间充质干细胞来源的外泌体治疗哮喘的研究进展.pdf

综 述文章编号（23）6-0673-04基金项目 天津市医学重点学科（专科）建设项目（T K Y X Z D X K-0 4 9 A）；天津市卫生健康科技项目（K J 2 0 0 1 5）；天津市津南区科技计划项目（2 0 2 0 0 1 1 6）作者简介 索睿（1 9 9 8-），女，硕士在读，研究方向：呼吸系统疾病；通信作者：赵晓赟，E-m a il：z x y d o c to r 1 6 3.c o m。哮喘是一种以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病，气道重塑在哮喘疾病进展中扮演着重要角色，主要以支气管平滑肌肥大/增生、气道上皮细胞黏液化生、上皮下胶原沉积和纤维化、血管增生以及基底膜增厚为特征。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在改善哮喘气道重塑中的疗效已经得到证实，其分化替代功能一直被认为是参与损伤组织修复的主要方式，但近年来研究发现MSCs旁分泌释放的外泌体（exosome，EXO）同样发挥了治疗作用。MSCs来源的外泌体（MSCs-EXO）是细胞间通讯的媒介，可传递生物活性脂质、核酸和蛋白质，虽然已被证实具有抗炎、免疫调节及促进组织修复和再生等作用，但目前在疗效上仍存在争议，未广泛应用于临床。本文对MSCs-EXO改善哮喘气道重塑的研究进展进行了综述，为后续研究提供参考。1哮喘概述哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病，以气道高反应性（AHR）、气道炎症和气道重塑为特征1。气道重塑通过基底膜增厚、细胞外基质沉积、气道平滑肌细胞异常生长等多方面过程参与哮喘进展2-3。哮喘的临床特征主要表现为反复发作性喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽（咳嗽变应性患者可无喘息），常表现为可变性呼气气流受限。哮喘在世界范围内发病率越来越高，全球有3亿哮喘患者，近年来由于人口和环境问题等原因，情况有所恶化4。目前哮喘的治疗主要以吸入糖皮质激素和扩张支气管等对症处理为主，但仍有至少15.5%的哮喘患者发作时需急诊就诊，7.2%的患者需要住院进一步治疗5。吸入糖皮质激素能有效控制大多数嗜酸性粒细胞型哮喘患者的症状，但中性粒细胞型类固醇抵抗性哮喘仍然是目前哮喘治疗的重大挑战。探索新的有效治疗方法来“根治”哮喘，更好地管理糖皮质激素反应不良或无反应哮喘患者是当务之急。2MSCs在哮喘治疗中的应用2.1MSCs概述MSCs又被称为多功能间质细胞，可来源于脂肪、骨髓、脐带血、羊水、牙髓等多种组织，早在1990年就被研究人员认识并逐渐被熟知。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）、脐带间充质干细胞（umbilicalcordmesenchymal stem cells，UCB-MSCs）和脂肪组织间充质干细胞（adipose tissuemesenchymal stemcells，AD-MSCs）是MSCs的主要来源6。尽管不同组织来源的MSCs在表型和功能特性上有所不同，但根据国际细胞治疗学会定义的最低标准：MSCs表达CD29、CD90、CD73、CD105、CD71、CD271，而不表达CD14、CD34、CD45和人白细胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）；具有黏附性；并具有分化成脂肪细胞、成骨细胞等中胚层细胞系的能力7。MSCs不仅具有组织修复能力、免疫抑制特性，并且可以释放许多生物因子，故在过敏性疾病中发挥关键作用8。MSCs还具有低免疫原性9。由于MSCs上主要组织相容性复合体（major histocompatibilty complex，MHC）类分子、Fas配体（Fas L）和T细胞共刺激分子低水平表达，故其更容易逃避免疫系统的攻击10-11。因此，异种异体MSCs的应用成为可能。间充质干细胞来源的外泌体治疗哮喘的研究进展索睿，郝天旭，茹仙古丽 吾买尔 综述，赵晓赟 审校（天津医科大学胸科临床学院，天津300222）摘要哮喘是由多种细胞（如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，长期慢性气道炎症导致气道高反应性、可逆性气流受限及气道重塑。间充质干细胞（MSCs）对改善哮喘小鼠的气道重塑有较好的疗效，其释放的外泌体可能在治疗过程中发挥重要的作用。外泌体是细胞间通讯的重要载体，在细胞间转运具有生物活性的脂质、核酸及蛋白质等，从而改变靶细胞的生物学功能。MSCs来源的外泌体具有抗炎、免疫调节及促进组织修复和再生等作用，是哮喘治疗的新靶点。关键词哮喘；间充质干细胞；外泌体；气道重塑中图分类号R562.2+5文献标志码天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷6期23年11月 29熏 6Nov.236732.2MSCs在哮喘治疗中的作用近年来，有关MSCs改善哮喘气道重塑和延缓哮喘病情进展的报道逐渐增多。