补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响.pdf

中医康复2024年2月 第1卷 第2期Traditional Chinese Medicine Rehabilitation,Feb.2024,Vol.1,No.02补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及及NestinNestin、GFAPGFAP蛋白表达的影响蛋白表达的影响*刘通1,2，廖翔宇1，陈玉宁1，蒋颖1，陈琼君1，熊亮1，邝伟川1,2，文希1,2，刘悦1,2（1.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510095；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东 广州 510095）摘摘要要 目的目的：观察补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillaryacidic protein,GFAP）表达的影响。方法方法：将40只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补气活血合剂组及补气活血合剂+外泌体抑制剂GW4869组（后简称合剂+GW4869组）各10只，模型组、补气活血合剂组及合剂+GW4869组均采用大脑中动脉线栓法复制大鼠大脑中动脉梗塞模型，假手术组仅给予颈内动脉、颈外动脉及颈总动脉的解剖分离而不进行线栓插入，缺血2h后拔除线栓进行再灌注；补气活血合剂及合剂+GW4869组分别在再灌注2h后开始灌胃补气活血合剂（10mL/kg，3次/日），合剂+GW4869组在每次灌胃前给予外泌体抑制剂GW4869腹腔注射（2.5mg/kgd），假手术组及模型组给予灌胃等量生理盐水，四组均连续干预7天。7天后，分别记录各组大鼠干预前后的神经功能缺损评分，TTC染色法计算干预后各组大鼠脑梗死体积，HE染色法评估各组大鼠神经组织形态学变化，Western Blot法检测大鼠梗死区组织Nestin、GFAP蛋白及血清外泌体CD63蛋白的表达水平。结果结果：干预7天后，假手术组未表现出神经功能缺损症状，模型组神经功能缺损评分显著升高（P0.01），补气活血合剂组神经功能缺损评分较模型组显著降低（P0.05），应用GW4869后，神经功能缺损评分较补气活血合剂组显著升高（P0.01）。TTC染色结果显示：假手术组大鼠脑组织成正常红色，未见肉眼苍白梗死灶，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组均可见右侧大脑苍白梗死灶；与假手术组相比，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P0.01）；与模型组相比，补气活血合剂组的大鼠脑梗死体积比显著降低（P0.05）；与补气活血合剂组相比，合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P0.01）。HE结果显示：假手术组染色均匀，组织完整，神经细胞形状为圆锥状，排列整齐，核大居中，有明显的核仁；模型组脑皮层神经细胞排列不规则，神经元明显肿胀，核仁不明显，出现核固缩、细胞间隙存在不同大小的空泡样改变，出现间质水肿；与模型组相比，补气活血合剂组、合剂+GW4869组神经元坏死减少、组织水肿的形态表现较轻；与合剂+GW4869组相比，补气活血合剂组坏死神经元和脑组织水肿等病理损伤较轻。Western Blot结果显示：与假手术组相比，模型组GFAP、CD63表达显著降低（P0.05）；与模型组相比，补气活血合剂组GFAP、CD63表达显著升高（P0.05）；加用GW4869后，补气活血合剂组GFAP、CD63表达显著下降（P0.05）。结论结论：补气活血合剂可缩小脑梗死体积，提高脑梗死组织中GFAP蛋白的表达，改善大鼠缺血再灌注后神经功能缺损程度，该作用可能与促进外泌体分泌有关。关键词关键词 补气活血合剂；缺血再灌注；神经功能缺损；外泌体；Nestin；GFAP；CD63 中图分类号中图分类号 R R285285.5 5 文献标识码文献标识码 B B 文章编号文章编号 20972097-31283128(20242024)0202-00080008-0606DOIDOI：1010.1978719787/j/j.issnissn.20972097-31283128.20242024.0202.002002Effects of Buqihuoxue Compounds on Serum Exosomes and the Expression ofEffects of Buqihuoxue Compounds on Serum Exosomes and the Expression ofNestin and GFAP Proteins in Rats with Cerebral Ischemia/Reperfusion ModelNestin and GFAP Proteins in Rats with Cerebral Ischemia/Reperfusion ModelLIU Tong1,2,LIAO Xiang-yu1,CHEN Yu-ning1,JIANG Ying1,CHEN Qiong-jun1,XIONG Liang1,KUANG Wei-chuan1,2,WEN Xi1,2,LIU Yue1,2(1.The Fifth Clinical Medical School of Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong 510095;2.