猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展.pdf

0240-08网络首发时间：2 0 2 3-10-2 62024,54(02):240-247中国兽医科学2 0 2 4,54(0 2)ChineseVeterinarySScience00I:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0019中图分类号：S852.659.6文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 96(2 0 2 4)0 2-猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展何松，汤德元*，曾智勇，王彬，黄涛，毛茵茗，周飘，廖正波，陈旭，袁盛林，胡雯雯，周敏（贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025)摘要：日本乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus,JEV)是人兽共患病日本乙型脑炎的病原，对世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此，建立快速可靠的JEV检测方法，有利于及时检测JEV和采取措施防控日本乙型脑炎。本文总结了近年来检测JEV的新型方法，包括分子生物学检测、免疫学检测、生物传感器检测等技术，以期为有效诊断及防治JEV感染提供技术指导。关键词：猪日本乙型脑炎；日本乙型脑炎病毒；检测Research progress on novel detection methods ofporcine Japanese encephalitis virusHE Song,TANG Deyuan,ZENG Zhiyong,WANG Bin,HUANG Tao,MAO Yinming,ZHOU Piao,LIAO Zhengbo,CHEN Xu,YUAN Shenglin,HU Wenwen,ZHOU Min(College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)Abstract:Japanese encephalitis virus(JEV)is the zoonotic agent of Japanese encephalitis,which had caused hugeeconomic loss to the global pig industry.Therefore,the establishment of the rapid and reliable method to detectJEV was conducive to the timely detection of JEV and the prevention and control of Japanese encephalitis.Thisstudy provided a comprehensive overview of the novel detection methodologies for JEV in recent years,includingmolecular biological detection,immunological detection,biosensor detection to offer technical guidance for effec-tive diagnosis and prevention of JEV infection.Key words:porcine Japanese encephalitis;Japanese encephalitis virus;detection*Corresponding author:TANG Deyuan,E-mail:日本乙型脑炎（Japaneseencephalitis）是一种能通过蚊子传播的由日本乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus,JEV)感染动物引起的人兽共患传染病。