多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用_王芷.pdf

第 3 期第 53 卷工业微生物基金项目：上海市科技兴农项目（沪农科推字（2021）第 2-2 号）；上海市浦东新区科技发展基金（PKJ2022-N02）。作者简介：王芷（1997），女，硕士研究生，研究方向：环境微生物，E-mail:。*通讯作者：李保国（1961），男，工学博士，教授，研究方向：食品和农产品加工新技术，E-mail:。刘莉（1982），女，工学博士，副研究员，研究方向：环境微生物，E-mail:。多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用王芷1，邵毅恒1，李保国1*，刘莉2,3*1.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093；2.中国科学院上海高等研究院，上海 201210；3.上海有机固废生物转化工程技术研究中心，上海 200241摘要：次生盐渍化和土传病害是导致设施栽培连作障碍的主要因素，为了缓解设施栽培的连作障碍，从土壤中筛选多功能菌株并应用于连作障碍土壤中成为一种新的研究思路。文章通过对 12 株菌株的硝酸盐降解能力、产胞外聚合物（EPS）能力、降碱能力、抑菌能力进行验证，优选出硝酸盐降解能力最强的假单胞菌（Pseudomonas sp.）N11，EPS 产量最高的琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）S27，抑菌效果最好的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）Y2，并将其制成混合菌剂运用于次生盐渍化土壤中。实验组对土壤中硝酸盐的降解率可达 31.71%，而对照组仅为 15.28%，说明混合菌剂降盐效果显著。筛选出的多功能菌株，可有效改善连作障碍土壤的次生盐渍化和土传病害问题，为提高设施蔬菜栽培产量提供可靠的技术手段。关键词：土壤；连作障碍；硝酸盐；设施栽培；胞外聚合物doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.027第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023土壤次生盐渍化和土传病害普遍存在于设施栽培土壤中，是制约设施栽培产业发展的重要因素。次生盐渍化产生的原因是氮肥施用率过高导致大量无机氮主要以硝酸盐的形式存在于土壤中1-2，相比于露天栽培，设施栽培长期处于高温高湿的环境中，能够促进有机质的快速分解和盐离子的释放，从而加剧土壤次生盐渍化问题1-2。研究表明，土壤发生次生盐渍化后大量盐离子在土壤表层堆积，严重阻碍了作物根系的生长并限制其对养分的吸收3，从而影响设施栽培的产量和品质；土传病害是由于长期单一的种植模式导致土壤微生物结构遭到破坏，有益微生物减少，病原微生物富集，引发各种土传病害，从而造成设施栽培产量减少、质量下降，因此土壤次生盐渍化和土传病害成为设施栽培急需解决的问题。目前，解决土壤次生盐渍化问题的方法主要有物理修复和微生物修复4-5。物理修复主要包括灌溉洗盐、土壤更换、地膜覆盖。灌溉洗盐通常采用滴灌和渗灌的灌溉方式，二者均能有效降低土壤盐分含量，缓解盐渍化趋势；但灌溉洗盐只是一种暂时性的解决方法，因为该方法会使硝酸盐渗到地下水中造成二次污染，而且设施栽培条件下温度较高，硝酸盐会随着蒸发运动重新回到土壤表层6-8。土壤更换指的是取出已发生次生盐渍化的设施土壤，重新换入新的栽培基质。地膜覆盖是在保护地的内畦面上覆盖地膜以抑制表土积盐9-10。解决土传病害问题的方法主要有物理修复、化学修复和微生物修复。物理修复主要有土壤暴晒消毒，通过土壤暴晒，降低病原微生物的生存繁殖能力和致病力；但物理修复一般不能有效长期地改善土壤次生盐渍化和土传病害的问题，且劳动强度大，易造成二次污染3,11-12。化学修复主要指使用化学农药，如甲霜灵、杀毒矾等，是人们广泛使用的手段，但长期不合理的使用化学农药会造成环境污染，破坏土壤的自我修复能力。微生物修复主要通过施用有益微生物菌肥来减少土壤中硝酸盐累积、抑制病原微生物的生长繁殖，从而改善土壤104-第 3 期第 53 卷王芷等：多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用的理化性质和生物性状；微生物修复具有无公害、无污染、成本低等优势，生产工艺较为简单，有助于保持生态平衡，并对作物具有促生作用。