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现代农业研究Modern Agriculture Research第29卷-聚谷氨酸生物有机肥制备及其对土壤营养聚谷氨酸生物有机肥制备及其对土壤营养和青菜品质的影响和青菜品质的影响（1.上海市农业科学院生态环境保护研究所上海201403；2.上海应用技术大学生态技术与工程学院上海201418；3.农业农村部上海农业环境与耕地保育科学观测试验站上海201403；4.上海市农业环境保护监测站上海201403；5.农业农村部东南沿海农业绿色低碳重点实验室上海201403）【摘要】为提高农业资源利用价值，发展可持续农业，本研究基于产-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌A-5制备一种-聚谷氨酸生物有机肥。制备过程为：（1）将秸秆风干粉碎后与畜禽粪便、豆粕、味精废液混匀，得到发酵基质，所述畜禽粪便、秸秆、豆粕和味精废液的质量比为 48 48 14 01；（2）将枯草芽孢杆菌A-5种子接种液接入所述发酵基质中，混匀发酵，得到所述-聚谷氨酸生物有机肥。采用大田小区试验研究其对小青菜的促生作用及在降低作物热害中的应用。结果显示，本研究的-聚谷氨酸生物有机肥利用农业废弃物作为发酵基质，成本低廉，能够促进作物养分吸收、增产提质、改善土壤理化性质，并提高作物的对高温天气的抗逆性。【关键词】-聚谷氨酸；生物有机肥；作物热害；农业废弃物；土壤性质；植物抗逆性中图分类号：TQ440.2+2文献识别码：A文章编号：2096-1073（2024）02-0014-17白娜玲1,3,4,5，陈昭良1,2，李双喜1,3,4,5，张娟琴1,3,4，张翰林1,3,4，张海韵1,3,4，吕卫光1,3,4,5*BAI Naling1,3,4,5,CHEN Zhaoliang1，2,LI Shuangxi1,3,4,5,ZHANG Juanqin1,3,4,ZHANG Hanlin1,3,4,ZHANG Haiyun1,3,4,LYU Weiguang1,3,4,5*Abstract A bioorganic fertilizer containing-polyglutamic acid was prepared based on-polyglutamic acid-producing Bacillussubtilis A-5 to improve the utilization value of agricultural resources and develop sustainable agriculture.The preparation processcomprises the following steps:(1)air drying and pulverizing the straw,and uniformly mixing the straw with livestock manure,soybean meal,and monosodium glutamate waste liquid to obtain a fermentation substrate,wherein the mass ratio of the livestockmanure,straw,soybean meal,and monosodium glutamate waste liquid is 48:48:14:01;(2)inoculating Bacillus subtilis A-5seed inoculum into the fermentation substrate,uniformly and fermenting to obtain the-polyglutamic acid bioorganic fertilizer.The field plot experiment was used to study its growth promotion effect on Brassica chinensis L.and its application in reducinghigh temperature damage of crop.The results show that the-polyglutamic acid bioorganic fertilizer in this study,which usesagricultural waste as fermentation substrate,is cost-effective and can promote crop nutrient uptake,increase yield and quality,improve soil physicochemical properties,and improve crop resistance to high-temperature weather.Key words-polyglutamic acid;bioorganic fertilizer;temperature damage of crop;agricultural waste;soil properties;stresstolerance of plants（1.Eco-environmental Protection Research Institute,ShanghaiAcademy ofAgricultural Sciences Shanghai 201403;2.School of Ecological Technology and Engineering,Shanghai