螺旋藻藻蓝色素分离纯化及亚基结构分析_殷欢.pdf

237 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-06-22 *通信作者 基金项目：河南省自然科学基金项目(182300410079)。作者简介：殷欢(1998)，女，硕士研究生，研究方向为食品营养与健康。殷 欢1，张雅斐2，任顺成1*，李林政3，潘天义3(1.河南工业大学，河南省天然色素制备重点实验室，河南 郑州 450001；2.乐普(北京)医疗器械股份有限公司，北京 102200；3.河南中大恒源生物科技股份有限公司，河南 漯河 462600)摘要：为得到高纯度藻蓝色素，采用盐析、透析、羟基磷灰石(Hydroxyapatite HA)柱层析、SDS-PAGE等方法对螺旋藻中的藻蓝色素进行了分离纯化及分子质量测定，还对藻蓝色素亚基和亚基的结构进行了模拟。经17.5%硫酸铵一步盐析得到藻蓝色素纯度为2.45，50%硫酸铵二步盐析将纯度提高至2.70，再经HA层析得到成品，纯度为4.37；纯化后的样品经SDS-PAGE得到清晰的2条带，分别为亚基和亚基，分子质量为17.2 ku和19.7 ku；用SWISS-MODEL和PyMOL对藻蓝色素亚基的结构进行模拟。实验结果可为藻蓝色素的进一步开发利用提供参考。关键词：螺旋藻；藻蓝色素；盐析；纯化；亚基结构中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0237-08Purification and Subunit Structure Analysis of Phycocyanin from Spirulina PlatensisYIN Huan1,ZHANG Yafei2,REN Shuncheng1*,LI Linzheng3,PAN Tianyi3(1.Henan Provincial Key Laboratory of Natural Pigment Preparation,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;2.Lepu Medical Technology(Beijing)Co.,Ltd.,Beijing 102200,China;3.Henan Zhongda Hengyuan Biotechnology Co.,Ltd.,Luohe 462600,China)Abstract:In order to obtain high-purity phycocyanin,the separation,purification and identification procedures of salting out,dialysis,hydroxyapatite column chromatography and SDS-PAGE were established,and the structures of subunits and subunits were simulated.The purity of phycocyanin obtained by one-step salting out with 17.5%ammonium sulfate is 2.45,the purity is increased to 2.70 by two-step salting out with 50%ammonium sulfate,and then the reagent grade finished product is obtained by hydroxyapatite column chromatography with a purity of 4.37;After purification,two clear bands were obtained by SDS-PAGE,which were subunit sum subunits with molecular weights of 17.2 ku and 19.7 ku;The structure of phycocyanin subunit was simulated by SWISS-MODEL and PyMOL.The results can 螺旋藻藻蓝色素分离纯化及亚基结构分析DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.033 238 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期0 引言螺旋藻(Spirulina)属蓝藻门，是一种古老的低等原核水生植物，其富含蛋白质以及其他活性成分，具有很高的营养价值和生物利用价值，因富含天然色素成分藻蓝色素(C-PC)而在食品领域被广泛关注和研究1。