不同地理位置的微生物差别.ppt

取自中国不同地区活性取自中国不同地区活性污泥泥样本中本中细菌群落的菌群落的 焦磷酸焦磷酸测序分析序分析 蒋一凡&刘苗苗&熊蓓蓓1材料：活性材料：活性污泥泥来源:8城市，10市政WWTPs，曝气池东部 西北 北部：SJZ（工废）这些WWTPs主要处理生活污水，大多数WWTPs采用（A/O，A/A/O，OD）样本处理：无菌塑料瓶（11）-80 一个晚上 干冰运输 实验室WX（CAST）MASSZ（工废，SBR）HF（工废）NJLZ（工废，CASS）ULMQ（AB）2研究目研究目标估计来自不同地理位置样本的细菌群落组成的相似性和差异性获得活性污泥样本中微生物相互作用的更好理解3研究意研究意义研究这些复杂又多样化群体物种（共生模式）之间的相互作用能够很好地理解在污水处理过程中这些细菌群体的作用 作用：细菌在活性污泥中起主导因素而且在去除有机污染物，毒素和营养素起到重要作用对活性污泥中细菌组成的更好理解可以提供有用的信息去改善污水处理效率以及阐明微生物对活性污泥的形成，发展和功能的影响4研究方法研究方法的确定的确定第二代高通量测序：提供足够的序列长度来覆盖复杂的微生物群体网路分析：分类关系是活性污泥中细菌群落形成的主导因素5研究方法及研究方法及过程程DNA提取PCR扩增（聚合酶链式反应）焦磷酸测序序列分析数据分析网路分析6各研究方法的目的各研究方法的目的高通量测序：活性污泥样本中细菌群落的组成NMDS和ANOSIM：活性污泥中细菌群落构成的显著的地理性差异16s rRNA基因检测技术：细菌多样性网路分析：10个污水厂中细菌的共生模式7DNA提取提取50ml样本，4000rpm（4）离心15min将悬浮液倒出，每个样本的三倍颗粒量（大约0.3g）用来DNA提取0.8%琼脂糖凝胶电泳：原DNA分析土壤微生物DNA强力提取试剂盒(人工指令):相同样本中抽取的三份DNA进行结合和提纯生物光度计：分析提取DNA的质量8PCR扩增增细菌的16S rRNA基因扩增：引物533R（5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3）引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3）533R：Roche 454“A”焦磷酸序列适配物，唯一的10 个碱基对序列 27F：Roche 454“B”反应体系（50 l）：10 l 5 Prime STAR Buffer(Mg2+Plus），0.2 mM dNTP，0.4 M的每个正向和反向引物，2.0 U TaKaRa Prime STAR HS DNA 聚合酶，100200 ng DNA模板循环条件：95C初始变性5min，94C 进行24个变性周期30s，55C退火30s，72C扩展30s，72C 扩展5minPCR产物：2%琼脂糖凝胶检查，DNA凝胶提取试剂盒提纯9焦磷酸焦磷酸测序序扩增子库：三个独立PCR产物的混合物 目的：使潜在的场PCR误差最小化不同污泥样本的扩增子混合 目的：实现同等质量浓度合并后的样本被送到上海的Majorbio公司进行基于Roche 454 FLX钛平台的焦磷酸测序获得的原始数据已经存入NCBI short-reads归档数据库(加入数字：SRX450095）10序列分析序列分析获得的序列数据使用Mothur1.30然后454SOP进行处理在进一步分析中排除：不包含精确匹配到引物的序列，含有任何模棱两可的读数和/或者拥有平均质量分数少于27且少于200个核苷酸(除了引物/碱基对序列区域)的序列 how?两两母体的距离用Mothur计算，在3%的距离使用更进一步的临界方法，获得的数据集中到OTUs序列被随意二次抽样,所获得的序列的最小值 进行alpha和beta多样性分析11数据分析数据分析二次抽样的序列被用来分析alpha的多样性，包括使用Mothur中的summary.single指令进行Chao1和Goods的覆盖率估计NMDS分析使用R vegan（版本：2.15.0）来研究细菌群落组成的相似性。0.2的应力水平对于NMDS情景是可以被接受的。