Institute of Technology Shanghai 201418;3.Shanghai Experimental Station for Scientific Observation ofAgri-environmental and Cultivated Land Conservation,Ministry ofAgriculture and RuralAffairs Shanghai 201403;4.ShanghaiAgri-environmental Protection Monitoring Station Shanghai 201403;5.Key Laboratory of Low-carbon GreenAgriculture in Southeastern China,Ministry ofAgriculture and RuralAffairsShanghai 201403)The Preparation of Bioorganic Fertilizer ContainingThe Preparation of Bioorganic Fertilizer Containing -Polyglutamic Acid-Polyglutamic Acidand its Impact on Soil Nutrition and the Quality ofand its Impact on Soil Nutrition and the Quality ofBrassica ChinensisBrassica ChinensisL.L.收稿日期：2023-10-07基金项目：上海市农业科技创新项目“生物炭基解盐促生菌剂构建及对盐碱土壤改良研究”（项目编号：T2023313）；上海自然科学基金“壬基酚高效降解菌Acidovorax sp.P02的降解途径及机制研究”（项目编号：21ZR1464500）；生态所揭榜挂帅项目“新型-聚谷氨酸微生物源制剂研发及应用示范”（项目编号：生科-JA2024-1）；上海市农业科学院卓越团队建设计划项目“农田典型障碍土壤改良修复关键技术研究与示范应用”项目编号：沪农科卓2022（008）。作者简介：白娜玲（1989-），女，河北保定人，博士，副研究员，研究方向：土壤微生物生态研究。*通讯作者：吕卫光（1972-），男，博士，研究员，研究方向：农业环境污染治理与修复、土壤障碍机理与修复、农业环境监测与评价、生态农业发展模式等方面，E-mail：。14白娜玲，陈昭良，李双喜等：-聚谷氨酸生物有机肥制备及其对土壤营养和青菜品质的影响1 背 景随着我国农村经济发展，农业和畜禽养殖业产生的废弃物对环境造成了巨大压力，是当前最难治理的农业面源污染1,2。我国是世界上农作物秸秆和畜禽粪便产出量最大的国家之一，据统计，我国每年产生各类农作物秸秆约10亿吨，畜禽粪便产量约40亿吨3-5。无论是农作物秸秆还是畜禽粪便，均含有大量的有机物，加以合理利用就能变为宝贵的再生资源。农业废弃物资源化利用有助于改善环境污染、发展循环经济、实现农业可持续发展6。国家也出台了相关政策及法律法规，要求到“十四五”末，畜禽粪污综合利用率达到80%以上，秸秆综合利用率稳定在86%以上7。化肥和农药是满足人口增长对粮食增产的需求及农业集约化发展的重要保障。但传统化肥施用量大、施肥技术落后、水肥利用率低等原因，施入土壤中的肥料养分以多种途径排放到环境中，导致肥料养分浪费和农业面源污染等问题8。“十三五”期间，我国化肥施用量虽然实现了一定程度的减少，但施用强度仍然很高。2020年，我国水稻、小麦、玉米三大粮食作物的化肥利用率为40.2%9，比欧美等发达国家低10%20%10。由于化肥的长期使用和不合理的施用结构，造成肥料产能过剩、环境污染、土壤基础能力减弱等问题，传统肥料不能满足现代农业快速发展的需求11。因此，需要加快创新研发环保、高效的肥料等绿色投入品，以提高农产品质量效益和竞争力，也为现代农业发展提供重要基础支撑。-聚谷氨酸（PGA）是一种由D-型或L-型谷氨酸单体通过-酰胺键组成的天然阴离子聚合物12，分子量约1008000 KDa。据研究报道及本团队前期工作基础可知，PGA对小白菜、黄瓜、火龙果、毛豆的种植与栽培同样产量时肥料施用量减少10%以上（甚至30%），或在同样施肥量前提下提高作物产量10%以上，还能够改善作物品质。PGA在农业上可提高土壤保水能力13；提高肥料利用率；螯合土壤有毒重金属，缓解土壤毒害14,15；减肥增产增效16；延长常温下产品货架期17等。传统液体发酵制备PGA存在发酵原料及设备成本高18、提纯处理繁复19、增加成本等问题，且制备好的PGA在肥料中添加又增加了人工成本，限制了其在农业中的大规模应用。为解决上述问题，本研究选取一株产-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌A-5，采用固体发酵的方式制备-聚谷氨酸生物有机肥。通过大田小区试验分析微生物源PGA基生物有机肥对作物的促生、提质和抗热害效果。改变发酵基质的成分质量比例以探讨本堆肥方法在降低作物热害的应用效果。2 材料与方法2 2.1 1 材料2.1.1 培养基（1）LB固体培养基：酵母抽提物 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，琼脂 20%，pH值=7.07.2；（2）FF液体培养基：葡萄糖 2040 g/L，酵母抽提物 57 g/L，谷氨酸钠 2040 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.25 g/L，pH值=7.07.2。