藻蓝色素是一种可捕获光能的水溶性色素，在中性条件下呈靓丽的宝石蓝色，作为GB 27602014食品添加剂使用标准中规定可以使用的2种天然蓝色素之一，常被应用于食品、化妆品、医疗和生物化学研究中。藻蓝蛋白根据纯度(EP)高低被分为3个级别：食品级(EP0.7)、反应级(0.7EP3.9)和试剂级(EP4.0)2。国内外研究者提供了多种从螺旋藻中提取藻蓝色素的方法，但成品纯度不高，仍需进一步纯化。根据藻蓝色素的特性，于光等3通过硫酸铵沉淀和羟基磷灰石(HA)柱分离纯化得到纯度为4.7且具有光敏效应的藻蓝蛋白。于淑坤等4对螺旋藻细胞进行超声处理，再结合盐析、HA和DEAE-Sephadex-A-25分离纯化得到纯度为5.4的藻蓝蛋白。PATIL G等5用DEAE-Sephadex-filled填充阴离子交换层析柱，将藻蓝蛋白的纯化倍数从1.18提高到3.92，回收率达73%，该方法无需沉淀、离心和透析，极大简化了实验操作，为大规模分离纯化藻蓝蛋白提供了可能性。此外，ERIKSEN N T6也列举了通过多次柱层析得到高纯度藻蓝色素的方法；而王勇等7借助SephadexG-200、DEAE-Sephadex-25、HA、SephadexG-200等一系列纯化程序得到了纯度为14的藻蓝色素，超出国内外现有报告的最高值。结构决定性质，通常认为藻蓝色素的基本结构单位为亚基和亚基，其蓝色来源于结构中呈开链四吡咯结构的藻蓝胆素(PCB)，而PCB则通过硫醚键分别连接在亚基的Cys84和亚基的Cys84、Cys155上8。、亚基之间有极强的同源性，二者先通过各种相互作用等比例结合形成单体()，再根据所处环境聚合形成()3或()69。为进一步探究藻蓝色素的结构和特性，SINGH N K等10模拟了从蓝细菌中分离出的六聚体藻蓝蛋白的晶体结构，为藻蓝蛋白介导的阿尔兹海默症(AD)治疗提供了一种新的基于结构的分子机制。本研究建立了一套低成本高效率的纯化程序，仅通过分步盐析法和羟基磷灰石柱层析法对藻蓝色素进行分离纯化，在简化纯化程序的同时有效提高藻蓝色素的纯度；再根据Gennbank核苷酸序列数据库中的藻蓝蛋白序列模拟亚基和亚基的结构，为其在生产加工过程中更广泛的应用提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂藻蓝色素粗品：纯度为1.79，河南中大恒源生物科技股份有限公司；羟基磷灰石：上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂：郑州新丰化验器材有限公司。1.2 实验仪器UV-1600B型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TDL-5A型台式低速离心机：江苏省金坛市医疗仪器厂；FA1004型电子分析天平：上海上平仪器公司；PHS-3C型雷磁酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；MVS-1型旋涡混合器：北京金北德工贸有限公司；KQ-300型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FY15700型透析袋：江苏南通经纬生物科技有限公司；FW-200型循环水式真空泵：北京中兴伟业仪器有限公司；层析柱：上海联塔仪器有限公司；HL-2型恒流泵：上海青浦沪西仪器厂；EPS-300型电泳仪、Tanon2500凝胶图像分析系统：上海天能科技有限公司。1.3 实验方法1.3.1 藻蓝色素浓度与吸光度的关系曲线 确定藻蓝色素的最大吸收峰：称取少量藻蓝色素，用蒸馏水配制为适当浓度的藻蓝色素溶液，使用紫外分光光度计扫描200700 nm的吸光度值。藻蓝色素标准曲线的制作：准确称取一定量的藻蓝色素，分别加入蒸馏水配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL的溶液，以provide reference for the further development and utilization of phycocyanin.Key words:Spirulina;phycocyanin;salting out;purification;subunit structure 239 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期蒸馏水为空白对照，立即于620 nm处测量吸光度值，绘制线性回归曲线。1.3.2 原藻蓝色素溶液纯度测定 准确称取藻蓝色素25 mg，定容至50 mL，得到0.5 mg/mL的藻蓝色素溶液，注意避光。使用紫外可见分光光度计测量280 nm和620 nm处的吸光度值，平行测定3次。