DNA分子标记技术在口腔微生物研究中的应用.pdf

医学理论与实践 年第卷第期 分子标记技术在口腔微生物研究中的应用都佳寅 王 宁 闫 卉 天津市南开医院口腔科 天津中医药大学附属第二医院口腔科摘要 传统的微生物培养及鉴定方法很难全面反映口腔微生物群落的状态及其与宿主之间的关系 近年来随着分子生物学的发展某些 分子标记技术被广泛应用于口腔微生物领域为发现新菌种、相关口腔疾病发病机制的探讨及临床病例的快速诊断等方面开辟了新的途径 本文主要对相关 分子标记技术的基本原理及在口腔微生物领域的应用现状进行综述比较各种方法的优势与不足以期为不同的研究方向提供经验关键词 提取 分子标记技术 口腔微生物中图分类号:文献标识码:/长期以来微生物研究的主要手段依赖纯培养技术 据文献报道环境中只有约 的微生物能够被分离和纯化而口腔中可培养的细菌也只占 因此用传统的微生物培养和鉴定方法不足以反映生态环境中的真实情况严重限制了认识口腔微生物的视野 近年来现代分子生物学技术的成熟为微生物生态学研究提供了新的方法促进了口腔微生物学研究的进一步发展 常见的技术有限制性片段长度多态性标记技术()、变性梯度凝胶电泳()及随机扩增多态性 标记()等 如何提取高质量的 同时最大限度地减少 的损失是成功应用这些技术的关键问题 由于不同细菌样本所含细菌的种类及数量不同同一样本采用不同的 提取方法所得结果可能不同 因此许多学者针对不同的样本特性制定了各种具有针对性的 提取方法以满足不同实验目的的需要并减少假阳性或假阴性结果的产生 目前对于口腔致病菌 的提取不同的实验选择不同的方法因此所得结果的可比性较差 本文综述目前常见的应用于口腔的分子标记技术为口腔微生物不同的研究目的和需求选择合适的技术提供参考限制性片段长度多态性标记技术限制性片段长度多态性标记技术()是指样品 被限制性内切酶酶切产生的 片段长度的变异性 传统 技术的基本原理是用限制性内切酶消化样品基因组 产生大量限制性片段不同样品限制性片段的长度及数目不同电泳后得到特异性图谱再结合 杂交检出 目前该技术有两种改进方法 和末端限制性片段长度多态性技术()以克服对基因组酶切后形成过于复杂的条带难于分析的问题 酶切经 扩增的特异性 片段 是在 基础上对引物的 端用荧光物质标记得到带有荧光标记的末端限制性 片段()用 自动测序仪进行检测获得峰值图了解群落的组成、某菌种的相对数量及样品之间的相似性等 和 技术的核心问题在于引物酶组合的选择不同的组合影响图谱的特异性在近源菌种鉴别时更为重要 技术所得图谱无法进行杂交或直接克隆分析 在分析近缘微生物时当扩增片段靠近荧光标记端的切点一样时无法鉴定至种甚至是属的水平 可分别应用几种内切酶对同一分析样品分别进行消化综合分析多个图谱提高检出率单链构象多态性技术单链构象多态性技术()是基于 构象差别来检测多态性的方法 基本原理是不同的单链 具有序列特异性形成的空间构象不同在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速率不同得到不同的电泳图谱 的主要优点是操作简便、成本低、适合大样本筛查引物无须 夹也不需要灌制梯度凝胶在 的单链 点突变检出率可达 而 时的检出率仅为 同时该技术不能预测单链 迁移速度难以估计其凝胶中的条带位置不能识别突变位置且当碱基互换不影响单链 的空间构象时其检出率只有 有学者利用裂解酶片段长度多态性技术()及 三种方法检测结核分枝杆菌的基因突变 和 可检测短目标序列中的所有突变 在检测长目标序列中的突变时也非常具有优势变性梯度凝胶电泳基本原理为变性梯度凝胶电泳()时不同序列的 