2.1.2 发酵用菌株本试验所用的-聚谷氨酸生产菌株为枯草芽孢杆菌A-5。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏号为CCTCC NO：M2019157。2 2.2 2 堆肥方法2.2.1 发酵基质制备将从农田中收集的水稻秸秆自然风干，粉碎至长度为25 cm，同时，从当地畜禽养殖场收集牛粪，自市场购买大豆豆粕，自味精加工厂收集味精废液（谷氨酸发酵液提取谷氨酸之后产生的废液，还包含生产过程中的洗涤废水），将水稻秸秆、牛粪、豆粕与味精废液按照8 8 4 1的质量比充分混匀制备发酵基质，通过控制水量的添加使得发酵基质的初始含水量在45%60%之间，初始 pH值为6.08.0，为了节约成本，采取不灭菌消毒的方式进行固体发酵，其中水稻秸秆、牛粪和豆粕为主要发酵基质，味精废液为补充营养。将发酵基质的畜禽粪便、秸秆、豆粕和味精废液的质量比调整为为6 4 3 0.5，将发酵基质的畜禽粪便、秸秆、豆粕的质量比调整为为4 7 1，其它条件不变，制备-聚谷氨酸生物有机肥。其中畜禽粪便为牛粪、猪粪、鸡粪中的一种或多种，秸秆为水稻秸秆和/或小麦秸秆，接种功能微生物，发酵过程中，每天将发酵基质混匀12次。2.2.2 种子接种液制备利用LB固体培养基活化枯草芽孢杆菌A-5，在培养箱中于2837 下培养1224 h，备用；将活化的枯草芽孢杆菌A-5接种至FF液体培养基中，培养2 d，获得种子接种液。2.2.3 有机肥发酵将种子接种液接入发酵基质中，接种量为12%，发酵温度为 30，在固体发酵罐中发酵 3 d，每 12 h 以 510 r/min 混匀30 min，发酵后烘干或自然晾干得到-聚谷氨酸生物有机肥，本研究中采用10 L自制固体发酵罐，装样量为46 L。2 2.3 3-聚谷氨酸（PGA）产量测定发酵结束后，取100 g发酵物，加入300 mL H2O，室温下置于180 r/min摇床上振荡1 h。静置30 min，取100 mL上清置于离心管中，12000 r/min 离心10 min去除剩余菌体与发酵基质中的固体颗粒物。再取30 mL上清液转移至新的离心管中，加入浓盐酸调节pH值 2.03.0，加入3倍体积预冷的无水乙醇，沉淀过夜。10000 r/min离心10min，获得PGA沉淀，随后加入适量体积H2O重悬PGA，并用NaOH调节pH至中性，10000 r/min离心10 min得到含PGA的上清液。采用CTAB法测定PGA含量：利用浓度8%NaOH溶液配制6%浓度的CTAB溶液；将PGA待测液15现代农业研究Modern Agriculture Research第29卷和CTAB溶液等体积缓和混匀，避免产生过多气泡，静置34 min，在波长250 nm处测定此时的吸光度。再根据标准曲线换算PGA的产量。2 2.4 4 大田小区试验于2021年78月盛夏期间，在温室大棚开展大田小区试验，验证-聚谷氨酸生物有机肥对小青菜的促生作用。共设置三组处理：对照组CK，常规有机肥OF（购自市场），等氮量的-聚谷氨酸生物有机肥OF-PGA，磷钾不足部分用过磷酸钙和氯化钾补齐，每组三个平行。每个小区约1.5 m2，随机区组设置。肥料均用作底肥，所有的管理措施一致。小青菜分析检测方法：（1）生物量的测定：利用分析天平直接称量测定小青菜的鲜重，鲜重测定完毕后的样品105杀青30 min，随后测定植株全氮含量。（2）SPAD的测定：用SPAD-502P叶绿素仪直接现场测定小青菜的叶绿素相对含量。（3）植株硝氮含量测定：用植物硝态氮试剂盒测定，购自苏州科铭生物科技有限公司。（4）氮肥表观利用率分析：（施肥处理养分含量植株干重-空白处理养分含量植株干重）100%/施氮量。（5）热害指数：分级标准为：正常为0级；叶片绿色轻度反卷萎蔫为1级；叶片微黄中度萎蔫为2级；叶片发黄重度萎蔫为3级；植物茎萎缩，叶大部枯黄萎蔫为4级；死亡干枯为5级。热害指数=各级株数/（最高级数总株数）100。3 结果-聚谷氨酸生物有机肥的应用效果如表1所示。在高温天气下，不施肥处理（CK）的青菜农艺性状最差，热害指数最高；OF-PGA处理的青菜长势最好。施用OF和OF-PGA均能促进青菜的生长，而施用OF-PGA的青菜生物量、SPAD、氮肥表观利用率均显著高于同等养分条件下的OF处理。硝酸盐含量是评价蔬菜品质的重要指征，OF-PGA处理的青菜中的硝氮含量显著低于OF处理，说明降低了蔬菜中的硝酸盐含量。OF-PGA的肥效效果显著，对小青菜的生长有良好的促进作用，能明显提高肥料利用率，改善作物品质，并提升夏天青菜对高温天气的抗逆性。实际上，无论发酵基质的畜禽粪便、秸秆、豆粕和味精废液的质量比是8 8 4 1，还是6 4 3 0.5或者4 7 1 0，制备得到的-聚谷氨酸生物有机肥的有机质含量（以干重计）25%，聚谷氨酸含量4.0%，均能提高肥料利用率，提升夏天青菜对高温天气的抗逆性。以上试验证明，这种固体发酵方法对作物生长具有良好的促生作用，能够提高肥料的利用率、降低作物热害。4 讨论本研究采用固体发酵的方式生产-聚谷氨酸20，直接得到含有-聚谷氨酸和功能菌株的生物有机肥，能够为作物提供丰富的有机质、氮磷钾及微量元素21；不灭菌的前处理也降低生产成本并保留了大量有益的微生物菌群，具有能耗低、产生污水少、生产方式简单、绿色环保等优势；利用农业废弃物作为发酵基质，既可以降低成本，又能实现固体废弃物资源化处理22。此外，本研究制备的-聚谷氨酸生物有机肥能够提升肥料的缓释效果，提高肥料的利用率23，促进作物养分吸收、增产提质、改善土壤理化性质。参考文献参考文献：1 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