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital(Guangdong Research Institute of Traditional Chinese Medicine Manuracturing Technology),Guangzhou,Guangdong 510095)AbstractObjectiveAbstractObjective:To observe the effect of Buqihuoxue compounds on serum exosomes and the expression of Nestin and GFAP Proteins in ratswith cerebral ischemia/reperfusion model.MethodsMethods:40 male SD rats were randomly divided into the sham operation group,model group,Buqihuoxue compounds group and Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group,with 10 rats in each group.In the model group,the Buqihuoxue compounds group and the Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group,the rat model of middle cerebral artery occlusion was madeby suturing of the middle cerebral artery,while rats in the sham operation group was just given the dissection and isolation of the internal carotid artery,external carotid artery and common carotid artery.After 2 hours of cerebral ischemia,the middle artery suture was removed for reperfusion.Ratsin Buqihuoxue compounds group and Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group were given Buqihuoxue compounds after 2 hours ofreperfusion(10mL/kg,3 times/day),the exosome inhibitor GW4869 was given intraperitoneally before each gavage in the Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group(2.5mg/kgd).The sham operation group and the model group were given an equal amount of saline by gavage,andall four groups were intervened for 7 consecutive days.The neurological deficit scores of the rats in each group were recorded before and after the in*基金项目基金项目：广东省中医药局专项研究项目，编号：20203001；国家自然科学基金，编号：82174482；广东省自然科学基金，编号：2022A1515011676作者简介作者简介：刘通（1987-），男，博士，副主任中医师、博士研究生导师，研究方向：脊柱术后康复、脑卒中的临床及机制研究。通讯作者通讯作者：刘悦（1968-），男，硕士，主任中医师、博士研究生导师，研究方向：神经康复。8第2期刘通 等 补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响tervention,respectively;HE staining method was used to assess the morphology changes of the neurological tissues;the volume of cerebral infarctionwas calculated by TTC staining method;Western Blot were used to detect the expression of Nestin,GFAP in the infarcted brain tissue and CD63 inthe serum.ResultsResults:After 