片段在各自相应的变性剂浓度下变性使其在聚丙烯酰胺中的电泳速度急剧下降停留在相应的变性 年第卷第期医学理论与实践剂梯度位置染色后在凝胶上获得条带图谱 电泳条带的数目、位置和强度即可反映样品中微生物的种类及相对构成比目前该技术在口腔微生物研究中该技术被广泛应用具有加样量小、分辨率高、重复性好、成本低、操作简便快速等优点 通常根据细菌 序列中保守区设计通用引物对可变区做 扩增 但 更适对属以上进行分类对于属内种间分类分辨率较低 等利用链球菌属的 基因序列对链球菌 个菌属的 个菌株进行了分类鉴定认为其序列的差异可用于菌种区分 为提高 对序列差异的分辨率通常在引物的 端加上 个碱基“夹板”从而显著提高长度超过 的 序列差异的检出率 此外通过图谱分析软件对条带位置和强度进行分析所得结果不能直接反映样品的数量只反映彼此的相对数量趋势且往往存在误差需要结合杂交技术或测序分析等得到更详尽的信息 等研究发现 只能对微生物群落中数量超过 的优势种群进行分析 扩增所需 碱基对含量至少达 核糖体基因间隔序列分析除 原核生物 中还有 和 编码这些 的基因按顺序排列在一条核 上其编码顺序为、和 核糖 体 基 因 间 隔 序 列 分 析()技术研究位于 和 基因间的间隔区序列()其中还含有编码 的 序列对其进行扩增称为 技术 不同种属细菌间的基因间隔序列存在差异同一菌种不同菌株的 不同因此 技术被广泛用于菌种的亚分类以及近源种研究中表现出更显著的序列尤其是长度多态性该方法敏感性高重复性好与 相比 的引物无须 夹 有时染色并不敏感分辨率较低 有学者采用 结合异源双链核酸分子分析技术研究牙龈卟啉单胞菌基因多态性认为基于 操纵子的 可更好地鉴定不同菌株并同时从混杂菌群中鉴定特定菌种内的一系列菌株、任意引物 标记技术()和基因组重复序列()许多文献将 与 归为同一种技术 基本原理源于基因组 分子内部存在间隔的颠倒重复序列()因此在两条模板单链上各有一个随机引物的结合部位经 后产生若干单引物扩增产物由于不同 的颠倒重复序列数目及间隔长度的差异经凝胶电泳产生特异图谱两者的主要区别在于:所需随机引物长度不同通常需要第三个引物如 通用引物第一个 循环所需引物浓度较高 技术 过程分为两个阶段 首先在不严格的条件下使引物与模板错配复性形成可扩增序列然后在严格条件下扩增电泳后产生指纹图谱基于 重复序列的标记技术包括肠杆菌基因间保守重复序列标记()、基因外重复回文序列 标记()标记及肠炎沙门氏菌重复序列 标记()序列即肠杆菌基因间保守重复序列长度为 在不同细菌中的分布位置及拷贝数不同经凝胶电泳产生特异图谱很多微生物基因组 中包含贯穿整个基因组的高度重复短 序列一般 这些短串重复序列可区分到种或者菌株的水平 基于这些序列进行 扩增的方法就叫 片段是另一个原核生物基因组重复序列大小为 由()、()和()种不同的亚单位组成其中只有 存在菌属、种、株水平的分布差异及表现出多拷贝和高保守性 与 相似为肠炎沙门氏菌重复序列并广泛存在于细菌及古菌基因组中 技术操作简便无须专门设计引物没有种属限制无须知道样本序列信息 为确保退火时双链的稳定性引物 含量应 虽然 技术本身耗时短成本低但在分析前往往需要筛选大量的引物 对实验条件敏感重复性和稳定性差 可通过优化反应条件或结合序列特征化扩增区域标记技术()来克服此缺点 技术与普通 技术相比引物长度长退火温度高于 因此图谱稳定重复性高 有学者采用传统、及核糖体分型()技术比较脑脓肿患者及其牙周袋中星座链球菌的遗传多态性传统 分辨率最差且产生条带多不便于后续分析另外两种技术结果相似 采用 及 核糖体分型系统对乳杆菌属内种间鉴定时认为 的敏感性较高但实验步骤较复杂耗时较长有学者用、和 