基于NF-κB与NRF2_ARE通路探索紫杉醇-比伐卢定介入涂层抗血管再狭窄的有效性及分子机制.pdf

基础研究基于 NF-B 与 NRF2/ARE 通路探索紫杉醇-比伐卢定介入涂层抗血管再狭窄的有效性及分子机制李红梅1，王婷1，李海燕2（1.北京中医药大学生命科学学院整合医学中心,北京100029；2.北京市和平里医院心内科,北京100013）摘要：目的明确紫杉醇-比伐卢定介入涂层（LuoFengning，LFN）对管腔再狭窄的影响及分子机制。方法体内动物实验分组：WT 假手术组、WT 血管拉伤组、NRF2-/-血管拉伤组、NF-B-/-血管拉伤组、WT 血管拉伤+LFN 干预组、NRF2-/-血管拉伤+LFN 干预组、NF-B-/-血管拉伤+LFN 干预组；体外细胞实验分组：第一批分组：Control 组、LPS 造模组、LPS+LFN 组、LPS+LFN+NF-B 敲减组、LPS+LFN+IB 敲减组、LPS+LFN+NF-B 过表达组、LPS+LFN+IB 过表达组。第二批分组：Control 组、LPS 造模组、LPS+LFN 组、LPS+LFN+NRF2 敲减组、LPS+LFN+Keap1 敲减组、LPS+LFN+NRF2 过表达组、LPS+LFN+Keap1 过表达组。采用 HE 染色法检测血管组织病理变化、免疫荧光染色检测血管组织增殖活性、CCK-8 法检测细胞增殖率、Transwell 法检测细胞迁移和侵袭能力、Q-PCR 和 Westernblot 法测定血管组织和细胞中 NF-B 与 NRF2/ARE 通路关键靶标及配体的基因和蛋白表达。结果LFN 对血管拉伤模型大鼠的血管内膜增生过程具有显著抑制作用，可在有效阻断管腔再狭窄的同时拮抗血栓形成。与 WT 血管拉伤组相比，LFN 干预后可上调 IB、NRF2、NQO-1 和 HO-1 基因与蛋白表达（P0.05，P0.01），下调 Keap-1 基因和蛋白表达量（P0.05，P0.01），此调控作用在 NRF2-/-突变型大鼠中可被逆转。NF-B、NRF2 及其配体敲减或过表达可影响 LFN 对 HCASMC 模型迁移和侵袭能力的拮抗作用，并可不同程度削弱其对细胞内 NF-B 与 NRF2/ARE 通路关键蛋白和基因表达的调控能力。结论LFN 抗血管再狭窄具备体内应用有效性，该效应的部分机制是 LFN 通过对 NF-B 和 NRF2/ARE 通路上核转录因子及其关键配体的表达进行双通道正反两个方向的统一调控而实现。关键词：紫杉醇-比伐卢定复合物；介入器械涂层；再狭窄；NF-B 与 NRF2/ARE 通路；分子机制中图分类号：R95文献标识码：A 文章编号：1009-7236(2024)02-0135-09DOI：10.12125/j.chj.202307039开放科学(资源服务)标识码(OSID):网络出版地址：http:/ and molecular mechanism of paclitaxel-bivalirudininterventional coating complex against vascular restenosis based on NF-B and NRF2/ARE pathwaysLI Hong-mei1，WANG Ting1，LI Hai-yan2(1.IntegratedMedicalCenter,SchoolofLifeScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China；2.DepartmentofCardiology,BeijingHepingliHospital,Beijing100013,China)Abstract:AIMToinvestigatetheeffectofpaclitaxel-bivaludininterventionalcoatingcombination(LFN)onvascularrestenosisanditsmolecularmechanism.METHODSInvivoanimalexperimentgrouping:WTshamsurgerygroup,WTvascularstraingroup,NRF2-/-vascularstraingroup,NF-B-/-vascular strain group,WT vascular strain+LFN