Theexperiment was conducted in the Central Laboratory of Liaoning Provincial Peoples Hospital from January 2022 to June 2023.Thirtysix healthy male Sprague Dawley rats were randomly divided into a blank control(Ctrl)group,a model(PAH)group,a TUFM overexpression(OE)group,an OE negative control(OENC)group,a short hairpin RNA(Sh)knockout TUFM(Sh)疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .group,and a ShNC negative control(ShNC)group,with 6 rats in each group.Except for the Ctrl group,all other rats weregiven a onetime intraperitoneal injection of 1%monocrotaline(60 mg/kg)to induce cardiogenic pulmonary edema(PAH)ina rat model.Rat pulmonary artery smooth muscle cells(PASMC)were cultured under low oxygen(3%O2)conditions for 24hours to simulate the in vivo pulmonary arterial hypertension microenvironment.They were divided into normoxic(Norm)group,hypoxic(Hyp)group,small interfering RNA(SiRNA1)group,SiRNA2 group,SiNC group,OENC group,and OEgroup.Right heart catheterization and pulsed Doppler ultrasound were used to detect pulmonary hemodynamics in rats.Hematoxylineosin staining was used to detect the pathological structure of pulmonary arterioles.Immunofluorescence co staining was used to detect tissue localization of TUFM.Cell counting method is used to detect cell proliferation.Observationof mitochondrial structure and autophagosomes using transmission electron microscopy.Protein immunoblotting was usedto detect the expression of TUFM,autophagy,apoptosis,and adenosine phosphate activated protein kinase(AMPK)/mammalian rapamycin target protein(mTOR)pathway related proteins.Compared with the Ctrl group,the expression ofTUFM protein in the PAH group rats increased and was mainly associated with PASMC markers smooth muscle actin(SMA)is co localized in the intima of pulmonary arterioles,but not with endothelial cell marker CD31.The pulmonary arterysystolic pressure(PASP)increases,the pulmonary artery acceleration time(PAAT)shortens,the distal pulmonary arteriolewall shows concentric thickening,and the lumen is almost blocked.The expression of TUFM,benzyl chloride 1 recombinantprotein(BECN1),human microtubule associated protein light chain 3(LC3)II/I,and B lymphocyte tumor 2(Bcl2)proteins