针对土壤次生盐渍化和土传病害等问题，本研究首先从土壤中筛得硝酸盐降解菌和土传病害拮抗菌，根据菌株形态学、生理生化特征和分子生物学方法对菌株进行鉴定，并对筛得的菌株的生长特性和土壤硝酸盐降解能力进行评价，以期为解决设施土壤连作障碍问题提供理论支持。1材料与方法1.1试验材料1.1.1 种子和供试菌株实验种子采用上海青种子。本实验室通过平板筛选从土壤中获得了 N11、N23、N2、N6、N3、Y1、Y33、Y2、S13、S27、S31、S2 菌株。病原菌：设施栽培中的土传病害主要有青枯病、软腐病和枯萎病。青枯病主要由青枯菌（Ralstoniasolanacearum）引起；软腐病主要由软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）引起；枯萎病主要由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起。青枯菌（Ralstonia solanacearum）来自中国农业微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心；果 胶 软 腐 杆 菌（Pectobacterium carotovorum）来自中国普通微生物菌 种 保 藏 管 理 中 心；尖 孢 镰 刀 菌（Fusariumoxysporum）来自海南大学热带农林学院农药实验室；1.1.2培养基LB 培养基（g/L）：酵母 5、蛋白胨 10、NaCl 10、pH 7.0。固体培养基中琼脂的添加量为 1.5%2%。好氧硝酸盐降解菌的发酵培养基（g/L）：KNO31、K2HPO47.9、KH2PO41.5、葡萄糖 10、MgSO4 7H2O0.1、CaCl20.001、FeSO4 7H2O 0.01。产 EPS 菌株发酵培养基（g/L）：蔗糖 20、K2HPO40.2、KH2PO40.5、NaCl 100、MgSO4 7H2O 0.5、酵母 3。马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（g/L）：马铃薯浸出液 200、葡萄糖 20、琼脂粉 15。pH=10 的 LB 培养基：在 LB 培养基的基础上，用碳酸钠调节 pH 为 10。1.1.3供试土壤土壤为次生盐渍化土壤，采自上海市奉贤区光明五四农场；供试土壤的基本理化性质如表 1 所示。表 1供试土壤的理化性质1.2菌株筛选1.2.1好氧硝酸盐降解菌的筛选将筛得的菌株活化富集，接入以硝态氮为唯一氮源的好氧硝酸盐降解菌的发酵培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养 96 h，测定不同菌株对NO3-N 含量的影响，硝酸盐降解率如式（1）所示。=c0-c96c0100%（1）式中：为硝态氮降解率，%；c0为 0 h 的硝态氮浓度，mg/L；c96为 96 h 的硝态氮浓度，mg/L。1.2.2产 EPS 能力将筛得的菌株活化富集，接入产 EPS 菌株的发酵培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养 72 h。然后将发酵液以 7 000 r/min 的转速离心 10 min，保留上清液，将菌体置于 105 烘箱中烘至恒重。在上清液中加入 3 倍 95%乙醇于 4 下过夜醇沉，混合液 4 000 r/min 离心 30 min，去除上清液，将沉淀置于 105 烘箱中烘至恒重13-14。产 EPS 的量和菌株干重的比值就是单位重量菌株的 EPS 的产量。1.2.3抑菌试验（1）平板对峙试验15用直径为 6 mm 的打孔器在长满 Fusariumoxysporum 的平板上打孔，将病原菌块倒置在 PDA平板中央，用灭菌的牙签挑取少许分离纯化后的单菌落点接在离病原菌块 25 mm 处对称的四周，PDA 平板中央只放置病原菌菌饼，周围不点接待测菌株作为对照组，30 培养直到对照组病原菌长至满板，记录对照与处理组菌落直径。抑菌率计算按式（2）。抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径100%（2）（2）滤纸片抑菌试验16取 100 L Ralstonia solanacearum 和 Pectobacterium carotovorum 病原菌菌悬液涂布于 LB 固体培养基上，制成含菌平板。