m6A修饰相关的长链非编码RNA对肾透明细胞癌预后和免疫治疗的研究 (1).pdf

基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(222102310651);河南省卫健委国家中医临床研究基地科研专项(2022JDZX142)作者单位:450002郑州,河南省中医院泌尿外科(白洋洋、陈瑞廷、孙继建);450014郑州大学第二附属医院妇产科(郭依琳)通信作者:白洋洋,电子信箱:yangyangbai2010 m6A 修饰相关的长链非编码 RNA对肾透明细胞癌预后和免疫治疗的研究白洋洋郭依琳陈瑞廷孙继建摘要目的探究与 N6-甲基腺嘌呤(m6A)相关的长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)对肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,ccRCC)预后和免疫治疗的特征。方法通过 TCGA 数据库下载 532 例 ccRCC 患者组织和 72 例正常肾组织的转录组数据和临床特征数据,利用共表达和单因素 COX 回归分析筛选与预后和 m6A 相关的 lncRNA。基于预后和 m6A相关的 lncRNA 的表达进行聚类分析,分析两种聚类分型与免疫检查点程序性死亡配体 1(programmed death-ligand 1,PD-L1)和细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)表达的相关性。构建 LASSO COX回归风险预后模型,验证其临床应用价值,利用 ESTIMATE 方法比较 ccRCC 肿瘤微环境的差异,免疫表观评分(immunophe-noscore,IPS)预测 ccRCC 对免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICI)的敏感度。结果通过共表达和单因素 COX 回归分析筛选 出 29 个与 预后 和 m6A 相关 的 lncRNA,大多 数 在 ccRCC 组 织 中 表 达 上 调,而 COL18A1-AS1、AC007066.2 和AC018752.1 则表达下调。通过聚类分析将 532 例 ccRCC 组织样本分为 cluster1 组和 cluster2 组,cluster2 组预后更差,PD-L1 和CTLA4 表达更高。利用 LASSO COX 回归算法确定 8 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA,建立 ccRCC 风险预后模型,该模型在不同临床特征中均有较好的预测价值。依据模型计算风险值将患者分为高风险组和低风险组。高风险组患者预后更差,富含更多免疫细胞成分,对 ICI 治疗更敏感。结论m6A 相关的 lncRNA 对 ccRCC 患者的预后预测和免疫治疗指导具有重要意义。关键词M6ALncRNA肾透明细胞癌预后免疫治疗中图分类号R737.11文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.04.021Analysis of m6A Modification-related Long Non-coding RNA on Prognosis and Immunotherapy of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.BAIYangyang,GUO Yilin,CHEN Ruiting,et al.Department of Urology,Henan Province Hospital of TCM,The Second Affiliated Hospital ofHenan University of Chinese Medicine,Henan 450002,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the prognostic and immunotherapy characteristics of N6-methyladenine(m6A)-related longnon-coding RNA(lncRNA)in renal clear cell carcinoma(ccRCC).MethodsTranscriptome data and clinical characteristic data of532 ccRCC tissues and 72 normal kidney tissues were downloaded from the TCGA database,and lncRNAs related to prognosis and m6Awere screened by co-expression and univariate COX regression analysis.Cluster analysis was performed based on the prognosis and theexpression of m6A-related lncRNA,the correlation between the two clusters and the expression of immune checkpoints programmeddeath-ligand 1(PD-L1)and cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4(CTLA-4)was analyzed.The LASSO COX regressionrisk prognosis model was constructed to verify its clinical application value,and the ESTIMATE method was used to compare the differ-ences in the tumor microenvironment of ccRCC,and the immunophenoscore(IPS)predicted