对同一样本分别进行指纹分析三者结果相似度很高但想得到更精细的系统进化树可将三者联合应用 还有学者首次采用 技术对具核梭杆菌种内株间鉴定并与 技术相对比发现两者的分辨率均较高 除此以外利用分子标记技术对凝固酶阴性葡萄球菌菌种鉴定并将 及 两种分子生物学方法的鉴定结果与传统的 微生物分析仪和 鉴 定 系 统 进 行 比 较 一 致 率 为 用、及 对草绿色链球菌进行属内种间及种内株间鉴别时发现前三者所得结果非常相似而 不能检测出口腔链球菌因此没有进行进一步的比较 同时认为 适合于革兰氏阴性细菌的种水平鉴定前医学理论与实践 年第卷第期 三者适用于革兰氏阳及阴性细菌的株水平鉴定 但不适用于种水平鉴定扩增片段长度多态性标记技术扩增片段长度多态性标记技术()为限制性酶切片段的选择扩增来显示片段多态性的方法 具体步骤为基因组 经限制性内切酶双酶切后形成分子量大小不等的限制性片段再将双链人工接头()连接在黏性末端形成一个带接头的特异片段并作为 的模板扩增片段电泳形成特异性图谱 综合了 及 的优点无须预知样本基因组信息 用量少可靠性好分辨率高重复性高 但该技术费用昂贵过程复杂对技术操作人员的技术水平要求较高扩增时可能产生假阴性及假阳性结果 的核心问题在于限制性内切酶的选择研究发现 和 非常适合于 含量较低和较高的菌种 对含量在 的菌种可用 组合 在区分缘菌株方面也非常具有潜力 有学者选用黄单胞菌属 株菌株对、(、)及 杂交三种细菌分类方法比较结果表明三者有较好的一致性定量逆转录 定量逆转录 ()包括两个基本过程:的反转录和定量 定量 的基本原理是在 扩增的指数期产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系 因此可根据 扩增产物的量确定目标基因的表达水平 根据定量测定的时间定量 可分为实时定量()和终点定量 ()具有全封闭、自动化、不需凝胶电泳、重复性好及精确定量等优势在口腔微生物领域被广泛应用但 前核酸的提取效率反应过程中任一因素的细微变化均可导致最终结果的巨大差异荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术()基本原理是用荧光材料将一种核酸单链标记成探针在微生物核酸的原有位置进行杂交采用激光共聚焦扫描显微镜()和落射荧光显微镜()获得微生物在形态学、数量及空间分布等方面的信息对样品进行定性定量分析 技术操作简便实验成本相对较低 但探针接近靶区的能力探针的敏感性、特异性和稳定性等问题还需要进一步改善 除此以外有学者将扫描电镜()、传递电子显微镜()与 联合应用更好地显示出菌体细胞外基质菌体所处环境三者本身的结构及相互的空间结构关系 微观放射自显影集成技术()还能反映出不同微生物的生物代谢情况酪胺信号放大荧光原位杂交技术()可以显著增强信号强度提高灵敏度并缩短探针长度 还可与基因芯片技术合用起到与 相似的信号增强作用抑制消减杂交技术抑制消减杂交技术()是一种比较不同群体中差异表达基因的技术 首先将待测样本(如高毒力菌株)和驱逐样本(如低毒力菌株)分别用同一种限制性内切酶消化再将两者变性后经过两次杂交复性使差异表达的序列片段得到富集 通过第一轮具有抑制作用的 扩增使共同表达序列得到抑制差异表达的序列片段得到显著扩增再经过第二轮巢式 极大地提高了差异表达的目片段的特异性及丰度 技术可检测低丰度表达基因假阳性率低高敏感性及一次反应可检出几十或成百差异表达的基因 但需要几微克 同时两样本之间要有相似的遗传背景基因芯片技术基因芯片技术()是将 探针列阵固定于固相基质上将待测样品的/片段用荧光或其他方法标记后作为靶分子与基因芯片上的探针列阵杂交 