相似性分析被用来检测不同群落的细菌群落组成的差异性（如西北和东部群落），相似度分析用来识别OTUs，OTUs指定西北或者东部样本。Mantel测试采用在R 2.15.0 环境下的vegan并通过999个排列数字实施：研究细菌群落组成的差异性和样本所处地理距离之间存在的联系Heat map通过R gplots执行：比较在每个样本中最充沛的属的细菌群落12网路分析网路分析建立一个相关母体：通过计算细菌属间所有可能的成对秩的等级相关来设想网路界面的相关性只考虑那些发生在所有样本中关系比例总共超过1%的至少3个样本的属充分同时发生的事件：秩的相关系数不仅0.6（或者-0.6），而且统计上显著的（P0.05）稳定的相关性。统计分析使用R Hmisc。在描述从充分属的成对比较中识别的稳定相关性的相关网路中，每个节点表示一种属，每一条线表示一种强烈和显著的相关性在观察网路之后使用Gephi进行计算13图表分析表分析11、各样品的覆盖率为90以上，表明足够测序深度14图表分析表分析2每个活性污泥的细菌群落分配在分类单元为门的分类结果15图表分析表分析3每个样品中的前10丰富属被选定（所有的10个样品共37个属），与其他样品中它们的丰富度使用热图分析进行比较。有三个属至少在7个样品中都是大量的（1%），包括Haliscomenobacter、暖绳菌属、TM7_genus_IS，在37个丰富属中，发现了如Iamia、Ilumatobacter、分枝杆菌等好氧菌。同时，大量的厌氧菌诸如Ignavibacterium，Anaerolinea和Caldilinea也被发现。一些属，包括GP4、GP6和OD1_genus_IS，没有得到很好的观察，并且不能明确地分为需氧或厌氧细菌。16分析分析图表表4细菌群落组合物与采样的地理位置密切相关ANOSIM：确定在不同的地理位置收集的样品细菌群落组成是否存在显著的统计学差异。如东部和西北部（R=1，P 0.40.4说明网路具有模明网路具有模块化化显著和著和稳定定的内部的内部正相关和正相关和门的的相互相互联系系。酸杆菌。酸杆菌门门的成的成员员（属属Gp 3Gp 3，Gp4Gp4，Gp6Gp6，Gp7,Gp16Gp7,Gp16，Gp Gp 1717）,共共现频现频率率为为2.942.94，比比随机随机联系下系下预测的更高的更高,正如正如从从观察到的察到的共生事件和理共生事件和理论随意性共生事件随意性共生事件计算的一算的一样。正正相关由相关由图图4a4a中橙中橙色厚色厚边缘边缘直直观观地地显显示。此外示。此外,对对于于门的相关性，的相关性，-变变形菌的成形菌的成员员往往往与放往与放线线菌和壁厚菌菌和壁厚菌门门的成的成员员共共现现。图图4 b4 b演示了一些演示了一些细细菌菌属属之之间间的的负负相关。一个独立相关。一个独立门的的负负相关相关在杆菌在杆菌门门的的HaliscomenobacterHaliscomenobacter和和FerruginibacterFerruginibacter之之中被中被发现发现20结论从中国西北和东部收集的活性污泥样本中的细菌群落组成显然不同核心属与活性污泥的地理位置及处理方法无关网路分析：从61细菌属鉴定，总共165对显著和稳定的相关性（正相关和负相关），2个网路化模块具有模块化结构2122无锡兰州马鞍山苏州石家庄乌鲁木齐合肥南京23*process测序从反向引物（533R）开始，原序列的反向互补序列被转换。剩下的序列用Mothur采用NAST（接近调整空间终端）算法与细菌SILVA 16S rRNA 基因模型进行比对，因为这个模型已经提供变化区域的质量比对。Mothur 中“pre.cluster”指令被用来消除那些有可能由于焦磷酸测序引起误差的序列。PCR嵌合体使用chimera.uchime指令实现用默认参数的Mothur软件进行检查和消除。剩下的序列被送到网上工具RDP分类，来获得分类信息。临界值80%的引导程序被运用于归属不同分类水平的序列。24why？与物理和化学处理方法相比较，活性污泥是一个极复杂的系统，而且由于它高处理效率和成本低已经被广泛地运用于污水处理厂传统分子技术（DGGE和克隆文库）一直用来研究废水处理系统中微生物群体。但是，由于活性污泥中细菌种类繁多，很难获得对细菌群落的更好理解25