the sensitivity of ccRCC to immune check-point inhibitor(ICI).ResultsTwenty-nine lncRNAs associated with prognosis and m6A were screened by co-expression and univari-ate COX regression analysis,most of which were up-regulated in ccRCC tissues,while COL18A1-AS1,AC007066.2 and AC018752.1 were down-regulated.The 532 ccRCC tissue samples were divided into cluster1group and cluster2group by cluster analysis.The clus-ter2group had worse prognosis and higher expression of PD-L1 and CTLA4.Eight lncRNAs related to prognosis and m6A were identifiedby LASSO COX regression algorithm to establish a ccRCC risk prognostic model,which has good predictive value in different clinical fea-tures.Patients were divided into high-risk group and low-risk group based on risk scores calculated by the risk prognostic model.Pa-tients in the high-risk group had a worse prognosis,more immune cell components,and were more sensitive to ICI treatment.Conclu-sionm6A-related lncRNA is of great significance for the prognosis prediction and immunotherapy guidance in ccRCC patients.Key wordsM6A;LncRNA;Clear cell renal cell carcinoma;Prognosis;Immunotherapy701医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾癌最常见的病理类型,可占到 80%86%1。尽管手术切除是治疗早期 ccRCC 的有效方法,但是针对晚期及合并复发或转移患者的治疗方式仍有限,导致这类患者的预后较差2。因此,探索与ccRCC 发病密切相关的分子机制有望为新肿瘤基因靶向治疗提供策略和理论支持。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladeno.sine,m6A)修饰是真核生物 RNA 最常见的一种表观修饰方式,是位于腺嘌呤第 6 位氮原子上的甲基化修饰,存在于各种不同类型的 RNA 上,包括 mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、微小 RNA(micro RNA,miRNA)、环状 RNA(circular RNA,circRNA)等3。m6A RNA 甲基化修饰由甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化识别蛋白组成,共同参与 ccRCC 的发生、发展4,5。lncRNA 是一种长度超过 200nt 的非编码 RNA分子,可以在表观遗传调控、转录调控和转录后调控等多方面参与人体内多种重要的调控过程6。近年来,lncRNA 被发现异常表达与肿瘤的增殖、转移、凋亡和耐药性相关7。然而 m6A 修饰相关的 lncRNA是否可能参与 ccRCC 的进展仍有待于阐明。本研究通过 TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库下载ccRCC 的转录组数据,利用生物信息学的方法筛选与m6A 相关的 lncRNA,建立风险预后模型,分析预后模型的诊断和预 测价值,探 索 其 对 免 疫 治 疗 的 指 导意义。材料与方法1.数据下载和处理:从 TCGA 数据库下载 541例 ccRCC 患者组织和 72 例正常肾组织的转录组数据和临床特征数据。剔除重复和不完整的数据后,本研究共纳入 532 例 ccRCC 患者组织样本和 72 例正常肾组织样本。通过人类参考基因组及注释文件,区分转录组数据中的 mRNA 和 lncRNA。2.m6A 相关 lncRNA 的筛选:查阅相关文献,选择 26 个 m6A 调 节 因 子(METTL3、METTL5、MET-TL14、METTL16、WTAP、VIRMA、ZC3H13、RBM15、RBM15B、YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPC、FMR1、LRPPRC、HNRNPA2B1、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ELAVL1、RBMX、FTO、ALKBH5、ALKBH3)。在 R 软件中,利用 limma 包进行 m6A 和 lncRNA 共表达分析,鉴定出 190 个与 m6A相关的 lncRNA,筛选条件为相关系数 0.7 或相关系数 -0.7,P 0.7 或 -0.7,P 0.001 的 lncRNA。利用单因素COX 回归分析,进一步筛选出 29 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA,详见图 1A。29 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA 在 ccRCC 组织和正常肾组织中的表达均存在差异(图 1C)。