MSCs具有良好的组织修复、炎症抑制和免疫调节功能。Knight等12研究表明，MSCs可直接分化为气道上皮细胞，发挥正常气道上皮细胞的功能，以改善哮喘引起的呼吸道损伤。Li等13认为在卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏大鼠尾静脉中植入胎盘源性间质干细胞，可以促进叉头盒蛋白P3（forkhead box P3，Foxp3）和白细胞介素（IL）-10的产生来增加调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）的数量，同时抑制RAR相关孤儿受体（RAR-relatedorphan receptor，RORt）和IL-17的产生以减少辅助性T细胞（Th）17的数量，从而改善哮喘的炎症。有研究将胎盘MSCs经尾静脉注入小鼠体内，结果显示支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞减少，Th2细胞因子IL-4水平降低，其下游B细胞分泌IgE受到抑制。随着这些变化，杯状细胞的增殖和黏液的合成接近正常水平，淋巴细胞向Th2的极化被中断14。虽然MSCs疗法可以有效抑制气道炎症、改善哮喘小鼠的肺功能、修复重塑的气道，但该法仍存在一定的局限性：若体外扩增和培养条件不当，仍可引起全身炎症反应，甚至可激活补体途径，诱导血栓形成；MSCs的长期体外培养会导致其干性下降，增殖分化能力下降，甚至寿命缩短；另外，有研究显示MSCs移植后，小鼠形成肉瘤的风险可能增加15。因此，携带生物活性成分的EXO受到广泛的关注，有望成为MSCs的替代疗法。3MSCs-EXO在哮喘治疗中的应用3.1MSCs-EXO概述EXO是由多泡体与细胞膜融合而释放的细胞外囊泡，直径约30150 nm，作为细胞间通信的媒介，通过转运核酸（miRNA、mRNA、DNA）、蛋白质、酶和代谢产物，从而改变靶细胞的生物学功能，在过敏性气道疾病进程中发挥关键作用16。EXO也是MSCs分泌途径的重要组成部分，可发挥与其母体相似的治疗效果，通过携带重要的细胞因子，调节免疫应答和细胞生物学功能17。BM-MSCs是制备EXO的最常用细胞来源，但近几年有研究表明，诱导多能干细胞（induced pluripotent stemcells，iPSCs）衍生的MSCs在表型和功能上与成人MSCs相似18，并表现出更高的增殖潜力、更长的生存时间、更强的免疫特性和更低的异质性19，这使它们成为大规模制备EXO的理想细胞来源。与基于MSCs的细胞治疗相比，MSCs-EXO的无细胞治疗具有免疫原性低、储存方便、生物安全性高等优点。且因为它们不能自主复制，故不会有肿瘤形成的风险；它们也可以通过过滤灭菌，比细胞本身具有更长的保质期；此外，长期重复给药EXO不会引起毒性20。到目前为止，已有两项临床研究报道MSCs-EXO用于治疗GVHD和慢性肾病（CKD）患者，且无严重不良反应21-22。因此，MSCs-EXO被认为是非常有希望的无细胞治疗药物，潜在地发挥整个细胞的功能的同时，又克服了许多伴随活细胞治疗的常见问题，为哮喘及其他呼吸道疾病的诊断和治疗提供了新的契机。3.2MSCs-EXO在哮喘治疗中的作用目前，多数MSCs-EXO在哮喘治疗及改善气道重塑中的应用尚处于实验研究阶段。MSCs-EXO在哮喘小鼠模型中通过减少气道中嗜酸性粒细胞、胶原纤维、肺组织中TGF-的产生和胸腺中CD3CD4+T细胞的数量，具有减轻肺炎症反应和逆转损伤组织重构的能力23，并可以促进Tregs细胞的增殖，增强免疫抑制能力24。EXO具有免疫调节的作用，可影响多种免疫细胞的表达。Fang等25发现给哮喘小鼠全身静脉输注iPSCs衍生的EXO后，在抑制炎症细胞浸润、气道高反应性、黏液分泌、下调Th2细胞因子和2组固有淋巴样细胞（group 2 innate lymphoid cells，ILC2s）功能方面具有显著作用，更具体地说，EXO中包装的miR146a-5p已被发现介导上述作用，使ILC2s为主的过敏性气道损伤恢复活力。Ren等26研究发现，多次较单次、鼻内较静脉更能提高肺间质巨噬细胞组成性表达IL-10，对OVA诱导的哮喘小鼠具有重要的保护作用，这为过敏性哮喘提供了一种新的预防策略。4MSCs-EXO治疗哮喘的机制4.1重塑巨噬细胞极化抑制炎症反应巨噬细胞是肺组织中最丰富的免疫细胞（约占所有免疫细胞的70%），在调节气道炎症和气道重塑中发挥重要作用。根据特异性细胞因子和表面标志物27的表达，巨噬细胞可分为经典活化型（M1）和选择性活化型（M2）。M1巨噬细胞可以分泌大量的炎症介质包括肿瘤坏死因子（TNF）-、IL-1、IL-6、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）28。这些炎症因子与中性粒细胞浸润、气道高反应性（AHR）和气道重塑29有关。M2巨噬细胞M2的生物标志物包括arginase-1（Arg-1）、CD206和IL-10产生的抗炎环境能促进组织修复30。若M1型和M2型巨噬细胞比例平衡被打破，可能会引起长期低程度的炎症反应。