计算原藻蓝色素的纯度，纯度(EP)计算公式为11：EP=A620/A280式中：EP为藻蓝色素的纯度；A620为溶液在620 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值；A280为溶液在280 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值。1.3.3 一步盐析 配制一定量0.5 mg/mL藻蓝色素溶液，分别置于10个离心管中，每管15 mL，按梯度依次缓慢加入饱和度为12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、35%、40%的硫酸铵，边加边搅拌，溶解完全后4 静置24 h，3500 r/min离心30 min，记录上清液在280、620、652 nm处的吸光度值，平行测定3次，以此计算一步盐析上清液中藻蓝色素的纯度、浓度和得率。同时将沉淀复溶，在200700 nm范围内进行全波长扫描，分析沉淀出的物质。浓度和得率计算公式为12：Cpc=(A6200.474A652)/5.34式中，Cpc为溶液中藻蓝色素的浓度，mg/mL；A620为溶液在620 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值；A652为溶液在652 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值。得率(%)=(C/C0)100式中：C为当前藻蓝色素溶液的浓度；C0为藻蓝色素溶液的浓度。1.3.4 二步盐析 分析1.3.3实验结果后选择17.5%的硫酸铵饱和度进行二步盐析。设置二步盐析硫酸铵饱和度梯度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，溶解完全后4 静置24 h，3500 r/min离心30 min，弃上清液取沉淀，沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)定容至15 mL，记录280、620、652 nm处的吸光度值，平行测定3次，计算二步盐析后藻蓝色素的纯度、浓度和得率。1.3.5 上柱样品制备 盐析：一步盐析加入硫酸铵至饱和度为17.5%(w/v)，二步盐析追加硫酸铵至饱和度为50%(w/v)，沉淀用少量0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)溶解，在4 下保存。透析：将12 ku的干型透析袋(扁宽44 mm)剪下合适长度，于蒸馏水中煮沸10 min，冷却后依次用蒸馏水和透析液(0.01 mol/L PBS pH7.0)冲洗干净(煮沸后所有操作均需戴手套完成)，同时检漏。将盐析后的沉淀溶解液转移至透析袋中，加入量不超过透析袋容量的1/3，4 透析24 h，期间更换透析液45次。充分透析后将透析袋内的截留液于3500 r/min离心10 min去除变性蛋白，获得上柱样品，4 避光保存。1.3.6 羟基磷灰石柱层析 前期准备：配制一定量的0.1 mol/L NaOH溶液，将新开封的羟基磷灰石(HA)倒入NaOH溶液中浸泡2 h。层析柱规格2.6 cm25 cm，柱床高度15 cm，待其自然沉降后用至少5倍柱体积的0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)平衡羟基磷灰石柱。上样洗脱：柱内液体与柱面相切时上样，缓慢滴加，不要破坏柱面。待样品进入柱子后加入洗脱液。洗脱过程中，依次加入6种不同离子强度的洗脱液，即0.01 mol/L PBS、0.01 mol/L PBS+0.1 mol/L NaCl、0.02 mol/L PBS+0.1 mol/L NaCl、0.05 mol/L PBS+0.1 mol/L NaCl、0.1 mol/L PBS+0.1 mol/L NaCl、0.2 mol/L PBS+0.1 mol/L NaCl。结果处理：收集每个梯度的洗脱液，每管4 mL，使用紫外可见分光光度计逐管检测280 nm处的吸光度，当A280 nm0.02时，可更换离子浓度较高的洗脱液。以洗脱体积和280 nm处的吸光度值为横纵坐标绘制洗脱曲线，并合并同一洗脱峰下的收集液进行全波长扫描，收集纯度4.0的部分。1.3.7 SDS-PAGE 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对原藻蓝色素、盐析后的藻蓝色素和柱层析后藻蓝色素的分子质量进行测定，浓缩胶浓度5%，样品在浓缩胶中电压80 V，分离胶浓度12%，样品进入分离胶后电压120 V，以蛋白质Marker为对照，测定藻蓝色素亚基分子质量的大小。