绘制 29 个与预后和 m6A 相关的lncRNA 在 ccRCC 组织和正常肾组织中的热图,发现除 COL18A1-AS1、AC007066.2 和 AC018752.1 以外,lncRNA 在 ccRCC 组织中表达高于正常肾组织(图 1B)。2.m6A 相关 lncRNA 聚类分析结果:对 29 个与801论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4图 1肾透明细胞癌中筛选与预后和 m6A 相关的 lncRNAA.单变量 COX 回归分析;B.m6A 相关 lncRNA 表达的箱线图;C.m6A 相关 lncRNA 表达的热图。P 0.001预后和 m6A 相关的 lncRNA 进行样本聚类分析。选择 k=2 对样本分型,将样本分为 cluster1 组和 clus-ter2 组。绘制两种聚类分型表达热图,发现 cluster1组在 29 个 m6A 相关 lncRNA 中的表达低于 cluster2组(图 2A)。绘制两种聚类分型的 Kaplan-Meier 曲线,发 现 cluster2 组 的 生 存 率 低 于 cluster1 组(图2B)。最后,分析 cluster1 组和 cluster2 组免疫检查点PD-L1 和 CTLA4 的表达情况,结果发现 cluster2 组中 PD-L1 和 CTLA4 表达更高(图 2 中 C 和 D),提示两种 cluster 分型之间可能存在肿瘤免疫微环境的差异。3.风险预后模型的建立:利用 LASSO COX 回归算法确定 8 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA 建立ccRCC 风 险 预 后 模 型。风 险 评 分=1.5531 AL133243.3 表达量+0.1702 AL162586.1 表达量-0.0258 SH3BP5-AS1-0.1494 AL136295.7 表达量-2.0571 COL18A1-AS1 表达量-0.3995 AC018752.1 表达量+0.6396 AL008718.3 表达量+0.1063 AC084018.1 表达量。将 532 例 ccRCC 患者利用 Create Data Partition 函数分为测试集(n=268)和验证集(n=264)。在测试集中,计算每例ccRCC 患者的风险评分,根据风险评分的中位值,将患者分为高风险组和低风险组。绘制高低风险组患者的 Kaplan-Meier 曲线,发现高风险组的患者预后更差(P 0.001,图 3A),5 年总生存率的 AUC 为0.773(图 3B)。在验证集中,高风险组的患者预后也更差(P 0.001,图 3C),5 年总生存率的 AUC 为0.688(图 3D)。4.风险预后模型的验证和临床特征分析:为了进一步评估建立的风险预后模型的应用价值,笔者首先901医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著图 2肾透明细胞癌中两种 m6A 相关 lncRNA 聚类分型A.cluster1 和 cluster2 的表达热图;B.cluster1 和 cluster2 的生存曲线;C.PD-L1 在 cluster1 和 cluster2 中的表达;D.CTLA-4 在 cluster1 和 cluster2 中的表达图 3肾透明细胞癌风险预后模型建立A.训练集中高危组和低危组的生存曲线;B.训练集中的 5 年总生存 ROC 曲线;C.验证集中高危组和低危组的生存曲线;D.验证集中的 5 年总生存期 ROC 曲线011论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4分别在测试集和验证集中,对 ccRCC 患者的临床病理特征和风险评分进行单因素和多因素分析,单因素COX 分析结果发现,年龄、组织分级、临床分期、T、M和风险评分是 ccRCC 患者预后的独立因素(图 4A),多因素 COX 分析结果发现年龄、组织分级、临床分期和风险评分是 ccRCC 患者预后的独立因素(图 4B)。这些结果表明笔者建立的风险预后模型可以用于评估 ccRCC 的预后评价指标。图 4风险预后模型的临床应用价值A.风险评分的单因素分析;B.风险评分的多因素分析;C.风险评分和临床特征的热图。P 50 岁和50 岁)、性别、组织分级(G1 G2和 G3 G4)、临床分期(期和 期)、T(T1 2和 T3 4)和 M(M0和 M1)亚组中,高风险的患者生存率均低于低风险患者,预后更差,提示该风险预后模型在不同的临床特征中均有较好的预测价值。5.风险预后模型的免疫浸润和免疫治疗分析:利用 ESTIMATE 方法评估高风险组和低风险组每个样本中 Immune 分数、Stromal 分数和 Estimate 分数,即免疫组分、基质组分和总组分,结果发现高风险组的Immune 分数和 Estimate 分数均高于低风险组,而肿瘤纯度高风险组低于低风险组(P 0.05,图 5),表明高风险组富含免疫细胞成分。111医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著图 5风险预后模型的免疫浸润情况A.高低风险中的 Immune 分数;B.高低风险中的 Stromal 分数;C.高低风险中的 Estimate 分数;D.高低风险中的肿瘤纯度 6.免疫治疗敏感度分析:从 TCIA 数据库中下载所有 ccRCC 样本的 IPS 评分,比较高风险组和低风险组间 IPS 的差异。结果发现高风险组在 PD-1+CTLA-4+和 PD-1-CTLA-4+两亚组中 IPS 评分要高于低风 险组,而对于 PD-1-CTLA-4-和PD-1+CTLA-4-两亚组高风险和低风险之间 IPS评分差异无统计学意义(图 6),这提示高风险患者可能对针对 PD-1 和 CTLA-4 或 CTLA-4 靶点的图 6风险预后模型的免疫浸润情况A.风险预后模型中 PD-1+CTLA-4+的 IPS 评分;B.风险预后模型中 PD-1-CTLA-4+的 IPS 评分;C.