表儿茶素对放射性口腔炎小鼠的抗炎和抗氧化应激作用.pdf

论 著第 37 卷第 7 期医学信息Vol.37 No.72024 年 4 月Journal of Medical InformationApr.2024基金项目：深圳市龙华区医疗卫生机构区级科研项目（编号：2021021）作者简介：谢小红（1979.2-），女，广东始兴县人，本科，主管护师，主要从事中药药理研究通讯作者：吴朝文（1974.11-），男，广东罗定人，本科，副主任医师，主要从事中药药理研究表儿茶素对放射性口腔炎小鼠的抗炎和抗氧化应激作用谢小红袁黎清现袁魏洪发袁刘 娇袁吴朝文渊深圳市龙华区中心医院内分泌科袁广东 深圳518110冤摘要院目的初步从抗炎和抗氧化应激角度探讨表儿茶素对放射性口腔炎小鼠的保护作用遥方法将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组尧模型组和表儿茶素组袁采用单次照射17 Gy X射线方法建立小鼠口腔炎模型遥其中表儿茶素组于造模后连续7 d灌胃给予表儿茶素30 mg/kg袁其余两组灌胃给予等量生理盐水遥各组小鼠进行口腔炎症评分袁HE染色法观察口腔黏膜病理变化袁酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子琢渊TNF-琢冤尧白介素1茁渊IL-1茁冤和白介素6渊IL-6冤水平曰化学发光法检测血清超氧化物歧化酶渊SOD冤尧谷胱甘肽过氧化物酶渊GSH-Px冤和过氧化氢酶渊CAT冤的活性以及丙二醛渊MDA冤水平遥结果与空白对照组比较袁模型组小鼠口腔炎症评分尧血清TNF-琢尧IL-1茁尧IL-6和MDA水平升高渊 约0.05冤袁血清SOD尧GSH-Px和CAT活性降低渊 约0.05冤曰与模型组比较袁表儿茶素组口腔炎症评分尧血清TNF-琢尧IL-1茁尧IL-6和MDA水平降低渊 约0.05冤袁血清SOD尧GSH-Px和CAT活性升高渊 约0.05冤遥结论表儿茶素对放射性口腔炎小鼠具有较好的保护作用袁其机制可能与抑制炎症和抗氧化损伤有关遥关键词院表儿茶素曰炎症曰氧化损伤曰小鼠中图分类号院R781.5文献标识码院ADOI院10.3969/j.issn.1006-1959.2024.07.016文章编号院1006-1959渊2024冤07-0089-05Anti-inflammatory and Anti-oxidative Stress Effects of Epicatechinon Radiation-induced Stomatitis in MiceXIE Xiao-hong,LI Qing-xian,WEI Hong-fa,LIU Jiao,WU Chao-wen(Endocrine Departments of Central Hospitol of Longhua District,Shenzhen 518110,Guangdong,China)Abstract：Objective To investigate the protective effect of epicatechin on radiation stomatitis mice from the perspective of anti-inflammatory andanti-oxidative stress.Methods Thirty male C57 BL/6J mice were randomly divided into blank control group,model group and epicatechin group.Themouse model of stomatitis was established by single irradiation of 17 Gy X-ray.The epicatechin group was given epicatechin 30 mg/kg by gavage for7 consecutive days after modeling,and the other two groups were given the same amount of normal saline by gavage.The oral inflammation score ofmice in each group was evaluated.The pathological changes of oral mucosa were observed by HE staining.The levels of serum tumor necrosis factor-琢(TNF-琢),interleukin-1茁(IL-1茁)and interleukin-6(IL-6)were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.And the activities of superoxidedismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px)and catalase(CAT)and the level of malondialdehyde(MDA)in serum were detected bychemiluminescence.Results Compared with blank control group,the oral inflammation score,serum levels of TNF-琢,IL-1茁,IL-6 and MDA inmodel group were increased(0.05),while the serum activities of SOD,GSH-Px