JEV属于黄病毒科黄病毒属,基因组为单股正链RNA,长约11kb，只有1个开放性阅读框（ORF），共编码3个结构蛋白 C、p r M(M)和E和7 个非结构蛋白(NS1、NS2 A、NS2 B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)，其主要的传播媒介是三带喙库蚊 。JEV感染人和动物后可引起严重的神经系统病理性症状，对人的致死率可高达30%，即使幸存者，也有近50%的概率出现神经损伤后遗症。规模化养殖的猪数量大，养殖密度高，更容易通过“猪-蚊-猪”的循环模式扩大病毒的传播范围，商品猪感染后大多无明显临床症状，而妊娠母猪的临床表现有高热、流产、死胎和木乃伊胎，公猪则出现睾丸炎 2 ,给世界各国养猪业带来了重大经济损失。因此，尽早快速、准确检测JEV已成收稿日期：2 0 2 3-0 8-11；修回日期：2 0 2 3-10-2 0基金项目：国家自然科学基金项目(318 6 0 7 16)；贵州大学重点项目（黔科合平台人才【2 0 18 57 8 1-8)作者简介：何松(1999-），男，贵州铜仁人，硕士生，研究方向为动物传染性病原分子生物学,E-mail:。*通讯作者：汤德元（196 4-），男，教授，博士生导师，主要从事动物传染性病原分子生物学和中西兽医结合诊疗的教学与科研工作,E-mail：t d y u a n 16 3.c o m。241何松等：猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展第2 期为防控和净化日本乙型脑炎的先决条件，本文对JEV当前新型诊断方法进行总结，以期为日本乙型脑炎的检测和防治提供技术支持1分子生物学检测1.1RT-PCR反转录聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)是常用于检测 JEV的一种方法，与其他传统方法（如病原鉴定)相比具有耗时较少、特异性强和灵敏度高等特点。近年来，由于多重PCR方法能够快速鉴别临床症状及病理变化相似的各种传染病病原，从而得到了广泛的应用。樊欢等 3 将多重RT-PCR技术与核酸侵人反应及纳米金显色技术联用，建立了针对引起脑炎的JEV、东方马脑炎病毒（Easternequineencephalitisvirus,EEEV）、西方马脑炎病毒（Western equine en-cephalitis virus,WEEV)、西尼罗病毒（West nile virus,WNV)和尼帕病毒（Nipahvirus,NiV)这5种病毒的检测方法，该方法将目标模板转化为信号分子的检测，最后利用纳米金对PCR产物进行显色，从而实现检测结果的可视化；该方法对5种病毒的检测灵敏度均为10 copies/L,具有较高的特异性及灵敏度。由于上述5种病毒的易感动物和传播媒介均相同或者类似，临床症状也大致相同，因此该方法可显著提高虫媒病毒的检测效率，为各国制定防范外来传染病预警措施提供技术支持。涂藤等 4 将多重RT-PCR与毛细管电泳相结合，建立了能高效检测7种常见猪易感病原 JEV、猪瘟病毒（Classical swinefevervirus,CSFV)、猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproduc-tive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）、猪链球菌（Strepto-coccus suis）、沙门菌（Salmonella）的方法，电泳时所需样品低于1L,方便后续的核酸回收等试验，对7种病原的检测限为10 3copies/L，对6 3份临床样品检测的结果与国际标准检测方法的检测结果完全一致，表明该方法具有高通量、特异性好、灵敏度高等优点。此外,该方法在鉴别猪易感病原的同时，还能够检测常见的人兽共患病病原，这对实验研究人员和社会公共卫生都具有重大意义。Hu等 5基于基因表达分析仪(GeXP)建立了多重RT-PCR检测方法，该方法能同时检测JEV、CSFV、PRRSV、伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）、非洲猪瘟病毒（African swinefevervirus,ASFV）、猪细小病毒（Porcineparvovirus，PPV）和猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)共7 种猪病原体,其敏感性达到10 10 0 0 copies/L,对多个临床样品进行分析与常规PCR方法相比，GeXP-PCR具有100%的特异性。