由于列阵中特定位置上的核苷酸序列是已知的所以对每一位点上的荧光强度进行检测即可对样品的遗传信息进行定性定量分析杂交信号常用激光共聚焦扫描显微镜检测并用专用软件记录分析后输出结果该技术直接以序列差异作为标记具有高通量、并行性及自动化等优点特别在基因相互作用和调控关系的研究方面具有独特优势被认为是应用前景最好的遗传标记技术 但成本昂贵、影响杂交动力学的因素等还有待深入研究 目前有学者应用肽核酸()代替 制作探针以解决杂交时芯片上的探针自身形成二级甚至是三级结构的问题 同时认为 的结合比 的结合更加牢固 还有学者将 技术与基因芯片相结合弥补互相缺陷 能够有效筛查低丰度差异表达的基因还能分离和鉴定未知基因而这些是基因芯片无法完成的 差异表达基因若通过 来验证其工作繁重且效率低 基因芯片技术可以弥补这点不足 除此以外口腔致病菌生物信息资源库()可向研究者提供芯片序列等相关信息综上所述口腔微生物在维持口腔健康方面发挥着重要作用 一系列新型分子生态学技术的引用为基因层面上深入分析口腔微生物提供了从整个群落属种株特定基因鉴定和表达及与宿主相互关系的研究方法极大地促进了口腔微生物 年第卷第期医学理论与实践学的发展 这些方法不仅可对微生物进行定性定量分析还可进行形态学观察甚至是微生物群落生态变化的功能性试验监控菌落生态系统的动态变化了解微生物与宿主之间的相互关系 其中的许多试验方法不仅特异性高高通量而且操作简便节省时间 但每种方法还存在各种问题适用范围也有所不同需根据实验目的选择合适的实验方法参考文献 .():.:.():.():.():.()()()().():.():.(.).():.():.():.():.:.:.():.():.:.():.():.():.:.():.():.王亚娟沈叙庄高薇等.基因多态性分析在凝固酶阴性葡萄球菌菌种鉴定中的应用.中华微生物学和免疫学杂志():.:.().:.:.():.().():.(/).():.():.(上转第 页)医学理论与实践 年第卷第期 症发病率迅速上升 疼痛是癌症中最常见和最严重的症状之一会干扰患者生活的各个方面包括日常活动、社交功能、睡眠质量和认知功能 癌性疼痛常见原因包括癌肿本身和其转移到骨骼、内脏或神经所产生的疼痛以及抗癌药物引起的组织或神经损伤有关的疼痛/通路是肿瘤细胞赖以生存的关键通路在直肠癌 细胞中给予药物杨梅素可降低 和 的表达遏止/通路导致直肠癌 细胞凋亡 骨转移所致疼痛是癌性疼痛常见的疼痛是一种复杂的疼痛状态通常是持续的、突然的、自发的且常伴有痛觉过敏 为了研究癌性疼痛的机制最常用的动物模型是骨癌痛模型 在骨癌疼痛模型中()是一种/依赖性激酶()抑制剂在腹腔注射/时观察到在 和 时骨癌痛显著减轻其背后的机制可能是通过 抑制 和随后增强 基因表达从而降低神经元内的氯化物水平并重建正常的 能抑制功能使得破坏的抑制性神经传递重新正常化从而减少了骨癌小鼠模型中的病理性疼痛样行为为癌性痛的研究提供了重要的研究方向综上所述在病理性疼痛机制中 通过底物磷酸化等各种复杂的相互作用调控相关基因蛋白使得在病理性疼痛模型中缓解其疼痛为病理性疼痛的治疗提供重要的靶点 但 在病理性疼痛的研究在临床上还未得到广泛的应用对其在分子机制的阐述有助于该疾病在今后得到更好的治疗和控制参考文献 .:.():.:.():.:.():.:.:.:.():.:./.:.:.:.():./.:.:.:.:.:.():.():.:():./.()():.():.冯政.杨梅素通过 介导/通路诱导结直肠癌 细胞凋亡机制的研究.西安:西北大学.(本文通信作者:熊丽)收稿日期 (编辑 倩楠)(下接第 页).():.():.():.收稿日期 (编辑 凤培)