increases,while the expression of P62,Bcl2 related X protein(Bax),and apoptosis activating factor(Apaf)proteins decreases(P0.05).Compared with the PAH group,the OE group showed an increase in PASP,a decrease in PAAT,an increase in?pulmonary artery wall thickness,an increase in pulmonary artery TUFM,BECN1,LC3II/I,and Bcl2 expression,and a decrease in P62,Bax,and Apaf expression(P 0.05).Compared with the PAH group,the Sh group showed a decrease in?PASP,an increase in PAAT,an improvement in pulmonary artery wall thickness and luminal stenosis,a decrease in TUFM,BECN1,LC3II/I,and Bcl2 expression,and an increase in P62,Bax,and Apaf expression(P0.05).Compared with the Norm?group,the Hyp group showed an increase in TUFM protein expression in PASMC cells.Compared with the SiNC groupcells,the SiRNA1 and SiRNA2 groups showed increased expression of P62 and Bax proteins,decreased expression ofBECN1,LC3II/I,Bcl2,and TUFM,intact mitochondrial structure,decreased proliferation activity of PASMC cells,decreasedexpression of pAMPK,and increased expression of pmTOR(P0.05).Compared with the OENC group,the expression ofP62 and Bax proteins was reduced in the OE group,while the expression of BECN1,LC3II/I,Bcl2,and TUFM was increased.Some mitochondria were damaged and collapsed,and cristae rupture disappeared.The proliferation activity of PASMC cellswas significantly increased,and the expression of pAMPK was increased and pmTOR was decreased in cells(P 0.05).?Silencing TUFM can promote mitochondrial autophagy and accelerate apoptosis of PAH pulmonary arterysmooth muscle cells by activating the AMPK/mTOR signaling pathway.【】Pulmonary arterial hypertension;Mitochondrial translation elongation factor Tu;Smooth muscle cells;Mitochondrial autophagy;AMPK/mTOR pathway;Rats肺 动 脉 高 压()是一种恶性心血管疾病以肺血管床阻塞性重构和进行性阻力增加为特征最终导致右心功能障碍 目前针对 发病机制的研究主要集中在肺血管平滑肌细胞但由于其调控通路中信号分子的复杂性其机制仍不清楚 最近的研究证实线粒体通过感知缺氧、氧化应激和凋亡在 发病中发挥重要作用提示线粒体代谢可能是 的关键调节因素线粒体自噬作为线粒体质量控制的必要手段可选择性地清除受损线粒体碎片防止线粒体和细胞功能障碍 报道称线粒体自噬的激活导致肺动脉平滑肌细胞过度增殖增加肺血管阻力但其调控 的确切分子机制尚未可知 线粒体翻译延伸因子()部分位于线粒体外膜上与蛋白质翻译延伸合成、氧化磷酸化和蛋白质控有关 其表达异常可通过引起线粒体呼吸链失衡和/或促进电子泄露导致活性氧产生影响细胞稳态 最近的 模型大鼠线粒体蛋白质组分析鉴定了 的差异表达 但关于 在 进展中的生物学作用知之甚少 因此本研究旨在揭示 对 发生发展的影响并探讨其可能的调控机制报道如下 材料与方法.材料与动物.