艰难拟梭菌SpoOA蛋白结构及分子特性的生物信息学分析.pdf

卷第 期青海畜牧兽医杂志 /收稿日期:基金项目:青海省科学技术厅项目()青海高端创新人才计划()作者简介:王 芬()博士主要从事临床微生物检验 :.通讯作者:蔡其刚()博士副研究员主要从事动物疫病流行学与防控研究 :.艰难拟梭菌 蛋白结构及分子特性的生物信息学分析王 芬蔡其刚(遂宁市中心医院四川 遂宁 青海大学畜牧兽医科学院青海 西宁)摘 要:为了分析艰难拟梭菌 蛋白的结构及分子特性本研究从 蛋白质数据库中下载艰难拟梭菌 蛋白的氨基酸序列分别采用、等在线分析程序预测其理化性质、翻译后修饰位点、二级结构和保守结构域并利用 软件为不同物种来源的 蛋白构建进化树 结果表明艰难拟梭菌 蛋白序列长度为 分子量为 等电点理论值为 不存在信号肽及跨膜结构域并定位于胞质中 蛋白含有 和 两大结构域二级结构由 个 螺旋和 个 折叠组成含有 个酪蛋白激酶 磷酸化位点、个 肉豆蔻酰化位点和 个蛋白激酶 磷酸化位点 不同物种来源的 蛋白分为两大支其中 种芽孢杆菌聚为一支 种梭菌聚为另外一支 本研究运用生物信息学方法分析了艰难拟梭菌 蛋白的保守结构域及翻译后修饰位点为进一步研究其调控毒素表达的机制提供参考关键词:艰难拟梭菌蛋白结构分子特性生物信息学中图分类号:文献标识码:文章编号:()():()年第 卷第 期(总第 期)青海畜牧兽医杂志 :年 和 首次从健康婴儿肠道中分离出艰难梭菌()年美国微生物学会发布了临床微生物手册(第 版)并将艰难梭菌修改为艰难拟梭菌()艰难拟梭菌是一种革兰阳性杆菌专性厌氧可形成芽孢、无荚膜、有鞭毛 艰难梭菌可感染猪、小牛和人类等动物能够长期存在于土壤、家畜和人类粪便、污水、人类肠道和零售肉类中 艰难拟梭菌本身并没有侵袭性有产毒株和不产毒株之分不产毒株不致病产毒株通过分泌毒素、毒素 以及二元毒素引起毒素相关性腹泻或伪膜性肠炎等疾病 艰难拟梭菌作为一种产芽孢杆菌抗生素暴露、营养缺乏、消毒剂的使用等都可诱导其产生芽孢导致感染复发此外芽孢也可能播散到环境中造成感染广泛传播 芽孢形成转录因子 是细胞从营养生长期进入芽孢形成期的关键应答调节蛋白由一个受体结构域()和一个 结合结构域()组成参与芽孢杆菌属细菌芽孢的产生、生物膜的形成以及毒素产生等过程的调控功能基因组学研究提示艰难拟梭菌 在芽孢形成、毒力产生及代谢等生物学过程中发挥重要作用敲除 基因的艰难拟梭菌不能产生芽孢从而影响该菌在小鼠中的传播和持续感染能力 此外研究表明艰难拟梭菌 可调控毒素 和毒素 的表达但其机制尚不明确 本研究运用生物信息学方法分析艰难拟梭菌 蛋白的结构及生物学特性为进一步研究其调控毒素表达的机制提供参考 材料与方法 蛋白序列及登录号从 的蛋白质数据库中下载艰难拟梭菌 蛋白序列登录号为 生物信息学分析采用 程序(:/)分析艰难拟梭菌 蛋白的氨基酸组成、等 电 点、不 稳 定 指 数 等 理 化 性 质 采 用 程序(:/)的 算法绘制艰难拟梭菌 蛋白的亲/疏水性氨基酸分布图分别采用 程序(:/./.?.)