1.3.8 亚基结构 参考RCSB PDB蛋白质数据库中C-藻蓝蛋白的、亚基序列13，在SWISS-MODEL中建立亚基结构的3D立体模型，再通过PyMOL构建藻蓝胆素的三维结构图象，以此分析藻蓝蛋白亚基的结构。1.3.9 数据处理与分析 每组实验平行测定3次，240 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期取平均值。使用Excel 2016、SPSS 20.0和Origin 2018进行数据统计、差异性分析和制图，使用PyMol进行结构模拟。2 结果与分析2.1 藻蓝色素标准曲线了一步盐析上清液中藻蓝色素的纯度和得率变化情况，当硫酸铵饱和度在10%22.5%时，上清液中藻蓝色素纯度变化不大，此时与原藻蓝相比，纯度从1.79提高至2.5左右，当硫酸铵饱和度大于25%时纯度迅速下降；与此同时，藻蓝色素得率随着硫酸铵饱和度的增加而减小，当硫酸铵饱和度25%时，得率也急剧下降。可以确定的是：低浓度的硫酸铵溶液可以有效去除溶液中的核酸、叶绿素和部分杂蛋白16，此时溶液中的藻蓝色素保持稳定，但随着硫酸铵浓度的增加，越来越多的藻蓝色素被沉淀下来，使纯度和得率均明显下降。图1 藻蓝色素全波长扫描图图2 藻蓝色素浓度与吸光度的关系曲线注：不同字母表示不同样品之间存在显著性差异(P0.05)。图3 一步盐析藻蓝色素的纯度和得率图4 一步盐析沉淀全波长扫描图3004005006007000.00.20.40.60.81.01.2吸光度(Abs)波长/nm6203412770.20.40.60.81.00.00.40.81.21.6吸光度(Abs)藻蓝色素质量浓度/(mg/mL)Y=1.89893X+0.01273R2=0.99980.0abbcdefghi101520253035020406080100硫酸铵饱和度/%得率/%1.01.52.02.53.03.5纯度 得率 纯度3004005006007000.00.40.81.21.62.0吸光度(Abs)波长/nm 35%30%27.5%25%22.5%20%17.5%15%12.5%10%615280340天然藻蓝色素是一种色素蛋白复合物，四吡咯发色团通过硫醚键连接在藻蓝色素肽链的半胱氨酸残基上，其同时具有色素和蛋白的特性14。如图1所示，藻蓝色素在250700 nm波长段内呈现3个吸收峰：280 nm处是蛋白质的特征吸收峰，即藻蓝结构中用于连接发色团的脱辅基蛋白；340 nm处是藻蓝胆素和维生素类物质的特征吸收峰；620 nm对应的是藻蓝色素的特征吸收峰，这与武春燕等15的研究结果一致。此时，藻蓝色素溶液的纯度为1.79，杂蛋白含量较多。为探究藻蓝色素浓度与吸光度的关系，得到关系曲线图2，回归方程为Y=1.89893X+0.01273，R2=0.9998，曲线拟合良好，即藻蓝色素的吸光度值与其在溶液中的含量存在极强的相关性。2.2 一步盐析纯化藻蓝色素结果分析盐析是蛋白质纯化中常用到的方法。图3反映将一步盐析得到的沉淀复溶并进行全波长扫描，得到图4。其中260280 nm处的吸收峰对应的是杂蛋白和核酸类物质17，可以看出10%15%的峰值较低，即较低的硫酸铵饱和度不足以有效去除这些杂质；340 nm左右的微弱吸收峰对应维生素类物质，当硫酸铵饱和度22.5%时才有去除效果，且效果甚微；620 nm左右的峰值变化说明随着硫酸铵饱和度的增加，沉淀中藻蓝色素的含量越来越多，从而导致上清液中损失了部分藻蓝 241 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期色素。因此，综合考虑到藻蓝色素的纯度和得率以及节省原料，最终选定一步盐析的硫酸铵饱和度为17.5%，此时纯度为2.45，相比于原藻蓝纯度提高了0.66。2.3 二步盐析纯化藻蓝色素结果分析高浓度的硫酸铵会中和藻蓝蛋白表面的电荷并破坏包裹在外层的水化膜，使蛋白质分子相互之间发生凝聚，从而直接沉淀藻蓝色素18。图5表示的是二步盐析后藻蓝色素的纯度和含量变化，硫酸铵饱和度为30%40%时，纯度从2.21升至2.84得到了大幅度提高，当硫酸铵饱和度大于40%时藻蓝色素溶液的纯度整体变化不大；硫酸铵饱和度为30%50%时得率迅速增加，大于50%时的得率也是基本维稳。峰为柱穿过组分，最大吸收波长在280 nm，为层析柱中被洗脱下来的杂蛋白以及其他杂质；藻蓝色素主要集中在第二个峰，洗脱液呈亮蓝色，由图7可知其在280 nm和620 nm处有明显的吸收峰，具有藻蓝色素的光谱特性；第三个峰的洗脱液呈浅蓝色，在280、340 nm以及620 nm均有特征吸收峰，含有少量藻蓝色素，可能是因为部分藻蓝色素与羟基磷灰石结合较为紧密，0.02 mol/L的PBS洗脱液强度难以将其洗脱下来，当洗脱液浓度增大到0.05 mol/L时，这部分组分被洗脱了下来；第四个峰为别藻蓝蛋白，分别在280、350 nm和650 nm有特征吸收峰，呈现出了别藻蓝蛋白的光谱特性，可见在本实验中，0.1 mol/L的PBS可将藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白分离开，此时溶液颜色为水蓝色；第五个峰主要是与羟基磷灰石吸附较为强烈的核酸类物质、维生素和少量已变性的藻蓝色素，洗脱色近乎无色。