intervention group,NRF2-/-vascular strain+LFNintervention group,and NF-B-/-vascular strain+LFN intervention group;In vitro cell experimentgrouping:Firstbatchofgroups:Controlgroup,LPSmodelinggroup,LPS+LFNgroup,LPS+LFN+NF-基金项目：北京市自然科学基金面上项目（7222279）；国家自然科学基金青年项目（81903955）通讯作者：李红梅，副研究员，主要从事中医药与介入心脏病学研究和中医再生医学研究Email：心脏杂志（ChinHeartJ）2024，36（2）135Bknockdowngroup,LPS+LFN+IBknockdowngroup,LPS+LFN+NF-Bover-expressiongroup,andLPS+LFN+IBover-expressiongroup.Secondbatchofgroups:Controlgroup,LPSmodelinggroup,LPS+LFN group,LPS+LFN+NRF2 knockdown group,LPS+LFN+Keap1 knockdown group,LPS+LFN+NRF2over-expressiongroup,andLPS+LFN+Keap1over-expressiongroup.ThepathologicalchangesofvasculartissueweredetectedusingHEstaining,theproliferationactivityofvasculartissuewasdetectedusingimmunofluorescencestaining,thecellproliferationratewasdetectedusingtheCCK-8method,thecellmigrationandinvasionabilitywasdetectedusingtheTranswellmethod,andthegeneandproteinexpressionsofimportanttargetsandligandsoftheNF-BandNRF2/AREpathwaysweredeterminedinvasculartissuesandcellsusingQ-PCRandWesternblot.RESULTSInvascularstrainmodelrats,LFNsignificantlyinhibitedintimalhyperplasia,whicheffectivelypreventedlumenrestenosisandcombatedthrombosissimultaneously.LFNup-regulatedtheexpressionsofIB,NRF2,NQO-1andHO-1genesandproteinscomparedwiththoseinWTvascularstraingroup(P0.05,P0.01),butdown-regulatedtheexpressionsofKeap-1genesandproteins(P0.05,P0.01),whichwerereversedinNRF2-/-mutantrats.TheantagonisticeffectofLFNontheHCASMCmodelscapacityformigrationandinvasionwasaffectedbyNF-B,NRF2,withitsligandsbeingknockeddownorover-expressed.Thisalso,tovariabledegrees,impairedLFNscapacitytoregulatetheproductionofcrucialproteinsandgenesintheNF-BandNRF2/AREpathwaysincells.CONCLUSIONLFNisefficaciousinvivoagainstvascularrestenosisandpartoftheeffectisachievedbytheunifiedregulationoftheexpressionsofNF-BandNRF2/AREnucleartranscriptionfactorsandtheiressentialligands.Key words:paclitaxel-bivalirudincomplex；interventionaldevicecoating；restenosis；NF-BandNRF2/AREpathways；molecularmechanism经皮冠状动脉介入治疗（percutaneouscoronaryintervention，PCI）加支架置入术是冠心病治疗的主要手段，然而 PCI 术后支架内再狭窄仍然是影响临床远期疗效的重要问题1。