1.2qPCR实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quan-titative PCR，q PCR是近年发展起来的一种实验室检测技术，它既能有效地解决PCR检测时出现假阳性问题，又能够对核酸进行定量,具有比普通PCR更高的敏感性和特异性。孙莉等 6 以JEV3UTR区域为靶标设计引物和TaqMan-MGB探针，建立了一步法qPCR方法,其变异系数在0.46%0.53%之间，检测极限为5copies/L，对15份临床血清样本的检测结果与JEV检测试剂盒（北京华大吉比爱生物技术有限公司)结果一致，说明该方法具有较高的灵敏度和特异性。由于JEV存在多种基因型,其中JEV基因1型(G1)和3型(G3)是亚洲最流行的毒株,为了快速区分JEVG1和G3,Wang等 7 以G1和G3型的prM/M基因作为靶标设计双重TaqMan RT-qPCR引物和探针,建立了一种对JEV基因快速分型的方法,该方法对野外蚊子和猪样本中的JEVG1和G3型的灵敏度均为10 copies，比普通PCR方法更特异、敏感,能在1h内完成检测。目前,JEVG1和G3型的混合感染在中国东部地区的猪或蚊子中较为普遍，因此，这种双重TaqManRT-qPCR为JEVG1和G3型毒株的快速鉴别检测和流行病学调查提供了技术支持。Barros等 8 针对JEVNS2A基因设计了1对引物和2 条探针，建立了能区分WNV和JEV的双重 TaqMan RT-PCR,该方法对两种病毒的检测极限均为10 copies，与其他虫媒病毒无交叉反应,具有高特异性和敏感性。在生产中由于猪精液中携带的病毒易导致病毒的扩散，给养猪业造成了巨大经济损失，而针对猪精液中RNA病毒却缺乏有效的检测方法。鉴于此，王婕敏 9 建立了同时对猪精液中PRRSV、CSFV 和JEV进行检测的三重RT-qPCR检测方法,其灵敏度分别为18.2 4、10、10 copies,对15个猪场采集的10 9份猪精液样品进行检测，结果显示：JEV总阳性率达到了2 0.2%（2 2/10 9），这表明JEV是猪场较为普遍的一种繁殖障碍性疾病相关病原，而利用该方法有助于繁殖障碍类疾病相关病原的净化和根除。Xu等 10 设计了携带3种不同标记基团FAM、VI C和CY5的TaqMan探针，开发了两种多重TaqManRT-qPCR方法，可同时检测6 种虫媒病毒JEV、W NV、寨卡病毒（Zikavirus,ZIKV）、基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus，CH IK V）、登革热病毒242第54卷中国兽医科学（D e n g u e v i r u s,D ENV）、黄热病病毒（Yellowfevervirus,YFV），其检测限均低至5copies，批间与批内的变异系数分别为0.2 4%3.2 1%和0.2 3%1.76%,对38 个临床样本（包括血浆、血清和尿液样本)进行检测,结果与商业化单一RT-qPCR试剂盒（迈布斯凯生物科技有限公司）的符合率为10 0%JEV等虫媒病毒的共同传播，不仅带来了养殖场成本增加和公共卫生安全等问题，而且给鉴别诊断，特别是血清学和分子生物学鉴别带来了挑战。此外，蚊子作为一种重要的传播媒介，是多种黄病毒的储存宿主和传染源，将蚊子纳人监测对象可作为检测某些重要的黄病毒疫情的早期预警手段。1.3LAMP环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal am-plification,LAMP)是在恒温条件下进行靶基因扩增的一种新技术。Xu等 开发了Rapidvisual CRISPR(RAVI-CRISPR)检测方法，能在1h内完成样品检测,JEVC基因的检测限为8.97 copies,与猪的其他病原体没有交叉反应性,应用RAVI-CRISPR对18 份组织样本进行检测,其可视化的结果与RT-qPCR分析的结果一致，表明RAVI-CRISPR可用于临床和载体样本中JEV的现场检测。Liu等 12 针对JEVE基因开发了用于检测猪和蚊子中的JEV的RT-LAMP方法，通过检测56 份猪血清样本和2 0 0 0 0 只蚊子对该方法进行评估的结果表明，与病毒分离鉴定结果相比完全一致，对猪血清样本和蚊子样本检测限分别为2.57 和2 copies，检测灵敏度与RT-qPCR相似，比传统RT-PCR高10 倍，可在50 min内完成。