实验动物:只健康雄性 大鼠(周龄)由北京华阜康生物科技股份有限公司提供许可证号:(京)所有大鼠均饲养于辽宁省人民医院动物实验中心标准疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .饲养条件自由饮食适应 周后进行实验.试剂耗材:大鼠肺动脉平滑肌细胞()购自北京中科质检生物技术有限公司野百合碱(货号 美国)蛋白定量检测试剂盒(货号:武汉博士德公司)苏木素伊红()染色试剂盒(货号:北京索莱宝公司)、相关 蛋白()抗体(货号:、美国 公司)平滑肌肌动蛋白()抗体(货号:美国 公司)人微管相关蛋白轻链()、苄氯素 重组蛋白()、凋亡酶激活因子()、肌动蛋白()抗体(货号:、美国 公司)淋巴细胞瘤()抗体(货号:美国 公司)磷酸腺苷活化蛋白激酶()、磷酸化()、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白()、抗体(货号:、)细胞计数()检测试剂盒(货号:美国 公司).主要实验仪器:脉冲多普勒仪(公司)透射电子显微镜(日本 公司)多功能酶标仪(美国 公司)化学发光凝胶成像分析系统(美国 公司)高速冷冻离心机(美国赛默飞公司)倒置式生物显微镜(日本 公司).实验方法 年 月 年 月于辽宁省人民医院中心实验室进行实验.实验动物模型构建及分组:将 只大鼠随机分成 组:空白对照()组模型()组 过表达()组 阴性对照()组短发夹()敲除()组和 阴性对照()组每组 只 组仅给予等量生理盐水其余 组根据文献将溶解于./盐酸(.)溶液的 (/)一次性腹腔注射诱导肺源性心脏病大鼠模型 基于美国国家生物技术信息中心相关序列(.)选择具有平滑肌()基因的血清型腺相关病毒()作为平滑肌特异性启动子 对于 和 组在给予 的同时将 含有/滴度的敲低或过表达的 分别注射到大鼠尾静脉中 组和 组使用等体积的相应空溶剂作为阴性对照周后进行后续实验 序列如下:上游和下游和:上游下游.细胞模型制备及分组处理:聚集至 时更换为无血清改良 培养基置于培养箱内饥饿处理 更换常规培养基随机分为常氧()组、低氧()组、小干扰()组、组、组、组和 组 组和 组分别置于常氧()和低氧()培养箱中培养 组、组、组、组和 组细胞分别转染携带、组、和 质粒孵育 后放入低氧培养箱中培养 序列如下:上游和下游:上游和下游:上游下游:.血流动力学测定和组织收集:各组大鼠使用.戊巴比妥钠(/)麻醉并固定在工作台上 脉冲多普勒检测肺动脉多普勒信号并测量肺动脉加速时间()每次测量重复 次计算平均值 使用颈静脉右心导管插管直接检测血流动力学数据:经颈行正中切口钝性分离右颈外静脉将 聚乙烯导管插入主肺动脉参照文献方法测量肺动脉压力 用生理盐水冲洗右肺和右心组织以清除血液液氮冷冻 保存 左肺用 多聚甲醛固定石蜡切片行组织学检查.大鼠肺小动脉形态学检测:根据 染色试剂盒说明书石蜡切片行 染色光学显微镜下观察肺内小动脉病理情况 在低倍视野下随机选取外径()的血管分析血管内径肥大情况测量 和中膜厚度()并按照文献根据 百分比(/)计算动脉重塑.免疫荧光共染色检测 定位:石蜡切片用过氧化氢处理后 牛血清白蛋白封闭然后分别与、或 单克隆抗体在 下孵育过夜 洗涤未结合的一抗后滴加异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠、标记的羊抗兔 二抗在 下孵育 用磷酸盐缓冲液()代替一抗作为阴性对照 二氨基联苯胺()显色苏木精复染并封片荧光显微镜下观察拍照记录.蛋白免疫印迹法()检测、自噬、凋亡和/相关蛋白表达:将收集的肺疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .组织和 细胞加入含有苯甲磺酰氟和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液冰上裂解 二喹啉甲酸法测定蛋白浓度等量的蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜后将聚偏二氟乙烯膜用脱脂牛奶封闭 分别加入、(抗体稀释倍数 )和()孵育过夜 次日将膜与含有辣根过氧化物酶的二抗在室温下孵育 洗涤后使用增强化学发光法对条带显影以 作为内参 软件进行灰度值测定分析.法检测细胞增殖活力:根据说明书使用 试剂盒检测细胞活力 用上述不同条件处理细胞然后胰蛋白酶消化并均匀接种到 孔板中 每孔加入 混合液 下孵育 分别在、和 利用酶标仪测量 处吸光度.透射电镜检测细胞线粒体结构:将 细胞按照上述方式处理 后戊二醛固定用 洗涤 次 然后用 锇酸处理再次用 冲洗并用丙醇脱水 将细胞包埋在环氧树脂和 醋酸铀饱和乙醇溶液中 通过透射电子显微镜观察不同处理组的线粒体结构和自噬小体.统计学分析利用 .软件进行统计学分析使用 .软件绘图 正态分布的计量资料采用 表示两两比较采用独立样本 检验 组间比较采用单因素方差分析 .为差异具有统计学意义 结 果.模型大鼠肺动脉 表达水平及定位 结果显示与 组比较 组大鼠肺动脉 蛋白表达显著升高(.图、)荧光共染结果显示绿色荧光标记的 与红色荧光标记的 标志物 在肺小动脉内膜重合为黄色荧光存在共定位而 与内皮细胞标志物 未见明显重合和共定位(图).