风险预后模型中 PD-1+CTLA-4-的 IPS 评分;D.风险预后模型中 PD-1-CTLA-4-的 IPS 评分211论著J Med Res,April 2024,Vol.53 No.4免疫治疗疗效 更好,对免 疫 治 疗 的 选 择 具 有 指 导意义。讨论肾细胞癌是起源于肾小管上皮的泌尿系统恶性肿瘤,占全部肾癌的 90%,具有超过 10 种亚型,包括ccRCC、肾乳头状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾集合管细胞癌等8。ccRCC 是肾细胞癌的常见分型,早期诊断较困难,且对放化疗不敏感,晚期患者多采用靶向和免疫治疗9。然而,由于 ccRCC 肿瘤存在异质性,患者治疗过程中常出现耐药情况,治疗效果不佳10。因此,探究 ccRCC 发生、发展的分子机制对患者的预后预测和免疫治疗选择具有重要临床意义。m6A 修饰是近几年肿瘤研究领域的热点,大量研究结果表明,m6A 修饰与多种肿瘤的发生、发展密切相关11。随着 lncRNA 功能研究不断 更新,有研究 发现,ln-cRNA 也存在 m6A 修饰位点,可能影响肿瘤的增殖和转移12。本研究从 TCGA 数据库下载 ccRCC 患者的转录组测序和临床病理数据,利用生物信息学方法分析了与 m6A 相关 lncRNA 对 ccRCC 预后的影响,构建 LASSO COX 回归风险预后模型并验证,进一步探究预后模型对 ccRCC 免疫浸润和免疫治疗敏感度的应用价值,以期对 ccRCC 的预后和治疗提供指 导意义。本研究首先通过共表达分析筛选出 190 个与m6A 相关的 lncRNA,然后计划一步筛选出 29 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA,初步分析了 29 个 lncRNA在 ccRCC 中的表达模式和预后价值。29 个 m6A 相关的 lncRNA 在 ccRCC 和正常组织中表达均具有显著差 异,绝 大 多 数 在 ccRCC 组 织 中 高 表 达,而COL18A1-AS1、AC007066.2 和 AC018752.1 则在正常组织中高表达。查阅国内外文献,有研究证实了COL18A1-AS1 在 ccRCC 组 织 中 下 调,高 表 达COL18A1-AS1 的患者预后较好,而 AC007066.2 和AC018752.1 未见相关文献报道13。ccRCC 是一种免疫原性很强的肿瘤,可从免疫治疗中获益14。目前已被批准用于晚期 ccRCC 的免疫疗法包括细胞因子和免疫检查点抑制剂(immunecheckpoint inhibitors,ICIs)15。ICIs 的治疗效果与肿瘤免疫微环境的组分密切相关。与其他类型的肿瘤不同,ccRCC 的肿瘤免疫微环境具有免疫细胞高度浸润的特征16。本研究通过聚类分析,在 ccRCC 中确定了两种聚类分型,即 cluser1 和 cluster2。进一步分析发现,cluster2 组比 cluster1 组有更差的生存,但cluster2 组中 PD-L1 和 CTLA4 表达更高,提示两种cluster 分型之间可能存在肿瘤免疫微环境的差异。笔者应用 LASSO 回归分析,通过 AL133243.3、AL162586.1、SH3BP5-AS1、AL136295.7、COL18A1-AS1、AC018752.1、AL008718.3 和 AC084018.1 共 8个 lncRNA 建立风险预后模型,并通过单因素和多因素 COX 回归验证该模型是 ccRCC 患者的独立预后因素,具有较好的预后价值。同时,笔者对风险预后模型进行临床特征分层分析,结果发现风险评分在组织分级、临床分期、T、M 和 cluster 分组之间存在差异,表明该风险预后模型在不同的临床特征中均有较好的预测价值。查阅国内外文献,Liu 等14在 ccRCC中揭示了 COL18A1-AS1/miR-1286/KLF12 信号通路对 ccRCC 脂质异常代谢的作用机制。Chen 等17在膀胱癌中发现,AL162586.1 与铁死亡相关,并利用包括 AL162586.1 在内的 9 个 lncRNA 建立了风险预后模型,对膀胱癌患者的预后预测、免疫治疗和化疗药物 敏 感 度 提 供 依 据。另 外,有 研 究 分 别 发 现SH3BP5-AS1 和 AL136295.7 对乳腺癌的预后和坏死性凋亡相关18,19。为了进一步探究建立的风险预后模型对 ccRCC患者免疫治疗的价值,笔者首先分析了高低风险两组中 Immune 分数、Stromal 分数、Estimate 分数和肿瘤纯度的差别,结果发现高风险组 Immune 分数和 Esti-mate 分数更好,但肿瘤纯度更低,提示高风险组患者肿瘤微环境中富含免疫细胞成分。接下来,笔者比较IPS 评分高风险组和低风险组间 IPS 的差异,发现高风险组可能对针对 PD-1 和 CTLA-4 或 CTLA-4靶点的免疫治疗疗效更好,对免疫治疗的选择具有指导意义。目前,针对 ccRCC 也开展了多项免疫治疗相关的药物临床试验。CheckMate 214 试验评估了纳武单抗(PD-1 抗体抑制剂)联合伊匹单抗(CTLA-4 抗体抑制剂)对比标准一线疗法舒尼替尼对晚期肾细胞癌的疗效和安全性,结果发现在中高危肾细胞癌中,纳武单抗联合伊匹单抗组客观缓解率明显高于舒尼替尼组(42.1%和 26.3%),目前已被用于中高危肾细胞癌患者的一线治疗。综上所述,本研究从 TCGA 数据库下载 ccRCC患者的转录组测序和临床病理数据,利用生物信息学方法筛选了 29 个与预后和 m6A 相关的 lncRNA,确定了两种聚类分型,建立了风险预后模型并验证,探讨该模型对 ccRCC 免疫浸润和免疫治疗的应用价值,为指导免疫治疗策略提供依据。311医学研究杂志 2024 年 4 月第 53 卷第 4 期论著利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1 Randall JM,Millard F,Kurzrock R.Molecular 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