该方法可准确、快速检测猪和蚊子体内的JEV,是监测JEV的实用分子手段。Tian等 13 基于JEVNS3基因建立了一种荧光染料指示的实时RT-LAMP方法，用于细胞培养物和猪体样本中JEV的检测,该方法在20L体系下对样本中JEV的检测限为8.13PFU/mL，可在35min内完成，比传统RT-LAMP方法更灵敏、更快速，该方法避免了因样品制备过程中的污染而产生假阳性结果。Ahn等 4 开发了JEV纳米条形码和比色反转录环介导的等温扩增（cRT-LAMP)方法,在cRT-LAMP测定中,将特定的纳米金颗粒(AuNP)条形码添加到JEVRT-LAMP扩增子中，形成稳定的LAMP-AuNP条形码复合物结构，随后利用AuNP：聚腺嘌呤(A10)-JEVRT-LAMP纳米条形码的盐诱导聚集原理通过比色测定来鉴定JEV扩增子，而盐诱导的JEV特异性纳米条形码因聚集而产生肉眼可见的颜色变化（粉红色至紫色），进而验证样品有无阳性信号；该方法对JEV的检测限为1copies/L,可在30 min内完成并能直接从尿样中检测JEV,与常规RT-PCR灵敏性基本一致,与ZIKV、DENV2D ENV4型无交叉反应，具有高特异性和敏感性，能够为偏远地区的JEV检测提供一种实用手段。氧化锌(ZnO)纳米颗粒对核酸具有良好吸附作用和导热性，与更常用的纳米金粒子相比，具有表面积大、经济、环保等优点。目前，利用ZnO纳米材料作为RT-LAMP检测的优化剂来检测各种疾病的报道很少，而Ma等 15 成功开发了一种ZnO纳米结构辅助RT-LAMP来检测JEV,与传统RT-LAMP实验相比,在0.6 1.2 nmol/L范围内添加ZnO纳米颗粒可以优化RT-LAMP反应,且以1 nmol/L为ZnO纳米颗粒的最佳浓度，该方法对JEV的检测可在6 0、30min内完成,对临床样本进行检测与普通PCR相比，其灵敏性比普通PCR高约10 0 倍。1.4ddPCR微滴数字PCR（D r o p l e t d i g i t a l PCR,d d PCR)是一种新型的实验室检测技术，无须使用标准样品即可实现核酸定量，目前已用于病原体诊断、基因突变检测和转基因研究等应用。Wu等 16 基于JEVNS5基因设计引物和探针开发了RT-ddPCR方法，该方法线性相关性良好（R0.999），通过分析10 3份猪临床样本,将其与TaqMan RT-qPCR进行比较的结果表明，RT-ddPCR的阳性检出率（2 7.2%）高于TaqManRT-qPCR的阳性检出率（16.5%），检测限约为2 copies/20L,灵敏度比TaqMan RT-qPCR高100倍。张俊锋等 17 根据JEVNS1基因和WNVNS4B基因开发了双重RT-ddPCR检测方法，对JEV和WNV的检测灵敏度均可达到10?copies/L,在高浓度和低浓度模板下变异系数均较小，与多种病毒无交叉反应、说明该方法的可重复性、特异性良好，为这2种病毒的检测提供了可靠的解决方案。JEV感染初期，宿主体内病毒含量水平较低，使得从临床样本中分离或检测病毒非常困难,而新型RT-dd-PCR拥有更好的分析灵敏度，这有助于提高临床样本的阳性检出率，起到“早发现”的作用，有利于猪场繁殖障碍疾病的监测，也有利于公共卫生安全。2免疫学检测技术2.1酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunoso-rbent assay,ELISA)由于JEV病毒血症持续期短,在脑脊液(CSF)或血清样本中很难检测到JEVRNA,因而日本乙型脑炎的诊断主要依据之一是检测血清样本中有无JEV特异性抗体。Zhou等 18 开发了一种用于检测JEV的何243松等：猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展第2 期阻断ELISA(blockingELISA,bELISA)方法，对免疫后第7 天的157 份猪样品进行现场检测，与商业化iELISA试剂盒对比检测结果的一致性为98.7%，表明bELISA有高灵敏度和特异性，可用于感染或免疫后JEV早期抗体的检测，也为JEV感染的血清学监测和疫苗接种后猪的免疫状态评估提供了的方法。Chauhan等 19 基于JEVNS1蛋白开发了试纸条ELISA检测方法，试纸条ELISA的相对诊断灵敏度和特异性分别为10 0%和92.9%，4下试纸条的保存期可达7 个月，并且检测结果可视化，无须其他设备，可用于偏远地区JEV的现场检测。