对 大鼠血流动力学的影响与 组比较 组肺动脉收缩压()升高 缩短(.)与 组比较 组 显著升高 明显缩短(.)与 组比较 组 降低 延长(.)见图.对 大鼠肺动脉重构的影响 染色结果显示与 组比较 组大鼠远端肺小动脉管壁呈向心性增厚管腔狭窄几乎堵塞 百分比显著升高(.)与 组比较 组肺小动脉管壁厚度和管腔狭窄度有所改善 组肺小动脉管壁厚度明显高于 组(.)见图 注:.检测 大鼠肺动脉 蛋白表达.灰度值统计图.免疫荧光检测 定位().目的蛋白.线粒体翻译延伸因子.二脒基苯基吲哚.合并 与 组比较.图 模型大鼠肺动脉 表达水平及定位.疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .对 大鼠线粒体自噬和细胞凋亡相关蛋白表达的影响 结果显示与 组比较 组大鼠肺动脉、/和 蛋白表达升高、和 蛋白表达降低(.)与 组比较 组肺动脉、/和 表达显著升高、和 表达明显降低(.)组、/和 表达降低、和 表达升高(.)见图.缺氧对 细胞 蛋白表达的影响 与注:.颈静脉右心导管插管检测.脉冲多普勒超声检测 与 组比较.与 组比较.图 对 大鼠血流动力学的影响.注:与 组比较.与 组比较.图 各组大鼠肺小动脉病理结构比较(染色).()注:与 组比较.与 组比较.图 检测各组大鼠线粒体自噬和细胞凋亡相关蛋白表达.疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .组比较 组细胞缺氧刺激可上调 表达(.)见图.缺氧对 细胞线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的影响与 组比较 和 组细胞 和 蛋白表达升高、/、和 表达降低(.)与 组比较 组细胞 和 蛋白表达降低、/、和 表达升高(.)见图.缺氧对 细胞线粒体结构的影响 透射电镜发现 组和 组在缺氧条件下线粒体轻微肿胀但膜仍完整部分损伤的线粒体嵴减少损伤线粒体包裹在自噬体中 和 组细胞线粒体结构完整嵴存在膜完整仅有少量自噬溶酶体 组可见部分线粒体损伤崩解嵴断裂消失以及一些含有受损线粒体片段的自噬小体见图 注:.图 检测缺氧对 细胞 蛋白表达的影响.对缺氧诱导 细胞增殖活性的影响 法检测结果显示 与 组比较注:.图 检测缺氧对 细胞线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达的影响.图 透射电镜检测缺氧对 细胞线粒体结构的影响(箭头代表自噬小体).()疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .和 组细胞增殖活性显著降低(.)与 组比较 组细胞增殖活性明显升高(.)见图 注:与 组比较.与 组比较.图 法检测缺氧对 细胞增殖活性的影响.对缺氧诱导 细胞/通路相关蛋白表达的影响与 组比较和 组细胞 表达降低 表达升高(.)与 组比较 组细胞 表达升高 表达降低(.)见图 讨 论 是一种进行性致死疾病以肺小动脉重塑导致肺动脉阻力增加为特征最终发展为右心功能障碍或右心衰竭 发病机制复杂涉及遗传、缺氧、氧化应激、糖代谢失衡等多方面因素其病理主要包括 过度增殖和/或抑制凋亡以及胶原和弹性蛋白等细胞外基质的积累 但由于其分子机制不完全清楚临床缺乏有效治疗药物预后仍然较差 因此迫切需要探索能有效抑制 增殖并改善肺动脉重塑的靶向药物和内在机制 线粒体作为细胞稳态的中心监护者协调多种细胞生物过程如细胞周期进程、线粒体动力学和细胞代谢等与 的发病机制和病理过程密切相关 是线粒体 翻译表达的重要因子在线粒体功能调控中起关键作用 既往研究显示 可控制线粒体 编码肽的氨基酸延伸并且其水平的变化能够影响多种细胞生物活性 最近的 肺动脉蛋白质组学研究发现 与正常个体之间存在 差异表达 因此结合 的发病机制以及 与线粒体功能的关系推测 可能参与 的发生发展 本研究在 诱导 大鼠模型中发现与空白对照组相比 大鼠和细胞模型中 表达明显增加且主要定位于肺小动脉中膜平滑肌细胞而不聚集于内层内皮细胞与 主要病变细胞相一致 这提示低氧诱导的 发生发展注:.图 检测 对缺氧诱导 细胞/通路相关蛋白表达的影响./疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .过程中 可能起到一定程度的作用但其中机制尚不明确 为了探索 是否参与 的发展及其在病理过程中的作用本研究引入 敲低或过表达质粒的 腺相关病毒构建 处理的 沉默或过表达大鼠模型 周后 的缺失抑制了 的发展改善 小鼠血流动力学情况和肺小动脉血管重构而过表达 则加重 病理结构损伤 此外与自噬呈负相关的自噬底物 在 组中的表达水平高于 组表明在无 的情况下肺动脉线粒体自噬减少 自噬产物/和 水平降低也显示了 组线粒体自噬减少 据报道 的发生与 的自噬激活、过度增殖和凋亡抵抗密切相关存在自噬/凋亡互反馈调节机制逆转自噬/凋亡失衡可有效改善血管重构从而降低肺动脉压 研究发现/在调控自噬/凋亡平衡中发挥关键调控作用 另外本研究发现 沉默促进 细胞增殖的同时引起抗凋亡基因 表达下调而凋亡促进因子 和 表达上调反之亦然 因此 的缺失减轻了体内 的发展这可能归因于线粒体自噬和凋亡调节 为了探讨 