7d of intervention,the sham operation group did not show symptoms of neurological deficits,the neurological deficits scoreof the model group was significantly higher(P0.01),the neurological deficits score of the Buqihuoxue compounds group was significantly lowerthan that of the model group(P0.05),and the score was significantly higher after the application of GW4869(P0.01);TTC staining showed thatthe brain tissue in the sham operation group was normal red,and no pale infarct foci were seen,while pale infarct foci were seen on the right side ofthe brain in the model group,Buqihuoxue compounds group and Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group;the infarct volume of themodel group,the Buqihuoxue compounds group and Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group was significantly increased comparedwith that of the sham operation group(P0.01);and the volume in Buqihuoxue compounds group was significantly lower than that in the modelgroup(P0.05).Compared with the Buqihuoxue compounds group,the volume in the Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group was significantly higher(P0.01);HE showed that the sham operation group was uniformly stained,tissue intacted,and the neuronal cells were neatly arranged with conical shape,the nucleus was large in the middle with a pronounced nucleoli.In the model group,the brain nerve cells irregularly arranged,neurons obviously swollen,the nuclei consolidation.Vacuole-like changes of different size existed in the cell space,combined with interstitial edema.Compared with the model group,neuronal necrosis reduction and tissue edema were milder in the Buqihuoxue compounds and Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group.Compared with the Buqihuoxue compounds+exosome inhibitor group,the neuronal necrosis reduction and tissue edema was milder in the Buqihuoxue compounds group;Western Blot showed that the expression of GFAP and CD63 was significantly lower in the model group compared with the sham operation group(P0.05),while the expression in Buqihuoxue compounds group were siginificantly improved(P0.05).ConclusionConclusion:Buqihuoxue compounds can reduce the volume of cerebral infarction,increase the expression of GFAP proteins in cerebral infarcted tissues,andimprove the degree of neurological deficits after ischemia/reperfusion in rats,which may be related to the promotion of exosome secretion.KeywordsKeywordsBuqihuoxue compounds;ischemia-reperfusion;neurologic deficits;exosomes;Nestin;GFAP;CD63脑卒中严重危害人类健康和生命安全，其发病率高、病死率高、致残率高、复发率高。