图5 二步盐析藻蓝色素的纯度和得率图6 藻蓝色素的层析曲线图7 每个峰组分的全波长扫描图abecced30405060708090020406080100硫酸铵饱和度/%得率/%2.02.22.42.62.83.0纯度 得率 纯度分析原因如下：在30%50%范围内，硫酸铵的加入量显著提高了藻蓝色素的得率，这是因为盐浓度的增加使藻蓝蛋白分子更充分地相互聚集从而沉淀下来；硫酸铵饱和度大于50%时，一步盐析中未除尽的杂蛋白也会被沉淀下来，从而使得纯度下降。在实验过程中我们还注意到，硫酸铵浓度过高(70%)时在溶液中无法完全溶解，因此会使局部盐浓度过高，破坏部分藻蓝蛋白使其变性，此外，离心后有少量藻蓝蛋白沉淀重新漂浮在溶液中，导致得率无法被完全检测到。综合考虑，当硫酸铵饱和度为50%时，藻蓝色素的得率为87.60%，纯度为2.69，分别为最佳值。此时藻蓝色素纯度对比一步盐析法提高了0.24。2.4 羟基磷灰石柱层析结果分析将1.3.5中处理好的样品上羟基磷灰石柱，收集洗脱液，得到洗脱曲线如图6所示，洗脱速度为1 mL/4 min，共得到5个洗脱峰，每个峰洗脱液的全波长扫描图见图7。分析得出以下结论：第一个1002003004005006007000.000.040.080.120.160.200.240.280.2 mol/L0.1 mol/L0.05 mol/L0.02 mol/L5432A280 nm洗脱体积/mL10.01 mol/L3004005006007000.00.10.20.30.4吸光度(Abs)波长/nm 峰1 峰2 峰3 峰4 峰5显而易见，图7峰2在620 nm左右峰值最高，而在280 nm左右吸光度值相对较低，从藻蓝色素的纯度计算公式可看出，其纯度得到大幅度提高，收集峰尖部分A620nm/A280nm4.0的洗脱液，经透析脱盐24 h后离心，再次检测A620nm/242 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期A280nm=4.37，达到了试剂级藻蓝色素的纯度要求。至此，通过一步盐析法、二步盐析法和柱层析法对原藻蓝色素进行了纯化，纯化过程对藻蓝色素的纯度和得率影响结果见表1。表1 不同纯化程序对藻蓝色素纯度的影响分离纯化程序A620/nmA280/nm纯度/(A620 nm/A280 nm)原藻蓝色素0.97400.54351.79一步盐析0.82850.33752.45二步盐析0.75770.28072.70HA柱层析0.35430.08104.372.5 纯化后藻蓝纯度鉴定SDS-PAGE结果：SDS-PAGE电泳图谱如图8所示，泳道3呈现出清晰的2条带，无其他杂蛋白印迹以及拖尾，结合图7峰2，说明纯化效果较好，2条带分别是藻蓝蛋白的亚基和亚基，分子质量约为17.2 ku和19.7 ku，与之前文献发现的亚基分子质量在1520 ku、亚基分子质量在1722 ku一致19。图8泳道3的条带较浅，分析原因可能是柱层析过程中上样浓度偏低以及连续的纯化程序造成部分藻蓝色素变性，因此藻蓝色素浓度较低，条带颜色较浅，不影响其纯度鉴定结果。峰，一般被认为是藻蓝蛋白结构中四吡咯色基的光吸收主峰。2.6 亚基结构97.4 66.2 43.0 31.0 22.0 14.4kuM123亚基亚基:MKTPLTEAVS IADSQGRFLSSTEIQVAFGRFRQAKAGLEA 40AKALTSKADS LISGAAQAVY NKFPYTTQMQ GPNYAADQRG 80KDKCARDIGY YLRMVTYCLI AGGTGPMDEY LIAGIDEINR120TFELSPSWYIEALKYIKANH GLSGDAATEA NSYLDYAINA 160LS 162:MFDAFTKVVS QADTRGEMLS TAQIDALSQM VAESNKRLDA 40VNRITSNASTIVSNAARSLFAEQPQLIAPG GNAYTSRRMA 80ACLRDMEIILRYVTYAVFAG DASVLEDRCL NGLRETYLAL 120GTPGSSVAVG VGKMKEAALA IVNDPAGITP GDCSALASEI160ASYFDRACAA VS172注：M为marker；1为原C-PC；2为盐析后的C-PC；3为柱层析后的C-PC。