随着药物涂层支架的出现，血管再狭窄发生率明显降低，但由于药物支架在许多复杂病变中广泛使用，其再狭窄率仍高达 5%10%2，这提示我们亟需寻找更有效的方法来进一步拮抗 PCI 术后再狭窄的发生。血管再狭窄的细胞病理学基础主要聚焦于血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）。有研究表明，PCI 术后冠脉炎症3和氧化应激4微环境与再狭窄的形成密切相关，PCI 支架置入过程中会引发血管局部炎症反应，刺激多种细胞因子释放，诱导 VSMC 从收缩型转化为分泌型，转型后的细胞通过内弹力膜从血管中膜向内膜迁移和增殖，同时分泌大量细胞外基质引发内膜新生5，如何最大限度地抑制 VSMC 异常增殖迁移是防治 PCI 术后管腔再狭窄的关键。研究表明，血管炎症环境下，经典的TLR4/NF-B 信号转导通路活化，失调的 NF-B 可进一步促使炎症因子释放，加速 VSMC 的增殖、迁移和表型转变6，加剧管腔再狭窄。往往伴随炎症过程都有氧化应激的参与，在氧化应激或内质网激动时，抗氧化应激的 NRF2 激活有利于 VSMC 的存活7，同时也能抑制 VSMC 的炎性增殖拮抗再狭窄。据此，本团队选择抗细胞增殖、抗氧化的药物紫杉醇，配比抗血栓、抗炎的重组水蛭素比伐卢定作为介入器械复合药物涂层（涂层药物代称为 LFN）用于血管再狭窄的防治。前期我们在细胞水平上证实LFN 可通过调控 TLR4/MyD88/NF-B 炎症通路的蛋白酶解过程抗 VSMC 炎性增殖迁移8，但在 NF-B 炎症通路和 NRF2/ARE 氧化应激通路间交互作用层面的抗再狭窄体内有效性和微观分子机制尚未阐明。本研究通过在体水平的实验研究，探索 LFN 抗再狭窄的有效性及对 NF-B 和 NRF2/ARE 通路间交互作用的影响，同时依托细胞水平的实验研究，从正向激活和负向抑制两个维度切入，明确 LFN 调控NF-B 和 NRF2/ARE 双通路抗 HCASMC 增殖迁移的分子机制，为研发具有高效抗再狭窄作用的介入器械涂层药物提供新思路。1材料和方法1.1材料野生型、NRF2-/-、NF-B-/-突变型大鼠，雄性，购自北京维通达生物技术有限公司；HCASMC细胞、平滑肌细胞培养基、胰酶、胰酶抑制剂、冻存液购自美国 Lifeline 公司；科研级脂多糖购于美国136心脏杂志（ChinHeartJ）2024，36（2）Sigma 公司；紫杉醇购于南京凯基生物科技发展有限公司；比伐卢定、CCK-8 和 HE 染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；RNA 提取试剂盒、逆转录kit、SYBRSelect预混液购于美国 Inventrogen 公司；抗 NF-Bp65、抗 IB 抗体购于美国 AffinitY 公司；抗 NRF2、抗 Keap-1、抗 HO-1、抗 NQO-1 抗体购于美国 Proteintech 公司；抗 PCNA、抗-actin、山羊抗兔 IgGH&L（AlexaFluor488）抗体购于英国Abcam 公司；超净工作台购于北京昌平长城空气净化工程公司；荧光显微镜购于德国 Leica 公司；酶标仪、荧光 PCR 仪、SDS-PAGE 凝胶电泳仪、电转仪购于美国 Bio-Rad 公司。1.2方法1.2.1血管拉伤大鼠模型构建和实验分组以 300mg/kg 剂量腹腔注射 60ml/L 水合氯醛麻醉大鼠，将其固定于手术台上，尾静脉注射肝素钠溶液（100U/kg）抗凝。碘伏消毒颈部皮肤，脱毛膏脱毛，依次打开颈部皮肤、皮下组织，分离出左颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉远心端并暂时结扎颈内动脉，用动脉夹夹闭颈总动脉近心端。