2019年，发表于柳叶刀子刊 Lancet Neurology 的一项研究对1990年至2019年的204个国家和地区进行了调查，调查结果显示：全球有1220万中风发病病例，1.01亿中风患病病例，1.43亿伤残调整寿命年中风病例，以及655万中风死亡病例。该结果表明：中风仍是世界第二大致死原因、第三大致残原因（按伤残调整生命年衡量）1。在我国，缺血性脑卒中在所有脑卒中患者中所占比例可高达85%，缺血性脑卒中幸存者中约有3/4的患者遗留有不同程度的劳动能力丧失，给社会、家庭带来极大的负担2-3。因此，进一步探讨如何促进脑卒中后肢体功能障碍的康复仍是全球亟待解决的问题。补气活血合剂（原名：中风复元合剂）是我院院内制剂，对治疗气虚痰瘀型缺血性脑卒中有显著的临床疗效4-5，然而其具体起效机制仍不明确。近期，有多项研究表明小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经干细胞等多种中枢神经系统细胞均能分泌外泌体，并调节神经系统疾病的发生和发展，这些中枢神经系统细胞衍生的外泌体在促进血管生成、调节炎症和中风后大脑重塑方面发挥着关键作用6-7。巢蛋白（Nestin）是神经干细胞的特征性标志物，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidicprotein,GFAP）是星形胶质细胞活化的标志物，卒中后神经细胞的再生多伴随有Nestin和GFAP的表达升高8-9。因此，本研究拟观察补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响，进一步明确其起效机制，促进补气活血合剂的进一步推广应用。1 1材料与方法材料与方法1.1 实验动物与分组选取40只成年雄性SPF级SD大鼠（广东省动物 实 验 中 心 提 供，合 格 证 号：SCXKC(粤)2022-0002），体重20020g。于广东省第二中医院动物实验中心分笼饲养，5只/笼，温度25左右，相对湿度50%60%，明暗周期12h，自由饮水、摄食，适应性饲养7天后将大鼠随机分为假手术组、模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869 组各 10 只。按科技部2006年发布的 关于善待实验动物的指导性意见处理实验动物，本研究经广东省第二中医院实验动物伦理委员会批准，批号：048604。1.2 主要仪器与试剂大鼠硅胶线栓（佳灵生物，广州）；动物用异氟烷（瑞普生物，天津）；氯化三苯基四唑（TTC）染色液（G3004，Solarbio）；戊二醛固定液（雷根生物，北京）；苏木素染液（上海生工生物工程，上海），伊红染液（索莱宝生物，北京）；Enhanced BCA ProteinAssay Kit测定试剂盒（P0009，Beyotime，China）；缓冲液（ES-8152，ECOTOP，China）；ECL Western Blotting Substrate（EX500B，ECOTOP，China）；Nestin、GFAP、CD63、GAPDH一抗（Abcam）。1.3 模型制备大脑中动脉闭塞（Middle Cerebral Artery Occlu 9中医康复2024年第1卷sion,MCAO）大鼠模型复制采用 Zea-Longa 改良法10：给予易氟烷（诱导浓度3%，维持浓度1.5%）吸入麻醉，气体麻醉后，将大鼠仰卧固定，颈部脱毛、消毒，行颈部正中切口纵向切开皮肤，钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉及迷走神经。在颈总动脉近心端予医用缝合线结扎，予微动脉夹夹闭颈外动脉及颈总动脉远心端，在颈总动脉剪开一小切口，将线栓经该小切口沿颈总动脉缓慢向颈内动脉插入，出现轻度阻力时停止，此时线栓上黑点大约位于颈外动脉与颈内动脉分叉口上方1mm，线栓插入的深度约 18.01.0mm，并在颈总动脉处结扎，以防线栓脱落。最后松开动脉夹，如无活动性出血后，逐层缝合皮肤。切口常规消毒，单笼饲养观察。2h 后，将线栓拔出 1cm 左右，动物术后在25环境下饲养，自由进食、饮水。假手术组仅行血管神经分离操作，不作插线处理，其他操作相同。1.4 干预方法假手术组、模型组与补气活血合剂组同步灌胃等剂量生理盐水。补气活血合剂组、合剂+GW4869组在缺血再灌注2h后开始灌胃补气活血合剂（粤药制字 Z20170002，广东省第二中医院制剂室提供），10mL/kg，3 次/日，连 续 灌 胃 7 天；其 中 合 剂+GW4869组前3天每次灌胃前予腹腔注射外泌体抑制剂 GW4869（2.5mg/kgd），以抑制大鼠外泌体释放。1.5 观察指标1.5.1 神经功能评估根据 Zea-Longa评分表10的 5分制行神经功能缺损评分。