因此，M1和M2表型转换可能是哮喘的一种新的治疗途径。Dong等31研究发现，MSCs-EXO通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子1（tumor necrosis factor receptor-第29卷天津医科大学学报674associated factor 1，TRAF1）表达调节NF-B和PI3K/Akt信号通路，促进巨噬细胞M2极化，从而抑制炎症反应，促进肺损伤修复，减轻哮喘后的气道重构。4.2增加Tregs的比例及功能参与免疫调节Tregs是有效的免疫调节剂，其异常增殖和功能缺陷在哮喘的发生、发展中起着重要的作用。在一项研究中，评估了骨髓间充质干细胞外泌体（bonemarrowmesenchymalstemcellsexosomes，BMMSC-EXO）对哮喘 患 者 外 周 血 单 个 核 细 胞（peripheral bloodmononuclear cells，PBMC）的免疫调节作用，得到的数据表明，BMMSC-EXO上调了PBMC的IL-10和TGF-1，从而促进了Tregs的增殖和免疫抑制能力，对哮喘小鼠模型产生免疫调节作用24。Mun等32研究发现，鼻内给药脂肪间充质干细胞外泌体（adipose tissue-derived stromal cells exosomes，ADSC-EXO）通过诱导哮喘小鼠的Tregs扩增显著减少过敏性气道炎症并改善AHR。因此，ADSC-EXO可以作为哮喘的调节剂。由此可见，MSCs-EXO可通过多种途径，增加Tregs的比例，从而参加免疫反应，减轻哮喘小鼠的气道炎症反应，延缓气道重塑。4.3转移线粒体调节巨噬细胞氧化磷酸化研究表明，MSCs-EXO除了转运生物活性物质外，还具有转运线粒体的作用33-35。BM-MSCs将含有线粒体的EXO转移至外周T细胞，并调节哮喘中的T细胞免疫应答35。含有线粒体的MSCs-EXO能促进M2型巨噬细胞的极化和氧化磷酸化34，从而增强其生物能量，表明EXO在细胞间通讯中发挥新的作用，包括EXO转运线粒体和对靶细胞的生物能量学调节。4.4内源性miRNA可减轻气道重塑miRNA是EXO携带的一类重要分子，与哮喘的病理进展密切相关36。且EXO中的miRNA含量高于其亲代细胞。它们主要通过与靶基因3端非翻译区不完全配对，在转录后水平抑制靶基因的翻译过程，从而来调控炎症反应和信号通路。最近有研究表明，BMMSC-EXO来 源 的miR188可 以 通 过JARID2/Wnt/-catenin轴减弱哮喘小鼠模型中支气管平滑肌细胞的增殖和肺损伤。另一项研究显示，BMMSC-EXO来源的miR-221-3p可以通过抑制FGF2介导的ERK1/2信号通路，从而减弱了OVA诱导哮喘小鼠气道平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞外基质沉积，减轻哮喘进展37。此外，EXO可以显著降低支气管平滑肌细胞体外的异常增殖和迁移38。Feng等39研究了ADSC-EXO来源miR-301a-3p在哮喘小鼠模型中的治疗潜力。他们报道EXO被气道平滑肌细胞有效内化，其分泌miR301a-3p通过靶向STAT3显著下调炎症因子、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB），刺激细胞增殖和迁移，增加细胞凋亡，改善气道重塑。哮喘气道损伤的治疗一直是肺脏再生医学的热点和难点问题，传统的治疗方法和MSCs细胞疗法都存在一定的缺陷。现有的研究结果表明，MSCs-EXO具有抑制炎症反应、参与免疫调控、改善气道上皮重塑、延缓哮喘病情进展等作用，可能是比MSCs细胞疗法更为安全和经济有效的方式。但是到目前为止，由于对所涉及的分子机制了解有限，并且还没有大型的、随机的、安慰剂对照的临床试验来评估MSCs-EXO对哮喘的影响。作为一种无细胞替代治疗药物，对MSCs-EXO的研究尚处于起步阶段，如下问题需要解决：（1）哪一种MSCs是制备EXO的最佳来源。（2）全身（静脉、腹腔）或局部（气管内、胸膜内、鼻内）哪种给药途径能够达到最佳治疗效果。（3）在给药频次上，单次给药还是多次给药，哪种更好。（4）哪些成分在MSCs-EXO的生物学效应中起关键作用。（5）提取MSCs-EXO的金标准动物模型等。因此，未来仍需要开展大量临床研究，对MSCs-EXO在哮喘治疗中的效果、机制和安全性进行更深入的探讨。参考文献：1PRABHALA P，WRIGHT D B，ROBBE P，et al.Laminin 4 contributes to airway remodeling and inflammation in asthmaJ.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2019，317（6）：L768-L777.2BOULET L P.Airway remodeling in asthma：update on mechanismsand therapeutic 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