and CAT were decreased(0.05).Compared with model group,theoral inflammation score,serum levels of TNF-琢,IL-1茁,IL-6 and MDA in epicatechin group were decreased(0.05),while the serum activities ofSOD,GSH-Px and CAT were increased(0.05).Conclusion Epicatechin has a good protective effect on mice with radiation stomatitis,and itsmechanism may be related to the inhibition of inflammation and antioxidant damage.Key words：Epicatechin;Inflammation;Oxidative damage;Mice头颈部肿瘤发病率较高，约占恶性肿瘤的 8%，是临床较为常见肿瘤之一。临床上的治疗手段主要包括手术治疗和放射性化疗1-3。据研究数据显示4-6，头颈部肿瘤患者曾接受过放射性化疗概率高达 70%，由于鼻咽癌对放射性治疗敏感度较高，放射性治疗常是其首选的治疗方法。然而放射治疗中最常见的不良反应为放射性口腔黏膜炎（radioactivestomatitis,ROM），高达 80%发生率。常见舌黏膜溃疡性损伤，患者经受疼痛和饮食受困，严重影响患者的生活质量。临床治疗药物有限，治疗效果不佳，不良反应多，寻找高效低毒的抗放射性口腔炎新药仍是目前研究重点。表儿茶素（Epicatechin）是茶多酚中主要的活性单体，药理作用广泛，研究发现其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、改善糖尿病和免疫调节等作用7-9，其中优越的抗炎和抗氧化活性值得关注。但其对 ROM 的影响尚未见相关研究报道。本研究旨在初步从抗炎和抗氧化应激角度探讨表儿茶素对放射性口腔炎小鼠的保护作用，以期为临床研究开发提供部分理论依据。89论 著第 37 卷第 7 期医学信息Vol.37 No.72024 年 4 月Journal of Medical InformationApr.20241材料与方法1.1 实验动物 SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠 30 只，体质量 1822 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司许可证号：SCXK（辽）2020-0001。本研究符合实验动物伦理基本原则。1.2 药物与试剂表儿茶素，纯度跃98%，批号：SE8100，购于上海脉铂医药科技有限公司；TNF-琢、IL-1茁 和 IL-6ELISA 试剂盒，购于武汉博士德生物技术有限公司；SOD、GSH-Px、CAT 和 MDA 检测试剂盒，购于南京建成生物有限公司。1.3 仪器 RS-2000X 射线机：自美国 Precision X-ray公司；KM1-HD-325 型轮转式切片机：北京海富达科技有限公司；CX23CX33 型 Olympus 显微镜：日本Olympus 公司；SKSW-KC-100 型酶标仪：北京海富达科技有限公司。1.4 方法1.4.1 动物分组、造模与给药 按体重随机分为空白对照组、模型组和表儿茶素组，每组 10 只，其中表儿茶素组灌胃给与表儿茶素 30 mg/kg。建模方法主要参考文献10，方法如下：腹腔注射 4%水合氯醛溶液麻醉。麻醉后仰卧放入自制照射盒中，按照射剂量率为 1.325 Gy/min（电压 220 kV，电流 25 mA），一次性照射头颈部。空白对照组同样麻醉、固定，不接受放射，造模后连续 7 d 灌胃给药。1.4.2 样品采集 造模第 8 d 后，10%水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球取血，4 益静置 3 h 后，于 4 益 3500 r/min离心 10 min，-80 益冰箱备用。分离小鼠口腔黏膜组织，4%多聚甲醛溶液浸泡固定。常规石蜡包埋切片，用于苏木素-伊红（HE）染色，观察黏膜组织的形态学变化。1.4.3 口腔炎症评分 口腔炎症评分标准主要参照文献11方法，分别根据口腔黏膜的损伤程度，评分值为总得分的平均值。在给药前及取材前分别进行评分，评分方法见表 1。1.4.4 口腔黏膜形态学观察 从 10%中性甲醛中取出并选取同一部位，面积约为 5 mm 大小的黏膜组织，分别经过酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片等石蜡包埋步骤，HE 染色（苏木素染色 15 min，伊红染色 10 s），晾干后，中性树胶封片。于光学显微镜下观察口腔黏膜组织形态学变化。1.4.5 酶联免疫吸附法测定血清 TNF-琢、IL-1茁 和IL-6 的水平 根据相应炎症因子 ELISA 试剂盒说明书检测步骤，配合使用酶标仪检测各组小鼠血清中 TNF-琢、IL-1茁 和 IL-6 的水平。1.4.6 化学发光法检测各血清 SOD、GSH-Px、CAT 活性以及 MDA 水平 根据相应氧化应激试剂盒说明书检测步骤，配合使用酶标仪检测血清中 SOD、GSH-Px、CAT 活性以及 MDA 水平。1.5 统计学方法 采用 SPSS 19.0 软件分析各组数据，其中计量资料用（依）表示。根据数据是否符合正态分布或方差齐性，采用单因素方差分析。约0.05 认为差异有统计学意义。