0分：活动正常，无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪，提尾时，对侧前肢内收、屈曲（为轻度神经功能损伤）；2分：行走时向对侧转圈（为中度神经功能损伤）；3分：站立或行走时向对侧倾倒（为重度神经功能损伤）；4分：不能自发行走，意识昏迷。评分值为 13分的 MCAO大鼠视为造模成功，纳入为研究对象。1.5.2 TTC染色法测定大鼠脑梗死体积干预7天后予易氟烷气体麻醉，断头取脑，放至培养皿中，迅速冷藏于-20冰箱，20min后取出，将脑组织置于脑槽，沿冠状面间隔2mm进行切片，切好的脑组织薄片浸泡在2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染液中，锡箔纸包好后避光置放于37恒温箱中30min，期间不断上下翻动脑组织薄片以使脑组织均匀浸泡染色液；30min后进行拍照，采用Image J软件对脑组织梗死体积进行测量。计算公式为：脑梗死体积百分比=梗死区体积/大脑体积100%。1.5.3 HE染色检测神经损伤程度异氟烷吸入麻醉后，断头取脑，取缺血侧大脑运动皮层，组织取材后在PBS中漂洗，4%PFA中固定过夜。依次使用 50%、70%、90%、100%乙醇脱水，进行石蜡包埋、切片，然后将切片进行二甲苯脱蜡，再次梯度乙醇（体积分数分别为 100%、90%、70%、50%、70%）脱水，苏木精-伊红染色，100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。使用 MshOt（ML31，China）拍照存图，于显微镜下取10倍光镜观察脑组织冠状面切片，以每个样本左下象限视野为观察区域，观察治疗前后脑组织形态学改变。1.5.4 Western blot检测缺血皮质区Nestin、GFAP蛋白表达取冻存于-80冰箱的脑组织，称质量，加入适量RIPA裂解液，冰上裂解15min后，匀浆以 13000g离心20min。提取细胞总蛋白并测定蛋白含量，加入适量Loadingbuffer，用沸水将蛋白煮沸5min进行蛋白变性，按每孔50g蛋白上样。电泳时采用80V电压将蛋白电泳至浓缩胶与分离胶分界线处，然后换为120V继续电泳70min，当溴酚蓝的条带跑至距胶底 1cm 左右时停止电泳，开始电转，电转采用300mA转膜70min。转膜完毕后，将蛋白所在区域切下，用含1%脱脂奶粉的TBST封闭1h，后用Nestin、GFAP 一抗（均为 1:1000）4孵育过夜，次日PBS洗膜后采用辣根过氧化物酶标记的二抗37C孵育45min，ECL显色，GAPDH为内参对照。AlphaInnotech Fluor Chem FC2凝胶成像系统采集图像，Image J软件定量分析Nestin、GFAP的吸光度值，取Nestin、GFAP与GAPDH吸光度比值进行统计分析。1.5.5 血清外泌体的提取及Western blot检测CD63蛋白表达取血后 RT 放置 2h，4C，1500rpm离心3min，取上清到新的 EP 管，以 2000g离心力、4条件离心10min，移液枪将上清转移到新的离心管，以10000g离心力、4条件离心 30min。取上清用 0.22m 针头滤器进行过滤，然后用0.22m针头滤器的PBS进行配平，要求精确到小数点后3位。使用超速离心机进行110000g、4、70min的离心，用移液枪吸走上清，沉淀为初步分离的外泌体。用0.22m针孔滤器过滤的 PBS 再次重悬外泌体并配平，再次进行120000g、4、70min的离心。用移液枪吸走上清，倒置离心管在吸水纸上，使液体流干，加入50L的 10第2期刘通 等 补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响PBS溶解外泌体，放置于-80长期保存。Westernblot检测步骤同1.5.4。1.6 统计方法计量资料以均值加减标准差（x s）表示，多组间对照均值比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnetts T3检验，均由SPSS 19.0进行数据处理。以=0.05为检验水准。2 2结果结果2.1 神经功能缺损评分干预后，假手术组未表现出神经功能缺损症状，模型组神经功能缺损评分显著升高（P0.01），补气活血合剂组神经功能缺损评分较模型组显著降低（P0.05）；应用GW4869后，神经功能缺损评分较补气活血合剂组显著升高（P0.05），见图1。注：与模型组比较，*P0.05；与补气活血合剂组相比，#P0.01图 1 各组大鼠干预前后神经功能缺损评分比较2.2 脑梗死体积假手术组大鼠脑组织成正常红色，未见肉眼苍白梗死灶，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组均可见右侧大脑苍白梗死灶；与假手术组相比，模型组、补气活血合剂组、合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P0.01）；与模型组相比，补气活血合剂组的大鼠脑梗死体积比显著降低（P0.05）；与补气活血合剂组相比，合剂+GW4869组大鼠的脑梗死体积比均显著增加（P0.05），见图2、图3。注：红色为正常脑区，白色为梗死脑区图2 各组大鼠梗死区TTC染色情况注：与模型组比较，*P0.05；与补气活血合剂组相比，#P0.01图3 各组大鼠脑梗死体积百分比的比较2.3 神经损伤程度假手术组染色均匀，组织完整，神经细胞形状为圆锥状，排列整齐，核大居中，有明显的核仁。