在颈外动脉结扎处近心端切口，插入针灸针螺旋手柄，缓慢送入颈总动脉，反复牵拉 3 次损伤血管内膜，夹闭颈总动脉损伤段近心端并撤出针灸针。造模成功标准：病理检查见明显炎症细胞浸润和血管内膜肥厚病变，动脉管腔狭窄率不低于 50%视为造模成功。LFN 干预组则在血管拉伤造模基础上于颈总动脉注射 50L 体积的 LFN 药液（注射一次），夹闭切口处近心端动脉孵育 10min 后，松开切口处动脉夹使药物流出，用 9ml/L 氯化钠溶液冲洗伤口。最后结扎颈外动脉破口近心端，打开颈总动脉近心端动脉夹使血流恢复，见动脉搏动，打开颈内动脉结扎处，可见血液由颈总动脉流入颈内动脉。确认无出血后，9ml/L 氯化钠液冲洗伤口，逐层缝合皮下组织、皮肤，腹腔注射青霉素 40 万 U 预防感染，术后归笼饲养 28d 后处死取材。大鼠随机分为 7 组，每组6 只：野生型大鼠+假手术组（WT 假手术组）；野生型大鼠+血管拉伤组（WT 血管拉伤组）；突变型NRF2-/-大鼠+血管拉伤组（NRF2-/-血管拉伤组）；突变型 NF-B-/-大鼠+血管拉伤组（NF-B-/-血管拉伤组）；野生型大鼠+血管拉伤+LFN 干预组（WT 血管拉伤+LFN 干预组）；突变型 NRF2-/-大鼠+血管拉伤+LFN 干预组（NRF2-/-血管拉伤+LFN 干预组）；突变型 NF-B-/-大鼠+血管拉伤+LFN 干预组（NF-B-/-血管拉伤+LFN 干预组）。1.2.2HE 染色法检测血管组织病理变化血管取材后用中性组织固定液迅速固定 48h，继而用 800ml/L、900ml/L、950ml/L、1000ml/L 浓度乙醇依次脱水 2h，二甲苯透明，使石蜡浸入组织中并包埋切片。将石蜡切片脱蜡至水，再把切片入 Harris 苏木素染 5min，自来水洗，10ml/L 的盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，6ml/L 氨水返蓝，流水冲洗，入伊红染液中染色 2min。最后将切片依次放入 950ml/L 乙醇5min-950ml/L 乙醇5min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-二甲苯5min-二甲苯5min 中脱水透明，将切片从二甲苯中拿出来稍晾干，中性树胶封片镜检，图像采集分析。1.2.3PCNA 免疫荧光染色检测血管组织增殖活性将血管组织石蜡切片用二甲苯浸泡 10min2 次,1000ml/L 乙醇浸泡 5min2 次，950ml/L 乙醇浸泡 5min2 次，850ml/L 乙醇浸泡 5min2 次，750ml/L 乙醇浸泡 5min2 次，蒸馏水浸泡 5min1 次，PBS 缓冲液冲洗 2min3 次，滴加山羊血清封闭 3760min。用滤纸擦去封闭液，滴加 1100 浓度的 PCNA 一抗置湿盒中 4 孵育过夜，再用 PBS3min5 次洗去一抗，滴加 1300 浓度的荧光二抗37 置湿盒中避光孵育 1h，用 PBS5min3 次洗去二抗，滴加 DAPI 避光孵育 10min，用 PBS5min3 次洗去 DAPI，甘油封片后在荧光显微镜下拍片观察。1.2.4HCASMC 细胞培养和实验分组将（46）代的 HCASMC 在无双抗培养基中进行培养，常规细胞培养箱中维持，选择对数生长期的细胞进行实验。实验共两批，每批各分为 7 组，每组 3 个复孔。其中第一批分组：空白对照组；LPS 造模组；LPS造模+LFN 干预组；LPS 造模+LFN 干预组+NF-B 敲减组；LPS 造模+LFN 干预组+IB 敲减组；LPS 造模+LFN 干预组+NF-B 过表达组；LPS造模+LFN 干预组+IB 过表达组。第二批分组：空白对照组；LPS 造模组；LPS 造模+LFN 干预组；LPS 造模+LFN 干预组+NRF2 敲减组；LPS造模+LFN 干预组+Keap1 敲减组；LPS 造模+LFN 干预组+NRF2 过表达组；LPS 造模+LFN 干预组+Keap1 过表达组。1.2.5CCK-8 法检测细胞增殖率根据 CCK-8 试剂盒操作说明，各组细胞经不同处理后，更换不含药物的新鲜培养基，每孔加入 10LCCK-8 检测试剂，继续培养 1h 后用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度，计算细胞增殖率，增殖率=(各组 OD 值正常对照组 OD 值)/正常对照组 OD 值 100%。