用打孔器制成直径为 6 mmpH有机质/（g kg-1）有效磷/（mg kg-1）速效钾/（mg kg-1）硝态氮/（mg kg-1）全盐量/（g kg-1）7.790.1418.001.3475.001.87290.008.26252.002.213.140.04105-第 3 期第 53 卷工业微生物的滤纸圆片，将滤纸片灭菌后，放置在 OD600=1.2 的菌液中浸泡 10 min，取出滤纸片平贴于上述含菌平板上，将平板倒置放入30 恒温培养箱中培养 24 h，用游标卡尺以十字交叉法测量抑菌圈直径。每组做三个平行试验，计算抑菌圈直径平均值。1.2.4降碱能力将筛得的菌株活化富集，接入 pH=10 的 LB 液体培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养 24 h，测定各个样品中 pH 的变化。菌株的降碱率由式（3）计算。=pH前-pH后pH前100%（3）式中：为降碱能力，%；pH前为发酵前培养基的pH；pH后为发酵前培养基的 pH17。1.2.5菌种的鉴定用 16S rRNA 序列比对法，采用细菌通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5 GGTTACCTTGTTACGACTT-3）进行PCR 扩增，送至上海杰李生物技术有限公司进行纯化测序。1.3菌株硝酸盐降解效果的测定将 5%的菌株接种在 100 mL 以硝酸钾为唯一氮源、葡萄糖为唯一碳源的好氧硝酸盐降解菌的发酵培养基中，30、200 r/min 恒温摇床培养，分别于0、6、12、24、36、48、72、96 h 时取样测量 OD600、NO3-N、NO2-N、NH4+-N 的浓度变化18。1.4混合菌剂在不同硝态氮浓度下对上海青种子发芽的影响将菌株以 5%的接种量接入 LB 液体培养基中于 30、200 r/min 条件下培养 24 h，将培养好的发酵液以 7 000 r/min 的速度离心 10 min 后去除上清液，用无菌水重悬成 OD600=0.5 的重悬液。将筛得的菌株以等比例制成混合菌液。挑选大小一致的上海青种子，用 75%的乙醇消毒 3 min，之后用无菌水清洗干净。将处理后的种子于室温下在混合菌液中浸泡 3 h。选用无菌培养皿，其中含有不同硝酸盐浓度（0、50、100、150、250、500、750、1000 mg/L）的潮湿无菌滤纸，每组重复 3 次，对照组用无菌水浸泡。所有培养皿均在 30 温室培养箱中培育。4 d 后，统计发芽种子数量计算发芽率（GR），并测量发芽种子的根长和茎长。利用式（4）计算简化活力指数（SVI）。SVI=（平均根长+平均茎长）GR（4）1.5混合菌剂对土壤中硝酸盐的降解采集次生盐渍化较为严重的土壤，往其中添加混合菌剂，监测其对土壤硝酸盐含量的影响。将采集的土壤过 5 mm 筛后混匀，每个瓶中装入 300 g 次生盐渍化土壤。实验设置为 2 个组：（1）对照组（CK），不加入菌液；（2）实验组（T），接种混合菌液。每个处理重复三次操作19-21。混合菌液浓度为 1.2107CFU/mL。将菌液加入装有盐渍化土壤的无菌瓶中，对照组加无菌水，放入恒温培养箱中 25 培养4 周，每周定时取样测定土壤中硝酸盐含量。1.6测定方法OD600采用吸光度法测定；NO3-N 采用紫外分光光度法；NO2-N 浓度采用 N-（1-萘基）-乙二胺光度法（GB 7493-87）；NH4+-N 浓度采用纳氏试剂分光光度法；TN 浓度采用 TOC/TN 仪测定。2结果与分析2.1多功能菌株的筛选2.1.1好氧硝酸盐降解菌的筛选对从土壤中筛出的 12 株菌株进行好氧硝酸盐降解性能测定，如图 1 所示。从图 1 可以看出，这 12株菌株中有 6 株对硝态盐的降解效果较好，分别为N3、N6、S31、N2、N23、N11，其中 N11 对硝态盐的降解率最高，达到了 99.72%。图 1好氧硝态氮转化菌对硝态氮的降解效果100806040200Y33 Y1S13 Y2 S27 S31 S2 N11 N3N2N6 N23菌株名称106-第 3 期第 53 卷2.1.2N11 菌株降解硝态盐分析在以硝态氮为唯一氮源的培养基中培养 N11菌株，研究培养基中 NO3-N、NO2-N、NH4+-N 和 TN含量的变化。如图 2 所示，648 h 为 N11 菌株的生长对数期。当菌株生长至 24 h 时，培养基中的 NO3-N 被消耗殆尽。NO2-N 含量在 612 h 时有所增加，12 h 后 NO2-N 开始减少，24 h 时含量基本为 0。NH4+-N 含量在对数期时呈现先增加后减少的趋势。