Jia等 2 0 开发了对IgG定性和定量的ELISA方法，对9个养猪场的7 4份血清样本进行检测，与间接ELISA进行比较，结果符合率为8 5.1%（6 3/7 4），对46 例猪血清样品进行定性检测，获得了8 例猪阳性血清样品，表明ELISA具有较高的特异性、敏感性和重复性。IgM捕获ELISA(Monoclonal antibody captureELISA,MacELISA)是目前诊断JEV最广泛的方法，早期开发的MacELISA在宿主感染JEV后出现临床症状的第2 天就能检测到特异性IgM,但该方法存在检测时间长、特异性较差等诸多缺陷。而Mali等 2 1构建了表达JEVG1E基因的BHK-21细胞,利用重组E蛋白作为检测抗原，成功建立了检测JVE特异IgM的ELISA,测试结果显示，该方法反应性好，与JEVG3毒株免疫的动物无交叉反应，检测2 0 份临床样本时,与商业化IgMELISA试剂盒相比，一致性为100%，表明该方法的特异性和敏感性良好，能够对早期血清中JEV抗体进行更精确的检测2.2乳胶凝集试验(Latexagglutination test,LAT)LAT的原理是将抗原或抗体吸附到聚苯乙烯颗粒上，用以检测相应抗体或抗原的一种新兴的免疫检测方法，因其操作简单、快速等特点，已被广泛用于临床诊断。Jia等 2 2 用JEV抗原对乳胶进行致敏，制备了乳胶抗原，用LAT方法对35个猪血清样本进行检测，结果显示与血凝抑制试验相比，两种方法的检测结果无显著差异，表明LAT可作为JEV流行病学调查和诊断的候选方法。Grace等 2 3 以JEVNS1蛋白作为抗原，在硼酸盐缓冲液中，通过共价作用将抗原偶联到羧酸盐改性的乳胶珠上，开发出乳胶凝集试验方法，与间接ELISA相比，其特异性为95.2%,与耗时3h的常规ELISA相比，它能在5min内给出可视化的结果，不需要特殊或专用设备，是现场条件下JEV监测的可靠筛选方法，2.3免疫层析技术胶体金免疫层析技术是免疫胶体金技术与层析法结合的新一代检测技术，具有快捷、结果可视化、不需要特殊设备等优势。杨鹏飞等 2 4 应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并标记JEVNS1特异抗体，制成胶体金免疫层析检测试纸条，对感染JEV的三带喙库蚊进行检测,其灵敏度为1X105PFU/mL，可在5min内获得结果，该方法为蚊媒携带病原的直接快速检测提供了技术支撑。Cha等 2 5 开发了一种新的免疫层析试验技术,用于检测猪血清中的IgG抗体，该试纸条以胶体金颗粒标记的抗猪IgG抗体作为金标垫，分别以纯化的JEV-E蛋白的F1R1亚基和山羊抗小鼠IgG抗体作为检测线和质控线，对246份猪血清进行检测，结果特异性和敏感性分别为97.7%和8 4.8%，与IFA检测的结果具有很好的一致性。张福良 2 6 应用纯化的JEVE蛋白单克隆抗体，制备了用于可检测JEV抗原的胶体金试纸条，其检测极限可达10 3 10 4TCIDso/100L，数分钟内就可得到可视化的结果，试纸条在室温条件下可保存12 个月，重复性、稳定性良好，可广泛应用于生产、临床上多种样品的检测2.4蛋白芯片法(Protein chip method)蛋白芯片技术是近年来在基因芯片的基础上发展起来的一种蛋白质组学新方法。蛋白芯片技术主要采用微阵列点样等方法将大量生物大分子（如抗原或抗体等）样品有序地固定在硅胶片、膜、多孔板等载体的表面，组成密集的二维分子阵列，然后用于检测已标记的待测生物样品中的特异性靶分子，最后通过特定的仪器对信号强度进行分析，从而达到检测的目的。Wu等 2 7 利用CSFVE2、PPVVP2、JEVED3和PRRSVN蛋白作为捕捉抗原，研制了可同时检测4种猪病毒特异抗体的蛋白芯片，对诊断芯片进行优化后,E2、VP2、ED 3、N蛋白的鉴别质量浓度分别为0.2、0.4、0.4和0.4mg/mL，主要抗体和次要抗体的稀释度分别为1：50 和1：6 0 0,批间与批内变异系数均小于3%，对2 0 0 份临床样本进行检测与商业ELISA试剂盒（武汉科前生物有限公司）相比，阳性样本的符合率为95.8%10 0%，该方法对蛋白质的含量要求低，与其他病毒无交叉反应，表明该方法具有高特异性和灵敏性，可用于筛选混合感染后临床血清样本中的抗体，对防控猪繁殖障碍类疾病具有重要意义，也为开发高密度集成诊断生物芯片提供了思路。