模型组脑皮层神经细胞排列不规则，神经元明显肿胀，核仁不明显，出现核固缩、细胞间隙存在不同大小的空泡样改变，出现间质水肿。与模型组比较，补气活血合剂组、合剂+GW4869 组神经元坏死减少、组织水肿的形态表现较轻。与合剂+GW4869组比较，补气活血合剂组坏死神经元和脑组织水肿等病理损伤较轻，见图4。图4 各组大鼠大脑皮层的HE染色结果（10 x/20 x）11中医康复2024年第1卷2.4 蛋白表达Western-blot结果显示：与假手术组相比，模型组 GFAP、CD63 表达显著降低（P0.05）；与模型组相比，补气活血合剂组GFAP、CD63表达显著升高（P0.05）；加 用 GW4869 后，补 气 活 血 合 剂 组GFAP、CD63表达显著下降（P0.05），见图5、图6。图5 各组大鼠梗死皮层中Nestin、GFAP及血清外泌体中CD63的表达注：与假手术组相比，*P0.05；与模型组比较，#P0.05；与补气活血合剂组相比，P0.01图6 各组大鼠梗死皮层中Nestin、GFAP及血清外泌体中CD63的表达的比较3 3讨论讨论脑卒中可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中是主要类型，约占全球范围脑卒中患者总数的 60%70%11-12。溶栓是治疗急性卒中的有效方法，但遗憾的是其治疗时间窗仅为 4.5h，超过该时间再使用溶栓药可能会得不偿失13，而出血转化和氧化应激是主要的临床风险，会进一步扩大病理级联反应14。而卒中后缺血半暗带的拯救是防止梗死区继续扩大、促进卒中恢复的有效目标15。因此，卒中后的神经保护对脑卒中患者的功能恢复非常重要。目前所有可用的神经保护药物在脑卒中治疗的临床研究中均以失败告终16-17，故进一步探索治疗脑卒中的有效候选药物也迫在眉睫。越来越多的研究表明，中药及其有效成分在治疗心肌缺血、心力衰竭、缺血性中风、动脉硬化等各种 心 脑 血 管 疾 病（CCVDs）方 面 具 有 独 特 的 疗效18-19。补气活血合剂是我院院内制剂，由我院刘悦教授从1992年应用至今，以益气活血、化痰开窍为治法，由黄芪、赤芍、当归、何首乌、桃仁、瓜蒌子、半夏、陈皮、莱菔子、石菖蒲等药物组成，前期临床和基础实验4-5,20已对其疗效及有效成分等进行了初步验证。本实验对补气活血合剂的临床起效机制进行了进一步探索，发现补气活血合剂可缩小脑梗死体积，提高脑梗死组织中GFAP、Nestin蛋白的表达，改善大鼠缺血再灌注后神经功能缺损程度，该作用可能与促进外泌体分泌有关。巢蛋白（Nestin）是一种中间丝类型的蛋白，是能够特异性地表达在神经上皮干细胞上的一种分子标记物，为神经干细胞的特征性标志物；GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度；GFAP、Nestin蛋白表达的升高表明补气活血合剂可显著促进神经干细胞和星形胶质细胞的再生活化。外泌体直径约为 30150nm，是一种异质性细胞外囊泡，具有功能分子装饰的磷脂双分子层，富含蛋白质、脂类和核酸21-22。CD63是外泌体的标志蛋白之一，其表达量可一定程度上代表外泌体的含量。作为全细胞植入的替代治疗策略，外泌体通过体液和循环将各种蛋白质和核酸传递给邻近和远处的受体细胞，在细胞间通信中发挥着关键作用23。最近，基于外泌体的治疗在脑卒中的血管生成、抗炎、神经发生和抗凋亡方面显示出巨大的作用24-25。小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经干细胞等多种中枢神经系统细胞均能分泌外泌体，并调节神经系统疾病的发生和发展。这些中枢神经系统细胞衍生的外泌体在促进血管生成、调节炎症和中风后大脑重塑方面发挥着关键作用25。因此推测，补气活血合剂可能是通过促进外泌体的分泌进一步调控了血管生成、炎症反应等而起到了对脑功能调控的作用。然而，本实验仍然存在一定缺陷：首先，补气活血合剂是多种药物的复方制剂，其调控外泌体分泌的作用到底有哪些药物密切相关仍需要进一步研究；其次，补气活血合剂诱导的外泌体由何种细胞产生，以及外泌体中的何种成分起到关键作用，仍不清楚。综上所述，本实验发现补气活血合剂可缩小脑梗死体积，提高脑梗死组织中GFAP蛋白的表达，改善大鼠缺血再灌注后神经功能缺损程度，该作用可 12第2期刘通 等 补气活血合剂对脑缺血再灌注模型大鼠血清外泌体及Nestin、GFAP蛋白表达的影响能与促进外泌体分泌有关，但该制剂中的具体起效成分及其介导外泌体分泌的具体起效机制仍需进一步研究。参考文献参考文献1GBD 2019 Stroke Collaborators.Global,regional,and nationalburden of stroke and its risk factors,1990-2019:a systematicanalysis for the Global Burden of Disease Study 2019J.LancetNeurol,2021,20(10):795-820.2BEAL CC.Gender and stroke symptoms:a review of the currentliteratureJ.J Neurosci Nurs,2010,42(2):80.3Wu S,Wu B,Liu M,et al.Stroke in 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