综上，菌株 N11 在生长对数期时，NO3-N 被完全降解，NO2-N 先上升后下降，但总量没有积累，NH4+-N 含量也呈现先上升后下降的趋势，但培养基中 NH4+-N 含量有所积累。因此，可以推测 NH4+-N的产生是由 NO3-N 先转化 NO2-N 最后还原成NH4+-N，菌株 N11 在好氧培养条件下以硝酸盐还原成铵为主要途径3。2.1.3菌株产 EPS 能力的验证EPS 是微生物在一定条件下分泌出体外的一种高分子聚合物，能通过力的作用与土壤中的离子结合，从而减轻盐离子对作物的毒害作用22。对从土壤中筛得的 12 株菌株进行产 EPS 能力的验证（见表2），其中 4 株菌 EPS 的产量在 0.1 g/g 以上，菌株 Y2的 EPS 产量最高，为 0.462 1 g/g，剩余 8 株菌株产EPS 的能力较弱。表 2菌株产 EPS 能力的验证2.1.4菌株抑菌效果的验证存在于设施栽培中的土传病害主要有青枯病、软腐病和枯萎病。青枯病主要由青枯菌（Ralstonia图 2N11 菌株生长变化（A）、硝态氮（B）、亚硝态氮（C）、铵态氮（D）含量的变化序号菌株名称EPS产量/（g g-1）序号菌株名称EPS产量/（g g-1）1Y20.462 10.097 97N230.065 10.052 02Y10.166 90.027 98N60.050 90.047 03N110.114 60.023 59N20.029 30.035 24Y330.112 20.064 910S270.023 30.002 95S310.095 30.001 811S20.020 50.022 46N30.083 50.044 412S130.020 10.017 3王芷等：多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用4.03.53.02.52.01.51.00.50.0020406080100时间/hABCD020406080100时间/h020406080100时间/h020406080100时间/h140120100806040200201510503.02.52.01.51.00.50.0107-第 3 期第 53 卷工业微生物solanacearum）引起；软腐病主要由软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）引起；枯萎病主要由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起。通过平板对峙实验，本研究以上述 3 种导致常见土传病害问题的病原菌为供试菌株，对实验室筛得的 12 株菌株进行了抑菌效果的验证。以 Fusarium oxysporum 为病原菌进行验证，测得 S13、S2、S27 对其抑菌效果较好（如图 3），抑菌率分别为 58.82%、61.18%、64.71%。图 3菌株对 Fusarium oxysporum 的抑菌效果以 Ralstonia solanacearum 为病原菌进行验证，测得 S27、S13、N6、S31、S2、N11 对其抑菌效果较好（如图 4），抑菌直径分别 15、12、12、11.5、11、11 mm。图 4菌株对 Ralstonia solanacearum 的抑菌效果以 Pectobacterium carotovorum 为病原菌进行验证，测得 S13、S2、S27、N23、Y2、N2 对其抑菌效果较好（如图 5），抑菌直径分别 14.5、13、16、11.5、10.5、10.5 mm。图 5菌株对 Pectobacterium carotovorum 的抑菌效果综上可知，S13 和 S27 对三种常见病原菌均有一定的抑制效果，表现出广谱抗性，其中 S27 的抑菌效果显著。2.1.5菌株降碱能力的验证对从土壤中筛得的 12 株菌株进行降碱能力的验证（见表 3）。结果表明每隔 12 h 测定其 pH 的变化，其中 N2 的降碱效果最好，达到了 9.34%；S31 的降碱效果最差。在整个菌体生长过程中，菌株的降碱能力均在 24 h 时达到最高。表 3菌株降碱能力的验证2.1.6菌株生理性能根据以上 4 种菌株生理功能综合评价，如表 4所示，选出降解硝态氮效果最好的 N11、EPS 产量最高的 Y2 和抑菌效果最好的 S27 进行后续实验。