基因沉默抑制线粒体自噬和增殖/凋亡的分子机制笔者重点研究了已知的信号分子 和 来阐明可能的途径 据报道和 通过调控自噬激活激酶()调节自噬 等报道 双酚 可通过激活/信号通路激活促进卵巢颗粒细胞自噬 等发现红景天苷通过/通路上调细胞自噬减轻低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡抵抗 本研究结果发现 和 的总蛋白水平不受 水平的影响但 和 的磷酸化激活受 表达的调节 这说明 和 的活性在一定程度上受 调控此外线粒体自噬标志物、和/均受 和/的调节 既往研究提示 通过磷酸化其 和 位点来刺激而 通过磷酸化 中的不同 残基()来抑制自噬 而且 抑制剂和/或 激活剂预处理内质网应激可扩大自噬的“生存窗口”这些研究表明/通路在线粒体自噬中起枢纽作用并调节线粒体功能和稳态 最近有学者提出/诱导的线粒体自噬增强通过控制一些蛋白的浓缩和溶解来调节编码关键线粒体蛋白的核 而且 是 和 的上游分子这一点通过敲低或过表达的状态得到证实这些结果提示 通过参与线粒体蛋白的合成影响线粒体功能和稳态进而调节整个细胞的功能 本研究也存在一些局限性首先尽管缺氧可以部分模拟 的体内环境但它并不完全代表 诱导 的发病机制 研究需要一种模拟 的良好体外刺激 其次遗憾的是没有使用 或 的干扰剂来进一步证实信号通路 鉴于线粒体功能调控在细胞周期过程中的重要性和复杂性下一步的研究将从线粒体的功能和代谢调控两个方面来探讨 的发生机制 综上所述抑制 可通过激活/信号通路抑制 肺动脉平滑肌细胞线粒体自噬改善 在缺氧条件下的增殖/凋亡失衡这说明 肺动脉平滑肌细胞过度增殖至少部分是由于 被激活促进线粒体自噬而导致的这为改善 肺动脉重塑提供了新的靶点利益冲突:所有作者声明无利益冲突作者贡献声明崔本科:设计研究方案实施研究过程论文撰写王岩:提出研究思路分析实验数据论文审核卢云凤:实施研究过程资料搜集整理杜鹃:进行统计学分析翟羽涵:论文修改参考文献 崔宇菲张磊.肺动脉高压基因遗传突变研究进展.疑难病杂志():.:./.:.:./.():.:././.:.:./.():.:./.():.:./.:.:./.杜阿胖林立建练桂丽等.二甲双胍通过激活自噬改善野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的肺动脉重塑和功能.中华高血压疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .杂志():.:./.孙鹤宁鲁美丽田小雪等.通过诱导内质网应激加速肺动脉高压的内皮细胞凋亡.中国药理学通报():.:./.():.:./.崔志峰孙佳伟刘美洋等.线粒体功能障碍在肺动脉高压形成中的作用机制.实用心脑肺血管病杂志():.:./.():.:./.():.:./.周琴怡龚邵新彭琴等.肺动脉平滑肌细胞:肺动脉高压的关键治疗靶点.中国动脉硬化杂志():.:./.何梦陶克龙张春意等.淫羊藿苷通过 调控自噬凋亡平衡改善低氧性肺动脉高压血管重塑的研究.现代实用医学():.:././.:.:./.():.:./.():.:./.():.:./.(收稿日期:)作者编者读者撰写医学论文主体部分的要求 前言 概述研究的背景、目的、研究思路、理论依据、研究方法、预期结果和意义等 仅需提供与研究主题紧密相关的参考文献切忌写成文献综述 一般以 个汉字为宜占全文字数的 左右 资(材)料与方法 实验研究论文常写成“材料与方法”临床研究论文常写成“资料与方法”.研究对象:研究对象为人需注明时间、地点、分组方法、一般情况、选择标准与排除标准等并说明经所在单位伦理委员会批准研究对象知情同意 研究对象为实验动物需注明动物的名称、种系、雌雄、年龄、饲养条件、健康状况及合格证号等.药品、试剂及仪器、设备:药品及化学试剂使用通用名称并注明剂量、单位、纯度、批号、生产单位及给药途径 仪器、设备应注明名称、型号、规格、生产单位、精密度或误差范围无须描述工作原理.观察指标与方法:选用相应观察指标详述新创的方法及改良方法的改进之处以备他人重复 采用他人方法以引用参考文献的方式给出即可 统计学方法 说明所使用的统计学软件及版本明确资料的表达及统计学方法的选择 用 表达服从或近似服从正态分布的计量资料 可采用 检验、方差分析用()表达呈偏态分布的计量资料或生存时间资料 可采用秩和检验若考虑协变量的影响可采用协方差分析用频数或率()表达计数资料或等级资料可采用卡方检验或秩和检验 结果 是指与设计的观察指标相对应的实(试)验所得数据、观察记录经过综合分析和统计学处理的结果而不是原始数据更不是原始记录 按逻辑顺序在正文的文字、表格和图中描述所获得的结果 结果的叙述应实事求是简洁明了数据准确层次清楚逻辑严谨 以数据反映结果时应注意不能只描述导数(如百分数)还应同时给出据以计算导数的绝对数 一般应对所得数据进行统计学处理并给出具体的统计检验值如:.讨论 是对研究结果的科学解释与评价是研究所形成的科学理论不必重述结果部分具体数据或资料 着重讨论研究结果的创新之处及从中导出的结论包括理论意义、实际应用价值、局限性及其对进一步研究的启示 应将本研究结果与其他有关的研究相比较并将本研究结论与目的联系起来讨论同时列出相关参考文献疑难病杂志 年 月第 卷第 期 .