1.2.6Transwell 法检测细胞迁移和侵袭能力各组心脏杂志（ChinHeartJ）2024，36（2）137细胞用无血清培养基饥饿培养 12h，离心弃上清后重悬细胞并以 1105/ml 密度接种于 Transwell 小室内，用镊子将小室转移至含有 500l/孔完全培养基的 24 孔板孔中，培养 24h。吸弃上室培养基，用PBS 润湿后的棉签轻轻擦去上室内的细胞，将小室底面浸入 100ml/L 甲醇溶液中固定细胞 30s，把甲醇洗掉后再把小室底面浸入结晶紫染液中染色2min，用纯净水清洗至背景清晰后镜下拍片观察。1.2.7Q-PCR 法测定血管组织和细胞中 NF-B 与NRF2/ARE 通路关键靶标及配体的基因表达根据RNA 快速提取试剂盒说明书提取样品 RNA，用反转录试剂盒制备 cDNA，进而建立反应体系 1RNA200ng，Oligo-dT1L，Random1L，混匀离心后65 反应 5min。反应体系 2 建立：加入 12L 反应后的反应体系 1 混合液，dNTP(10mol/L)1L，0.1mol/LDTT2L，5Buffer4L，RT 酶 1L，混匀离心后 42 水浴 60min，然后 85 反应 10min。最后使用实时荧光定量 PCR 系统检测，数据处理采用 2ct法，以-actin 作为内参进行校正。1.2.8Westernblot 法测定血管组织和细胞中 NF-B与 NRF2/ARE 通路关键靶标及配体的蛋白表达提取总蛋白后使用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度，加入SDS 混匀后 95 煮 10min 变性。将 40g 蛋白经SDS-PAGE 电泳后电转 2h 至 PVDF 膜，50g/L 脱脂奶 粉 孵 育 1 h，加 入 NF-B p65、NRF2、Keap-1、IB、HO-1、NQO-1 和-actin 一 抗（11 000 稀释），4 过夜，TBST 洗膜三次后加入荧光二抗（15000 稀释），室温孵育 1h，3 次洗涤后放入化学发光成像系统成像并定量。x1.3统计学处理用 SPSS21.0 统计软件进行数据处理，计量资料采用均数标准差（s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1LFN 抗管腔再狭窄的有效性检测HE 染色结果显示，见图 1A。血管拉伤造模后，模型组管腔内出现狭窄且有血栓形成，经 LFN 干预后管腔狭窄改善，破损管壁有修复，未见血栓填塞。与野生型大鼠造模后情况比较，NF-B-/-大鼠造模后再狭窄程度相对更轻，而 NRF2-/-大鼠造模后虽未见血栓填塞，但内中膜增生和再狭窄较重。NF-B-/-和 NRF2-/-大鼠造模的同时加入 LFN 干预后发现，NF-B 的降低对LFN 抗再狭窄效力有促进作用，NRF2 的降低则不同程度减弱 LFN 的抗再狭窄作用。PCNA 的荧光单染结果（绿色为阳性）发现，野生型和 NRF2-/-血管拉伤模型大鼠管壁的 PCNA 表达量增加明显，但经LFN 干预后 PCNA 表达量减少，见图 1B。WT+sham100 x400 xDAPIPCNAMergeWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFN NF-B-/-+model+LFNWT+shamBAWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFN NF-B-/-+model+LFN图1HE 染色和 PCNA 荧光标记观察血管内中膜增殖状态（绿色为荧光阳性标记的区域）A：血管腔 HE 染色结果；B：血管腔 PCNA 免疫荧光染色结果。138心脏杂志（ChinHeartJ）2024，36（2）2.2NF-B 与 NRF2 关键基因缺失对 LFN 调控体内 NF-B 与 NRF2/ARE 通路关键基因抗再狭窄作用的影响Q-PCR 结果显示见图 2：与正常对照组相比，血管拉伤造模后可上调血管组织中 NF-Bp65 基因表达、下调 IB 基因表达，并抑制 HO-1 基因表达、上调 Keap-1 基因表达（P0.05，P0.01），其中 NRF2 和 NQO-1 有下调趋势，但未见统计学差异，可见血管拉伤造模对炎症和氧化应激 NF-B 与NRF2/ARE 双通路均有影响。