表 4菌株生理性能2.2优势菌株的鉴定将菌株 N11、S27、Y2 进行 16S rRNA 基因测序，序号菌株名称降碱能力/%序号菌株名称降碱能力/%1Y28.630.357N29.340.282Y16.590.228S277.970.623N117.450.049N234.080.414Y336.700.0610N67.100.185S313.590.0211S135.880.166N36.140.5712S27.970.45菌株名称硝态氮降解率/%尖孢镰刀菌抑菌率/%青枯菌抑菌直径/mm果胶软腐杆菌抑菌直径/mmEPS 产量/（g g-1）降碱率/%Y25.4012.949.510.50.462 10.097 98.630.35S139.3358.8212.014.50.020 10.017 35.880.16Y339.499.41-0.112 20.064 96.700.06S221.0461.1811.013.00.020 50.0427.970.45Y125.389.41-10.00.166 90.027 96.590.22S2734.3964.7115.016.00.023 30.002 97.970.62N373.3914.12-8.50.083 50.044 46.140.57N681.3910.5912.010.00.050 90.047 07.100.18S3187.909.4111.59.00.095 30.001 83.590.02N293.6112.94-10.50.029 30.035 29.340.28N2395.2914.12-11.50.065 10.052 04.080.41N1199.7249.4111.0-0.114 60.023 57.450.04FusariumoxysporumS13S2S27RalstoniasolanacearumS27S13N6S31S2N11PectobacteriumcarotovorumS13S2S27N23Y2N2108-第 3 期第 53 卷显著性0501001502505007501000处理浓度 处理浓度根长/cmCK2.310.38 Aa2.070.17 ABa1.520.33 BCb1.690.38 ABb0.940.18 CDb0.440.08 Db0.340.08 Da0.330.09 Da*T2.580.10Aa2.390.18BCa2.250.29Aa2.210.43Aa1.610.10Ba0.850.07Ca0.600.10Ca0.440.09Ca茎长/cmCK0.980.06Aa0.970.06Aa0.820.04ABa0.580.14BCb0.410.08CDb0.250.10Db0.330.19CDa0.220.07Da*T1.030.05Aa1.140.15Aa0.910.16ABa0.870.07ABCa0.830.13ABCa0.580.04BCDa0.510.17CDa0.330.17Da发芽率/%CK96.675.77Aa90.005.77ABCa93.335.77ABa83.335.77ABCb76.675.77CDb80.000.00BCDa66.675.77Da36.675.77Ea*T100.000.00Aa96.670.00ABa100.000.00Aa93.335.77ABa96.675.77ABa83.335.77Ba66.675.77Ba43.335.77DaSVI/（mL g-1）注：小写字母表示不同处理之间的显著性差异，大写字母表示不同浓度之间的显著性差异，P0.05。处理硝酸盐浓度/（mg L-1）CK318.7344.93 Aa273.7512.42 Ab219.5739.91 Ab190.2252.90 Bb104.5726.06 Bb55.3812.94Cb43.5512.71Ca20.314.29Ca*T361.565.80Aa341.7237.28 Aa316.7816.77 Aa288.9258.90 ABa235.3314.05 Ba119.198.15Ba74.2221.27CDa33.6812.64Da表 7混合菌剂对上海青发芽效果的影响与 GenBank 数据库中的序列进行比对，得到各序列的同源性信息见表 5。各菌株的形态见图 6，由图 6可知菌株 N11 为革兰氏阴性菌，呈杆状；菌株 S27为革兰氏阳性菌；菌株 Y2 为革兰氏阴性菌，呈现杆状并成对出现。菌株生理生化特性如表 6，N11 能利用葡萄糖、甘露醇和丙二酸盐，能发生硝酸盐还原反应，生成尿素酶和氨基酸脱羧酶；S27 能利用葡萄糖、甘露糖、甘露醇作为碳源，能发生明胶水解反应和 VP 反应；Y2 能利用葡萄糖和丙二酸盐，能产生尿素酶和氨基酸脱羧酶。因此，根据基因比对、形态鉴定和生理生化特性，菌株 N11 鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.