石莹等 2 8 通过将病毒抗原包被成微球，建立了检测JEV等5种虫媒病毒的液相蛋白芯片方法，该方法中病毒特异性抗体及生物素标记二抗的孵育时间均为1h，二抗的最佳稀释度为1：10 0,为海关快速检疫检验提供了技术支持244第54卷中国兽医科学3生物传感器标记技术生物传感器是由生物识别元件、信号转换装置和数据分析仪这三部分组成。一般由生物敏感材料（如蛋白等活性物质）组成生物传感器的识别元件，由物理元件（如电极等）组成信号转换装置，最后由计算机、手机等设备将识别到的信号转换成数据进行分析的仪器。Yang等 2 9 用丙烯酸锌作为功能单体，开发了基于金属有机框架和钝化增强选择技术的检测JEV的分子印迹传感器，在该方法中丙烯酸锌通过自由基聚合在硅改性金属有机骨架表面形成分子印迹聚合物，以聚乙二醇（PEG)作为封闭剂来增强聚合物特异性识别病毒核酸的能力,对相关参数进行优化后，检测范围较宽，对JEV的检测限为13pmol/L,特异性好，为临床应用提供了新方法。Liang等 30 构建了用于检测JEV的分子印迹聚合物(病毒-MIP)荧光传感器，该方法是将病毒-MIP锚定在由荧光染料芘-1-甲醛(PC)上，利用荧光共振能量转移原理增强PC的荧光强度(FRET),能在40 min内得到检测结果,对JEV的检测限为9.6 pmol/L，相对标准误差为1.99%，这种基于MIP的荧光传感器操作简单、稳定性高和成本低，这为其他病毒检测技术的开发提供了参考。Luo等 31 将Fe:O4微球作为硅涂层的印迹基底,以氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)作为功能单体,通过原硅酸四乙酯(TEOS)的聚合固定模板分子JEV,开发了用于检测JEV的磁性分子印迹共振光散射（MIPs-RLS)传感器，该传感器能在室温下2 0 min内即可完成病原的检测，检测限为1.3pmol/L，与甲型肝炎病毒(HAV)等无交叉反应，表现出对JEV的高灵敏度和良好的识别选择性，可以成为一种通用且直接的JEV检测方法。为了开发JEV电化学诊断技术,Roberts等 32 基于智能手机的便携式“Sensit设备，开发了一种用于快速检测JEVNS1抗原的丝网印刷碳电极（SPCE）免疫传感器，所制备的免疫传感器不需要额外信号增强作用的纳米材料，对JEV抗原的检测限范围为1 fmol/L1mol/L,能在30 s内完成,用6 2 个临床样本进行验证，结果与RT-PCR相比，其灵敏度为96.15%，特异性为97.2 2%；SPCE可在4储存长达3周，而电极性能不会出现下降，该免疫传感器与电化学“Sensit设备和智能手机相结合，可成为现场检测筛查JEV的新型方法。4其他检测技术Grubaugh等 33 构建了一种寡核苷酸DNA微阵列,用于检测和鉴定来自黄病毒等蚊媒RNA病毒多基因，能够识别从细胞培养物、人工感染或野外采集的蚊体中提取的病毒RNA,能比单一PCR检测更多的靶标。Chu等 34 用金属纳米颗粒作为探针，用多孔醋酸纤维素膜（CAM)作为捕获和浓缩完整病毒的载体，开发了基于激光解吸/电离质谱（Laserdesorption/ionization mass spectrometry,LDI-MS)检测完整病毒的夹心免疫分析法，该方法特异性好,能够用于检测JEV。Zh o u 等 35 通过JEV毒株的多基因组比对分析设计了3对引物和探针，建立了核酸序列的实时扩增(RT-NASBA)方法,能在10 min内观察到结果，检测限为6 copies，灵敏度是RT-PCR的10010 0 0 倍;RT-NASBA的检测模板和最终产物都是RNA，避免了样本和环境中DNA污染风险，有利于猪繁殖障碍疾病相关病原的监测。量子点(Quantumdots,QD)具有超亮荧光、优异的光稳定性和可选颜色等光学特性,Zhang等 36 用QD对JEV包膜蛋白进行特异性标记，在不改变病毒完整形态和天然感染性的条件下，以追踪野生型和突变型JEV在活体Vero细胞中的感染，该方法能够标记突变病毒的关键蛋白，这为深人研究病毒检测方法和感染机制提供了思路。