野生型大鼠血管拉伤造模的同时施加 LFN 干预后，与血管拉伤模型组相比，IB、NRF2、NQO-1 和 HO-1 基因表达表达量显著升高（P0.05，P0.01），Keap-1 和 NF-B 基因表达显著下调（P0.05，P0.01），LFN 对野生型大鼠的上述调控作用在 NF-B-/-和 NRF2-/-突变型大鼠中不同程度地逆转。WT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelNF-B p65 基因表达WT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFN3bcbdbdaddbbdcadaabbddbdbabcdbdbdabbdcbdbabdbd210Keap-1 基因表达2.51.01.52.00.50IB 基因表达4210NRF2 基因表达4233HO-1 基因表达42103NQO-1 基因表达620410ADBECF图2LFN 对 NF-B 与 NRF2/ARE 通路关键基因表达的影响A：血管组织 NF-Bp65 基因表达比较；B：血管组织 IB 基因表达比较；C：血管组织 NRF2 基因表达比较；D：血管组织 Keap-1 基因表达比较；E：血管组织 HO-1 基因表达比较；F：血管组织 NQO-1 基因表达比较。n=3。与 WT+sham 组比较，aP0.05，bP0.01；与 WT+model 组比较，cP0.05，dP0.012.3NF-B 与NRF2 基因缺失对LFN 调控体内NF-B 与NRF2/ARE 通路关键蛋白效力的影响Westernblot 结果显示见图 3：与正常对照组相比，血管拉伤造模对 NF-Bp65 总蛋白表达影响不大，但可上调Keap-1 蛋白表达，与此同时，下调胞质中 IB、NQO-1、HO-1 和 NRF2 蛋白表达（P0.05，P0.01）。野生型大鼠血管拉伤造模的同时施加 LFN 干预后，与血管拉伤模型组相比，NF-B 总蛋白表达不受影响，Keap-1 蛋白表达显著下调，NRF2、IB、NQO-1 和 HO-1 则明显上调（P0.05，P0.01），LFN 对野生型大鼠的上述调控作用在 NRF2-/-突变型大鼠中得到逆转，但在 NF-B-/-突变型大鼠中没有显著差异。2.4NF-B 与 NRF2 的 表 达 变 化 对 LFN 拮 抗HCASMC 模型迁移和侵袭能力的影响CCK-8 和Transwell 实验结果可见，LPS 可刺激 HCASMC 活化后可快速增殖迁移并提升其侵袭能力，LFN 干预模型细胞后可抑制上述反应，且 NF-B 与 NRF2 基因表达的增减可直接影响 LFN 的作用效果，但二者对应的配体对 LFN 疗效的影响有差别，IB 对 LFN影响不大，但 Keap-1 对 LFN 的影响则相对明显，见图 4。2.5NF-B、NRF2 及其配体的表达变化可影响LFN 对 HCASMC 中 NF-B 与 NRF2/ARE 通路关键基因的调控Q-PCR 结果显示见图 5：与模型组心脏杂志（ChinHeartJ）2024，36（2）139相比，LFN 干预模型细胞后可下调 HCASMC 中 NF-Bp65 基因表达、上调 IB 基因表达，并促进NRF2、NQO-1 和 HO-1 基因表达、下调 Keap-1 基因表达（P0.05，P0.01）。其中，NF-B 与 NRF2 基因表达的增减可直接影响 LFN 的作用效果，二者对应的配体对 LFN 的疗效也有不同程度的影响。WT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNNF-B/-actin 蛋白灰度比2.0cbbdac acbdbbdbbbbcaccdbdbdbdbdddbbdbbddbdbdbdcba1.01.50.50IB/-actin 蛋白灰度比1.00.40.60.80.20NRF2/-actin 蛋白灰度比1.51.00.50Keap-1/-actin 蛋白灰度比1.51.00.50HO-1/-actin 蛋白灰度比1.51.00.50NQO-1/-actin 