，菌株 S27 鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，菌株 Y2 鉴定为琼氏不动杆菌 Acinetobacter junii。表 5优势菌株鉴定结果图 6N11、S27、Y2 的镜检图表 6优势菌株生理生化特性指标菌株N11S27Y2葡萄糖+甘露糖-+-棉子糖-甘露醇+-丙二酸+-+硝酸盐还原+-硫化氢试验-明胶水解-+-尿素酶+-+氨基酸脱羧酶+-+苯丙氨酸脱羧酶-甲基红试验-VP 反应-+-菌株名称鉴定物种名NCBI 登录号同源性中文译名N11Pseudomonas sp.MH915623.199.93%假单胞菌S27BacillusamyloliquefaciensCP044444.1100%解淀粉芽孢杆菌Y2Acinetobacter juniiCP019041.199.72%琼氏不动杆菌王芷等：多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用N11S27Y2109-第 3 期第 53 卷工业微生物2.3不同硝酸盐浓度下混合菌剂对上海青发芽效果的影响不同的硝酸盐浓度下混合菌剂对上海青的发芽率、根长、茎长、SVI 的影响如表 7 所示。由表 7 可知，随着硝酸盐含量的增长，植株的生物量总体上呈现下降趋势。当硝酸盐浓度为 150、250 mg/L 时，实验组植株的根长、茎长、发芽率和 SVI 显著提高。硝酸盐浓度为 250 mg/L 时，与对照组相比，实验组植株的根长、茎长、发芽率和 SVI 分别提高了 71.28%、102.4%、26.09%、125.05%，表明接种菌株能够有效缓解盐胁迫抑制植株生长的作用23。当硝酸盐浓度较低时，实验组和对照组无明显差异，表明较低的硝酸盐浓度对植株的迫害效果较轻。当硝酸盐浓度高于 500 mg/L 时，实验组与对照组对植株生物量的影响无显著性差异，可能是因为在较高浓度的硝酸盐含量下，混合菌株受到抑制而无法发挥作用，并且在较高的盐浓度下，植株本身无法生长。实验表明，混合菌剂可以有效缓解硝酸盐对上海青发芽的抑制作用，从而促进上海青生长。2.4混合菌剂对土壤硝酸盐的降解将混合菌剂接种在含有较高硝酸盐含量的土壤中，考察其对土壤中硝酸盐的降解。如图 7 所示，随着时间的增长，实验组土壤中硝酸盐的含量显著降低，第 28 天与第 0 天相比，土壤中硝酸盐含量降低了 31.71%，而对照组仅降低了 15.28%。这一结果充分说明混合菌剂对土壤中硝酸盐具有一定的降解作用。图 7接种混合菌剂后硝酸盐含量的变化3讨论目前报道的好氧硝酸盐降解菌大部分属于细菌，主要分布在假单胞菌属、产碱杆菌属等24。王贺等25发现了一株恶臭假单胞菌 DS2，其具有环境适应性强、脱氮效率高等特点，对硝酸盐的降解率达到5.51 mg/（L h）。林浩澎等26筛得一株耐碱变性假单胞菌 ZY-3，对硝酸盐的降解率可达 88.44%。本研究从土壤中筛出 12 株菌株对其进行多功能验证，测得一株假单胞菌（Pseudomonas sp.）N11 对硝酸盐降解率达到 99.72%。细菌可以分泌包括多糖、蛋白等大分子在内的胞外聚合物（EPS），EPS 中含有羧基、羟基、氨基等基团，对离子具有良好的生物吸附性能，从而促进土壤中盐离子的固定。马贵党等27发现不动杆菌属在铜浓度为 150 mg/L 时，可产生 122.4mg/g 的 EPS。而本研究筛 得的琼氏 不 动杆 菌（Acinetobacter junii）Y2 的 EPS 产量可达 462.1mg/g，能够有效降低土壤中游离盐离子的浓度。解淀粉芽孢杆菌可通过产生脂肽类化合物、聚酮类化合物、细菌素等物质对土壤中的致病菌产生拮抗作用，从而抑制病原菌在土壤中的定殖28。本文筛得的解淀粉 芽 孢 杆 菌（Bacillus amyloliquefaciens）S27 对Fusarium oxysporum 的 抑 菌 率 达 到 64.71%，对Ralstoniasolanacearum和Pectobacteriumcarotovorum 这 2 种不同病原菌的抑菌直径分别为15、16 mm，有效抑制了病原菌的生长。将假单胞菌 N11、琼氏不动杆菌 Y2 和解淀粉芽孢杆菌 S27 这 3 株菌株制成混合菌剂，能够增加上海青种子的发芽率和简化活力数，显著降低土壤中硝酸盐含量。将其应用于次生盐渍化土壤中，有望改善因次生盐渍化而导致的设施蔬菜连作障碍问题。