图8 藻蓝色素电泳图谱图10 亚基和亚基序列从RCSB PDB蛋白质数据库中得到亚基和亚基的序列如图10所示。由图10可知，编码亚基的氨基酸序列长度为162，起始氨基酸和终止氨基酸分别为Met和Ser；编码亚基的氨基酸序列长度为172，起始氨基酸和终止氨基酸也分别为Met和Ser。有研究认为，藻蓝蛋白的亚基和亚基具有45.9%99%的同源性，可能有共同的祖先；此外，由于亚基和亚基彼此间表现出较高的亲和力，形成异源二聚体，也称为单体，这些异源二聚体形成3个和3个亚基的异己烷，而2个异己基又聚集形成外源半聚体，这一结构的存在可能会在一定程度上拓宽藻蓝蛋白在医疗研究中的应用范围。藻蓝色素漂亮的蓝色来源于其结构中的藻蓝胆素，呈开链的四吡咯结构(图11)。通过SWISS-MODEL和PyMOL构建出的亚基和亚基的三维结构图如图12所示。可以清晰地看出，亚基和亚基上共包含3个共价连接到保守半胱氨酸残基上的PCB发色团，分别在亚基的Cys84和亚基的Cys82、Cys152上。研究发现，亚基紫外可见光谱分析结果：将经过纯化的藻蓝色素在200700 nm进行全波长扫描得到图9。由图9可知，在616 nm处有藻蓝色素的特征吸收峰；同时280 nm处为蛋白质的特征吸收峰，一般认为是蛋白结构中一些芳香族氨基酸引起的光吸收；360 nm处的微弱吸收峰和420 nm处的微弱肩3004005006007000.00.10.20.30.4吸光度(Abs)波长/nm280616图9 纯化后藻蓝色素的光谱分析图 243 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期Cys152上结合的PCB于多聚体外缘附近，并暴露于溶剂中，这在一定程度上使152位的色基更容易因环境变化而被破坏；而与亚基Cys84和亚基Cys82共价结合的发色团被包围在螺旋与螺旋间环中，位于多聚体内腔附近，从而远离周围的溶剂，更可能与连接蛋白相互作用20，参与多聚体之间的能量转移。3 结论藻蓝色素是螺旋藻中重要的活性成分，而大规模工业化提取得到的藻蓝色素中杂质较多。本研究建立了一套低成本高效率的纯化程序，通过17.5%及50%硫酸铵浓度两步盐析去除杂蛋白，再经透析和羟基磷灰石(HA)柱层析得到试剂级藻蓝色素，纯度(A620/A280)达4.37；纯化后的样品经光谱扫描，最大吸收峰在615625 nm之间；SDS-PAGE得到清晰可见的2条带为17.2 ku的亚基和19.7 ku的亚基；在氨基酸水平上对亚基和亚基的结构进行模拟，进一步了解环境影响藻蓝色素呈色的机制。实验结果可为后续藻蓝色素发色机制的深入研究及其应用提供参考。参考文献：1LUCAS B F,MORAIS M G D,SANTOS T D,et al.Spirulina for snack enrichment:Nutritional,physical and sensory evaluationsJ.LWT-Food Science&Technology,2018,90:270-276.2卓素珍,张虹.螺旋藻中藻蓝蛋白的生理功能及其提取纯化研究进展J.食品科技,2008,33(1):150-152.3于光,马宇翔,张成武,等.盐泽螺旋藻藻蓝蛋白的分离纯化J.食品与生物技术学报,2009,28(4):521-524.4于淑坤,岳思君,李敏,等.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白分离纯化J.食品科技,2019,44(5):248-252.5PATIL G,CHETHANA S,SINGH S A,et al.Method to obtain C-phycocyanin of high purityJ.Journal of Chromatography A,2006,1127(1-2):76-81.6ERIKSEN N T.Production of phycocyanin-a pigment with applications in biology,biotechnology,foods and medicineJ.Applied Microbiology and Biotechnology,2008,80(1):1-14.7王勇,钱凯先,董强.高纯度藻蓝蛋白分离纯化及光谱特性研究J.生物化学与生物物理进展,1999,26(5):457-460.8HSIEH-LO M,CASTILLO G,OCHOA-BECERRA M A,et al.Phycocyanin and phycoerythrin:Strategies to improve production yield and chemical stabilityJ.Algal 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