刘胜利 37 将多重PCR与基因芯片技术相结合，建立了联合检测的基因芯片诊断方法，可对JEV、CSFV、PPV、PRRSV和PCV2同时进行检测,灵敏度可以达到10-5ng/L，比原有多重PCR检测灵敏度高10 0 倍，对16 份样品进行检测，其检测结果与多重PCR的符合率达10 0%；联合检测基因芯片诊断方法可实现对多种病原体、多个样本的同时检测，这为流行病学调查和传染性疾病的早期诊断和判定提供了有效的检测手段,更为猪病的防控提供了科学依据5展望当前，JEV易感虫媒在我国分布范围广，给日本乙型脑炎防控及诊断带来了困难,严重威胁着人类公共卫生安全和养猪业的经济效益。目前尚无治疗日本乙型脑炎的特效药，虽然市场上已有相关疫苗用于预防JEV，但其保护范围有限，不能提供完全的保护。因此，新型JEV检测技术不断出现，为JEV的现场诊断和日本乙型脑炎的预防提供了有效的检测方法，但每种检测方法都有优点和不足之处（见表1）。分子生物学技术可用于快速地区分临床症状和病理变化相似的疾病病原，但是此类方法需要昂贵的仪器以及专业的人员，且不适合现场检测。免疫学方法中乳胶凝集试验、胶体金免疫层析技术均.L_何245第2 期松等：猪日本乙型脑炎病毒新型检测方法研究进展是利用抗原和抗体特异性结合的原理，通过用标记或与载体结合的方法，使试验结果可视化，但是这类方法只能定性分析，不能进行定量和自动化分析。近几年新兴的ddPCR、蛋白芯片、生物标记和生物传感器等技术具有可临床现场快速诊断、灵敏度更高、适用于大规模样品检测等优点，但存在检测成本高昂及技术复杂等缺陷。目前,对JEV的诊断方法和疫苗的研究正在不断进行中,相信在不久的将来JEV的检测方法会不断完善并用于净化日本乙型脑炎病毒。表1JEV检测方法的优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of JEV detection methods方法Methods优点Advantage缺点Defect特异性较差，交叉反应发生的概率高较高的灵敏度，操作简单快速，重复性好ELISAThepoor specificity,thehighprobability ofHigh sensitivity,easy and fast operation,good repeatabilitycross-reaction操作专业性强，容易出现假阳性微量化，灵敏度高，操作快速简便RT-PCRNeed professional operation,and easilyMicro-quantization,high sensitivity,quick and easy operationappearfalsepositives比PCR敏感性和特异性更高，能定量需要专业人员操作RT-qPCRMore sensitive and specific than PCR,quantifiableNeed professional operation免疫层析试纸条操作快速简单，灵敏度和特异性均高含有半折叠或错误折叠蛋白质Immunochromatographic stripEasily operation,high sensitivity and specificityContains half-folded or misfolded proteins与RT-PCR方法相比检测进度较快温度恒定、耗时短、经济实惠RT-LAMPFaster detection progress compared withConstant temperature,short time,economicalRT-PCRmethod灵敏度高，无须标准品即可对核酸进行定量检测范围有限，需要精密仪器成本较高RT-ddPCRHigh sensitivity,no standard products can be used for nucleicThe relatively limited detection range,theacidquantificationhigh cost of precision instruments制作成本高，尚未广泛应用蛋白质芯片高通量，灵敏度高，操作快速简单The high production cost and no widelyProteinchipHigh throughput,high sensitivity,fast and easy operationused荧光分子印迹传感器特异性强，检测范围宽，灵敏度高，操作简单、耗时少分离过程复杂、尚未广泛应用Fluorescent molecular imprintingStrong specificity,wide detection range,highComplex