4结论（1）从土壤中筛得 12 株菌株对其进行多功能验证，发现 N11 对硝态氮的降解可达 99.72%，Y2 产EPS 的 能 力 可 达 462.1mg/g，S27 对 Fusariumoxysporum，Ralstoniasolanacearum、Pectobacteriumcarotovorum 均有一定的抑菌效果。经鉴定 N11 为假单胞菌 Pseudomonas sp.；S27 为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；Y2 为 琼 氏 不 动 杆 菌Acinetobacter junii。4003002001000CKT07142128时间/daaaaaabbbb110-第 3 期第 53 卷（2）N11、S27、Y2 制成的混合菌剂，在硝酸盐浓度为 250 mg/L 时，使上海青种子的发芽率、根长、茎长和 SVI 分别提高了 26.09%、71.28%、102.4%、125.05%，具有显著的促生效果。（3）N11、S27、Y2 制成的混合菌剂能显著降低土壤中硝酸盐含量，使土壤中硝酸盐含量降低了31.71%，而对照组仅为 15.28%。参考文献1KIM D H,CHO J M,BAEK K.Pilot-scale ex situelectrokinetic restoration of saline greenhouse soilJ.Journal of Soils and Sediments,2011,11(6):947-958.2CHO J M,KIM D H,YANG J S,et al.ElectrodeConfiguration for Electrokinetic Restoration of GreenhouseSaline Soil J.Separation Science and Technology,2012,47(11):1677-1681.3 初少华.巨大芽孢杆菌对次生盐渍化土壤硝酸盐的转化途径及其机理研究 D.上海:上海交通大学,2019.4 赵明范.世界土壤盐渍化现状及研究趋势 J.世界林业研究,1994,(01):84-86.5 陈思奇,蒋毓婷.设施土壤次生盐渍化的成因、危害及治理措施 J.辽宁化工,2018,47(11):1146-1148.6 NL M,KANBER R,ENYIGIT U,et al.Trickle andsprinkler irrigation of potato(Solanum tuberosum L.)in theMiddle Anatolian Region in Turkey J.Agricultural WaterManagement,2006,79(1):43-71.7 ROUPHAEL Y,CARDARELLIM,REA E,etal.Comparisonofthesubirrigationanddrip-irrigationsystemsforgreenhousezucchini squash production using saline and non-salinenutrient solutionsJ.Agricultural Water Management,2006,82(1):99-117.8YUAN B Z,SUN J,NISHIYAMA S.Effect of DripIrrigation on Strawberry Growth and Yield inside a PlasticGreenhouse J.Biosystems Engineering,2004,87(2):237-245.9 伍兰萍.设施栽培蔬菜连作障碍成因分析及其防治措施 J.江西农业,2016,(07):5-7.10 郭军,顾闽峰,祖艳侠,等.设施栽培蔬菜连作障碍成因分析及其防治措施 J.江西农业学报,2009,21(11):51-54.11 杨静.设施次生盐渍化土壤盐分特征及碳调节剂降盐效果研究 D.扬州:扬州大学,2018.12 张春华.硝态氮转化菌的筛选鉴定及其转化效率研究D.上海:上海交通大学,2011.13NUNKAEW T,KANTACHOTE D,NITODA T,et al.Characterization of exopolymeric substances from selectedRhodopseudomonas palustris strains and their ability toadsorb sodium ions J.Carbohydrate Polymers,2015,115:334-341.14 孙雪,董永华,王娜,等.耐盐碱促生菌的筛选及性能J.