2结果2.1 各组口腔炎症评分比较 与空白对照组比较，模型组小鼠口腔炎症评分上升（约0.05）；与模型组比较，表儿茶素组小鼠口腔炎症评分降低（约0.05），见表 2。2.2 各组口腔黏膜组织病理学观察 空白对照组小鼠口腔黏膜整体结构完整，细胞排列整齐、有序，无坏死和炎症细胞浸润。模型组小鼠口腔黏膜整体结构破坏严重，可见部分细胞脱落、坏死，较多炎性细胞浸润，表儿茶素组较模型组口腔黏膜有改善，无明显炎症细胞浸润和细胞坏死，见图 1。2.3 各组血清 TNF-琢、IL-1茁 和 IL-6 水平比较 与空白对照组相比较，模型组血清 TNF-琢、IL-1茁 和IL-6 水平升高（约0.05）；与模型组相比，表儿茶素组血清 TNF-琢、IL-1茁 和 IL-6 水平降低（约0.05），见图 2。分数0.5123黏膜发红情况轻微浅红中度发红重度发红/黏膜溃疡情况/少数几处溃疡，小于 25%黏膜总面积广泛性溃疡，黏膜韧性消失，25%50%总面积黏膜溃烂成团，大于 50%总面积表1口腔炎评分标准组别空白对照组模型组表儿茶素组101010造模前000取材前02.82依0.34*1.09依0.17#表2各组小鼠口腔炎症评分比较渊 依 袁分冤注：与空白对照组比较，*约0.05；与模型组比较，#约0.05。90论 著第 37 卷第 7 期医学信息Vol.37 No.72024 年 4 月Journal of Medical InformationApr.20242.4 各组血清 SOD、GSH-Px、CAT 活性以及 MDA 水平比较 与空白对照组比较，模型组小鼠血清 SOD、GSH-Px 和 CAT 活性降低，MDA 水平升高（约0.05）；与模型组比较，表儿茶素组小鼠血清 SOD、GSH-Px 和 CAT 活性升高，MDA 水平降低（约0.05），见图 3。注：A：空白对照组；B：模型组；C：表儿茶素组。图1各组小鼠口腔黏膜组织病理形态学观察渊HE伊20冤ABC图2各组血清TNF-琢尧IL-1茁和IL-6水平比较图3各组血清SOD尧GSH-Px尧CAT活性以及MDA水平比较91论 著第 37 卷第 7 期医学信息Vol.37 No.72024 年 4 月Journal of Medical InformationApr.20243讨论头颈部肿瘤患者在放射性治疗过程中最常见的不良反应为口腔炎，根据患者个体差异和治疗周期的异同，轻、中、重度的口腔炎均会出现，而重度约占总体的 30%以上，出现严重的黏膜上皮脱落，甚至坏死12。对于放射性口腔黏膜炎的动物模型的建立，早于 90 年代，放射性口腔黏膜炎动物模型已在国内外建立，其中应用较多的动物为大鼠和小鼠，其中由于小鼠具备可重复性、经济性、易行性等优点，广泛应用于该领域的科研研究13。放射性口腔黏膜炎涉及的机制异常复杂。炎症、氧化损伤和致病微生物三者相互作用可能是放射性口腔黏膜炎发生发展重要的因素14。表儿茶素药理作用广泛，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、改善糖尿病和免疫调节等作用7-9，其中以抗炎和抗氧化活性最为显著，其是否对放射性口腔炎具有较好的保护作用值得探讨。放射过程中可诱导多种炎性因子的产生，如TNF-琢、IL-1茁 和 IL-6。TNF-琢、IL-1茁 和 IL-6 不但可直接引起口腔粘膜炎症损伤，还可引发炎症风暴，促进炎症爆发，进一步促进口腔损伤15，16。本研究发现，模型组小鼠口腔炎症评分较空白对照组升高，口腔粘膜组织损伤严重，可见大量的炎症细胞浸润；此外，血清促炎细胞因子 TNF-琢、IL-1茁 和 IL-6水平升高，提示了放射性口腔炎小鼠模型构建成功。给予表儿茶素可改善口腔粘膜组织损伤和炎症细胞浸润，降低血清促炎细胞因子 TNF-琢、IL-1茁 和IL-6 的水平，提示表儿茶素通过抑制炎症，改善放射性口腔炎损伤。放射过程同时可诱导机体产生氧化损伤，其在口腔炎的发病过程中有着重要的作用17。SOD、GSH-Px、CAT 活性以及 MDA 的水平是反映机体氧化应激损伤严重程度的重要指标18。SOD、GSH-Px和 CAT 是机体内几种重要的抗氧化酶，可消除多种自由基，是防御机体氧化损伤的重要保护酶19。MDA 是机体脂质氧化后产生的代谢产物，其水平是机体氧化损伤重要的参考指标之一。本研究发现，模型组小鼠血清 SOD、GSH-Px 和 CAT 活性降低，而 MDA 含量升高。而给予表儿茶素后，血清SOD、GSH-Px 和 CAT 活性升高，MDA 含量降低，提示表儿茶素可通过抑制氧化应激损伤，改善放射性口腔炎损伤。综上所述，表儿茶素对放射性口腔炎小鼠具有较好的保护作用，其机制可能与抑制炎症和抗氧化损伤有关。参考文献院1Ahmadinejad F,Bos T,Hu B,et al.Senolytic-mediated elimi鄄nation of head and neck tumor cells induced into senescence bycisplatinJ.Mol Pharmacol,2022,101(3):168-180.2Garc侏a-Carracedo D,Cai Y,Qiu W,et al.PIK3CA and p53mutations promote 4NQO-initated head and neck tumor pro鄄gression and metastasis in mice J.Mol Cancer Res,2020,18(6):822-834.3Wang W,Lozar T,Golfinos AE,et al.Stress keratin 17 expres鄄sion in head 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