蛋白灰度比1.00.50NF-BIBNRF2Keap-1HO-1NQO-1-actinWT+shamWT+modelNRF2-/-+modelNF-B-/-+modelGroupsWT+model+LFNNRF2-/-+model+LFNNF-B-/-+model+LFNABCDEFG图3LFN 对 NF-B 与 NRF2/ARE 通路关键蛋白表达的影响A：Westernblot 典型图；B：血管组织 NF-Bp65/-actin 蛋白灰度比值；C：血管组织 IB/-actin 蛋白灰度比值；D：血管组织 NRF2/-actin 蛋白灰度比值；E：血管组织 Keap-1/-actin 蛋白灰度比值；F：血管组织 HO-1/-actin 蛋白灰度比值；G：血管组织 NQO-1/-actin 蛋白灰度比值。n=3。与 WT+sham 组比较，aP0.05，bP0.01；与 WT+model 组比较，cP0.05，dP0.01LPS+LFN+IB(OE)LPS+LFN+IB(OE)LPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPS细胞迁移细胞侵袭细胞迁移细胞侵袭LPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)增殖率(100%)200101020增殖率(100%)20010fffhfhfhfhfhfgfhfhfhfh1020ACB图4CCK-8 和 Transwell 实验检测 HCASMC 的增殖、迁移和侵袭能力（蓝色为染色阳性的细胞）A、B：CCK-8 法检测细胞增殖率；C：Transwell 实验检测细胞迁移和侵袭能力。n=36。与 Control 组比较，eP0.05，fP0.01；与 LPS 组比较，gP0.05，hP0.012.6NF-B、NRF2 及其配体的表达变化可影响 LFN对 HCASMC 中 NF-B 与 NRF2/ARE 通路关键蛋白的调控Westernblot 结果显示见图 6：与模型组相比，LFN 干预模型细胞后可下调 HCASMC 中 NF-Bp65 蛋白表达、上调 IB 蛋白表达，并促进NRF2、NQO-1 和 HO-1 蛋白表达、下调 Keap-1 蛋140心脏杂志（ChinHeartJ）2024，36（2）白表达。其中，NF-B 与 NRF2 表达的增减可直接影响 LFN 的作用效果，二者对应的配体对 LFN 的疗效也有不同程度的影响。LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)NF-B(胞核)基因表达2.0ffhheehffhfehfhegffhhefhefgghhgffhhfehehfgfhfefhhffgfhhffffhfhefffhhehehfhehffhfhfh1.01.50.50IB 基因表达2.51.01.52.00.50NRF2(胞核)基因表达2.01.01.50.50Keap-1 基因表达2.01.01.50.50NQO-1 基因表达2.01.01.50.50HO-1 基因表达2.01.01.50.50NF-B(胞核)基因表达2.01.01.50.50IB 基因表达2.52.01.01.50.50NRF2(胞核)基因表达1.51.00.50Keap-1 基因表达42310NQO-1 基因表达2.01.01.50.50HO-1 基因表达2.01.01.50.50AEIBFJCGKDHL图5LFN 对 NF-B 与 NRF2/ARE 通路交互作用基因表达的影响A、G：细胞中 NF-Bp65（胞核）基因表达比较；B、H：细胞中 IB 基因表达比较；C、I：细胞中 NRF2（胞核）基因表达比较；D、J：细胞中 Keap-1 基因表达比较；E、K：细胞中 NQO-1 基因表达比较；F、L：细胞中 HO-1 基因表达比较。n=3。与 Control 组比较，eP0.05，fP0.01；与 LPS 组比较，gP0.05，hP0.01LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NF-B(KD)LPS+LFN+IB(KD)LPS+LFN+NF-B(OE)LPS+LFN+Keap1(OE)ControlLPSLPS+LFNLPS+LFN+NRF2(KD)LPS+LFN+Keap1(KD)LPS+LFN+NRF2(OE)LPS+LFN+IB(OE)ControlLP