生物工程学报,2020,36(07):1356-1364.15 崔文会,孙雪,梁承宇,等.土传真菌病害拮抗菌的筛选及其生防效果研究 J.工业微生物,2020,50(02):41-47.16 张斯颖,陈宇丰,骆焱平,等.丛生盔形珊瑚共附生放线菌 NLG-3 的抑菌活性及鉴定 J.西北农林科技大学学报(自然科学版),2019,47(10):97-105.17 燕红,钟方,高新亮,等.耐盐碱菌株的分离筛选及生物学特性和盐碱去除效率的研究 J.生态学杂志,2012,31(04):1000-1008.18SHI W,ZHANG C,ZHI Y,et al.Transformation ofNitrate Nitrogen by Three Strains of Bacteria Isolatedfrom Facility Culturing Soils C.the Fourth InternationalConferenceonBioinformaticsandBiomedicalEngineering,2010:4158-4161.19 YOU Y,CHU S,CHI Y,et al.How bacteria remediatesoil nitrate for sustainable crop production J.Journal ofCleaner Production,2021,328.20 YOU Y,CHI Y,CHEN X,et al.A sustainable approachfor bioremediation of secondary salinized soils:Studyingremediation efficiency and soil nitrate transformation bybioaugmentation J.Chemosphere,2022,300:134580.21 李圣会,蒋代华,余丰源,等.土壤耐硒菌株筛选及其硒活化能力评价研究 J.土壤通报,2022,53(03):558-566.22 姜焕焕,王通,陈娜,等.根际促生菌提高植物抗盐碱性的研究进展 J.生物技术通报,2019,35(10):189-197.23 李章雷,刘爽,王艳宇,等.5 株耐盐碱促生细菌的筛选鉴定及其对红小豆的促生作用 J.微生物学通报,2021,48(05):1580-1592.24 沈桐,江进,李宁,等.好氧反硝化细菌及其在微污染水源水修复中的应用研究进展 J.微生物学报,2023,63(02):465-482.25 王贺,衣萌萌,王淼,等.一株高效好氧反硝化菌 DS2的分离鉴定及脱氮特性 J.农业生物技术学报,2022,30(10):1997-2008.26 林浩澎,孙慧明,罗娉婷,等.一株耐碱变形假单胞菌王芷等：多功能菌株的筛选及其在次生盐渍化土壤中的应用111-第 3 期第 53 卷工业微生物ZY-3 的鉴定及其脱氮特性 J.微生物学通报,2022,49(10):4066-4079.27 马贵党,李崇华,王飞,等.一株铜抗性细菌的分离鉴定及其耐铜机制 J.应用与环境生物学报,2019,25(02):392-398.28 郭玥岐,周丽洪,龚利娟,等.解淀粉芽孢杆菌在农业领域的研究与应用 J.四川农业科技,2022,(08):80-84,110.AbstractSecondary salinization and soil borne diseases are the main factors leading to continuous cropping obstacles in facilitycultivation.In order to alleviate the continuous cropping obstacles in facility cultivation,screening multifunctional strains from soil andapplying them to continuous cropping obstacle soil has become a new research approach.The article verifies the nitrate degradationability,extracellular polymer(EPS)production ability,alkalinity reducing ability,and antibacterial ability of 12 strains,and selectsPseudomonas sp.N11 with the stronges