separation process and no widelysensorsensitivity,easyoperation,lesstimeused高灵敏度和特异性强，在2 0 min内检测完成制作步骤复杂，材料昂贵MIPs-RLS传感器High sensitivityandspecificity,results obtainedThe complicated production steps and theMIPs-RLS sensorwithin20minutesexpensivematerials病毒-MIPs荧光传感器可现场操作、成本低、操作简单尚未广泛应用Virus-MIPs fluorescent sensorField operation,low cost,easy operationNo widelyused易制造、无须纳米材料，便于携带、能现场检测SPCE免疫传感器需4保存，稳定性较差Easy to manufacture,no nanomaterials required,easy toSPCEimmunesensorNeed to be stored at 4 C,poor stabilitycarry and can be used for field testingQD特异性标记可追踪病毒在细胞中的路径尚未广泛应用QD specificmarkerThe viruss path in the cell can be tracedNowidelyused参考文献（References）1晏仁潭，汤德元，张森，等.日本乙型脑炎病毒E蛋白毒力相关氨基酸位点的研究进展 J.中国兽医科学,2 0 2 1,51(7):908-912.YAN Rentan,TANG Deyuan,ZHANG Sen,et al.Researchprogress on the virulence-related amino acid sites ofJapanese encephalitis virus E protein J.Chinese Vete-rinary Science,2021,51(7):908-912.(in Chinese)2刘茜倩，魏建超，钟登科，等.中华按蚊源日本脑炎病毒的分离鉴定及其分子特征的分析 J.中国兽医科学，2017,47(1):16-22.LIU Xiqian,wEI Jianchao,ZHONG Dengke,et al.Iso-lation,identification and molecular characteris-tic of a Japanese encephalitis virus isolate fromAnopheles sinensisJJ.Chinese Veterinary Science,2017,47(1):16-22.(in Chinese)3樊欢，戚宇华，朱政，等.多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术检测病毒性脑炎脑膜炎病原体 J.中国人兽共患病学报，2 0 17 33（11)：991-995,10 0 1.FAN Huan,QI Yuhua,ZHU Zheng,et al.Application ofmultiplex PCR combined with invasive reaction andchromogenic reaction catalyzed by gold nanoparti-cles in detection of encephalitis and meningitisvirusJJ.Chinese Journal of Zoonoses,2017,33(11):991-995,1001.(in Chinese)4涂藤，尹清清，张鹏飞，等基于毛细管电泳的7 种猪源性疫病的多重PCR检测方法的建立 J.浙江农业学报，第54卷246中国兽医科学2021,33(4):618-631.TU Teng,YIN Qingqing,ZHANG Pengfei,et al.Estab-lishment and application of multiplex PCR-capil-lary electrophoresis for7 swine diseasesJ.ActaAgriculturae 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