、程序(:/./.?.)和 .程序(:/./)分析艰难拟梭菌 蛋白的信号肽序列、跨膜结构域及亚细胞定位采用 程序(:/./)分析艰难拟梭菌 蛋白的翻译后修饰位点采用 程序(:/./)分析艰难拟梭菌 蛋白的二级结构采用 程序(:/./)分析艰难拟梭菌 蛋白的保守结构域采用 程序(:/./)对 种物种来源的 蛋白序列进行两两比对并通过 .程序(:/./)为不同物种来源的 蛋白构建进化树 结果 理化性质艰难拟梭菌 蛋白序列长度为 分子式为 分子量为 等电点理论值为 带正电荷的残基数为 带负电荷的残基数为 不稳定指数为 亲/疏水性氨基酸分布图在艰难拟梭菌 蛋白序列中疏水性区域多于亲水性区域第 位氨基酸(苯丙氨酸)具有最低值 亲水性最强第 位氨基酸(异亮氨酸)具有最高值 疏水性最强(见图)信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位艰难拟梭菌 蛋白不存在信号肽及跨膜结构域定位于胞质中 翻译后修饰位点艰难拟梭菌 蛋白含有 个酪蛋白激酶 磷酸化位点(、)、个 肉豆蔻酰化位点()、个蛋白激酶 磷酸化位点()卷第 期青海畜牧兽医杂志 /图 艰难拟梭菌 蛋白亲/疏水性氨基酸分布图 注:横轴代表氨基酸位置纵轴代表亲/疏水性得分(正值代表疏水性最大值以 标示负值代表亲水性最小值以 标示)二级结构艰难拟梭菌 蛋白二级结构由 个 螺旋(其中 可信度较低)和 个 折叠组成 螺旋与 螺旋或 螺旋与 折叠之间由无规卷曲连接(见图)图 艰难拟梭菌 蛋白二级结构 注:图中红色方框为 结构域蓝色方框为 结构域 为预测结果的可信度颜色由浅变深颜色越浅可信度越低颜色越深可信度越高 为二级结构的卡通模型黄色圆柱代表 折叠()粉色圆柱代表 螺旋()灰色横线代表无归卷曲为软件所预测的二级结构 为蛋白序列中的氨基酸残基 年第 卷第 期(总第 期)青海畜牧兽医杂志.保守结构域艰难拟梭菌 蛋白含有两大结构域分别是应答调控信号接收区域()和芽孢形成起始因子 末端()(见图)图 艰难拟梭菌 蛋白的保守结构域.序列比对及进化树构建 种物种来源的 蛋白序列一致性为 (见表)可见 蛋白在不同物种间相对保守 为不同物种来源的 蛋白构建邻接树所有分支的自展值均 说明所构建的进化树可靠 不同物种来源的 蛋白分为两大支枯草芽孢杆菌()、解淀粉芽孢杆菌()、地衣芽孢杆菌()、巨大芽孢杆菌()、假霉菌芽孢杆菌()、炭疽杆菌()和蜡样芽胞杆菌()种芽孢杆菌 聚为一大支艰难拟梭菌()、产气荚膜梭菌()、肉毒梭菌()和乙酰丁酸梭菌()种梭菌 聚为另一大支(见图)表 不同物种来源 蛋白序列两两比对()登录号 卷第 期青海畜牧兽医杂志 /图 不同物种来源 蛋白构建的进化树 注:进化树分支上的数字代表自展值自展值 的分支越多代表所构建的进化树越可靠 不同物种来源 蛋白序列登录号如下:枯草芽孢杆菌 蛋白(登录号:)、产气荚膜梭菌 蛋白(登录号:)、假霉菌芽孢杆菌 蛋白(登录号:)、蜡样芽孢杆菌 蛋白(登录号:)、炭疽杆菌 蛋白(登录号:)、肉毒梭菌 蛋白(登录号:)、乙酰丁酸梭菌 蛋白(登录号:)、解淀粉芽孢杆菌 蛋白(登录号:)、巨大芽孢杆菌 蛋白(登录号:)、地衣芽孢杆菌 蛋白(登录号:)、艰难拟梭菌 蛋白(登录号:以标示)讨论所有可形成芽孢的杆菌均编码 蛋白该蛋白是芽孢形成基因表达过程的重要调控因子 国内外研究者对枯草芽孢杆菌 调控芽孢形成的机制进行了广泛研究一致认为组氨酸激酶 将磷酸基转移给 再将磷酸基转移给磷酸转移酶 从而使 发生磷酸化启动芽孢形成过程 虽然 蛋白在芽孢杆菌中高度保守但肉毒梭菌、艰难拟梭菌中并不存在编码 和 的基因推测 调控芽孢形成的机制有别于枯草芽孢杆菌艰难拟梭菌 在芽孢形成、毒力产生及代谢等生物学过程中发挥重要作用 等对艰难拟梭菌 保守结构域的重要残基进行定点突变发现第 位天冬氨酸是 活化所必需的磷酸化位点该位点的突变使芽孢产生量急剧减少 迄今为止对艰难拟梭菌 调控毒素表达的机制知之甚少对 蛋白的结构及生物学特性进行生物信息学分析可为进一步研究其调控毒素表达的机制提供参考生物信息学分析结果表明艰难拟梭菌 蛋白序列中不存在信号肽及跨膜结构域定位于胞质中提示该蛋白可能为一种非分泌非跨膜蛋白在胞质中合成后不进行蛋白转运在胞质中发挥功能艰难拟梭菌 蛋白由 组成不稳定指数为 (阈值)在蛋白序列中疏水性区域多于亲水性区域提示该蛋白为一种稳定蛋白艰难拟梭菌 蛋白含有 和 两大结构域二级结构由 个 螺旋和 个 折叠组成 结构域位于 含有 个 螺旋和 个 折叠 螺旋、区段在艰难拟梭菌 的活化过程中起重要作用 等通过鉴定发现多个在艰难拟梭菌芽孢形成过程中起重要作用的残基均位于以上区段证实了这些区段在芽孢形成过程中的重要性艰难拟梭菌 蛋白含有 个酪蛋白激酶 磷酸化位点 个 肉豆蔻酰化位点和 个蛋白激酶 磷酸化位点第 位天冬氨酸为艰难拟梭菌 蛋白序列中的酪蛋白激酶 磷酸化位点该位点的突变使芽孢产生量急剧减少提示该蛋白可能通过磷酸化/去磷酸化参与芽孢形成、毒力产生及代谢等生物学过程 种物种来源的 蛋白序列一致性为 可见 蛋白在不同物种间 年第 卷第 期(总第 期)青海畜牧兽医杂志高度保守 为不同物种来源的 蛋白构建邻接树 种芽孢杆菌 聚为一大支、种梭菌 聚为另一大支 虽然 蛋白在不同物种间高度保守但在枯草芽孢杆菌中表达肉毒梭菌 基因不能产生芽孢可能原因为肉毒梭菌 蛋白虽然可在枯草芽孢杆菌中表达但由于不发生磷酸化无法发挥功能 艰难拟梭菌与肉毒梭菌亲缘关系较近且均不编码 和 的基因可借鉴肉毒梭菌的研究思路探讨艰难拟梭菌 蛋白调控毒素表达的机制参考文献:林珊宋小军屈平华等.艰难拟梭菌重命名及相关致病因子研究进展.疾病监测():?.:():朱佳源谭周进郑淘等.艰难梭菌与抗生素相关腹泻的研究进展.中国感染控制杂志():赵宝鑫强翠欣赵建宏 艰难梭菌芽孢形成与萌发的研究进展.中国感染与化疗杂志():王皓东 蜡样芽孢杆菌基因 和 控制生物膜形成的作用机制研究.开封:河南大学 :.():宋晓蕾周芬芬胥腾等.对艰难梭菌毒素/蛋白表达的调节作用.中国感染与化疗杂志():.():.():.():.():.()():.():.():