CircPTTG1IP调控...增殖、迁移和炎症反应的影响_冷冬月.pdf

现代医学Modern Medical Journal2023，Apr;51(4):454-46135(2):182-185 12 KHAN K，SAEED S，AMCHAAN A，et al A case series ofclosed head trauma with pituitary stalk disruption resulting inhypopituitarism J Int J Surg Case ep，2018，43:69-71 13WANG J Z，WITIW C D，SCANTLEBUY N，et al Clinicalsignificance of posttraumatic intracranial hemorrhage in clini-cally mild brain injury:a retrospective cohort study J CMAJOpen，2019，7(3):E511-E515 14 贾海勇，肖华，周俊甫，等 创伤性颅脑损伤患者继发感染的临床特点及危险因素 J 中国临床保健杂志，2022，25(4):489-492 15 王欢景，王华，何卫春，等 颅脑损伤并发垂体前叶功能减退的危险因素 J 中国临床神经外科杂志，2020，25(5):314-316 16 王碰起，高进喜，陈锦华，等 创伤性颅脑损伤早期患者ACTH 轴和 TSH 轴激素水平及相关指标的变化J 中华神经医学杂志，2020，19(6):566-575 17 梁前垒，郭永川，李朝晖 重型颅脑创伤患者早期并发腺垂体功能减退的临床诊治分析J 中华内分泌外科杂志，2020，14(1):56-59 18 甄志勇，郭丽娟，薛增珍，等 重症颅脑损伤病人炎症反应与凝血机制特点分析J 中西医结合心脑血管病杂志，2020，18(18):3100-3104 19 王雅静，付之雄 重症创伤性颅脑损伤后垂体前叶激素水平异常的影响因素及其对预后的预测价值J 中外医学研究，2022，20(13):58-62 收稿日期2023-02-01 修回日期2023-03-27 基金项目湖北省卫生健康委 20212022 年度科研项目(WJ2021F032)作者简介冷冬月(1985 )，女，湖北南漳人，主治医师，医学硕士。E-mail:ailwlt163 com 通信作者李旭峰E-mail:xnpev6j163 com 引文格式冷冬月，方兴刚，李旭峰 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响J 现代医学，2023，51(4):454-461 论著 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响冷冬月1，方兴刚1，李旭峰2 1 湖北省十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)中西医结合科，湖北 十堰442000;2 十堰市人民医院 中医科，湖北 十堰442000 摘要目的:探讨 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎(A)成纤维样滑膜(FLS)细胞增殖、迁移和炎症反应的影响。方法:实时荧光定量聚合酶链反应(qT-PC)、蛋白质印迹法(Western blot)检测正常 FLS 细胞和 A-FLS 细胞中 CircPTTG1IP、mi-223-3p 表达以及 SMAD3 蛋白表达;双荧光素酶实验验证 Circ-PTTG1IP 与 mi-223-3p、mi-223-3p 与 SMAD3 的关系。将 A-FLS 细胞分为 A-FLS 组、si-NC组、si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC 组、si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组，qT-PC 检测 A-FLS 中Circ-PTTG1IP、mi-223-3p 表达;CCK8 检测 A-FLS 增殖情况;流式细胞术检测 A-FLS 凋亡率;Transwell实验检测 A-FLS 细胞迁移及侵袭情况;Western blot 检测 SMAD3、EMT 相关蛋白表达;ELISA 法检测 IL-2、IL-6 水平。结果:与 FLS 组比较，A-FLS 组 CircPTTG1IP、SMAD3 上调，mi-223-3p 下调;与 A-FLS 组、si-NC 组比较，si-PTTG1IP 组 OD 值，A-FLS 细胞迁移、侵袭数量，Circ-PTTG1IP、SMAD3、N-cadherin、Vimentin蛋白表达，IL-6、MMP-2 水平均显著降低(P 0 05)，mi-223-3p 表达、细胞凋亡率、E-cadherin 蛋白表达以454及 IL-2 水平均显著升高(P 0 05);mi-223-3p 沉默减轻了上述指标的变化;Circ-PTTG1IP 靶向调控 mi-223-3p/SMAD3 轴。结论:沉默 Circ-PTTG1IP 可能通过上调 mi-223-3p 来抑制 SMAD3 表达，进而抑制 A-FLS 增殖、迁移和炎症反应。关键词Circ-PTTG1IP;mi-223-3p;类风湿关节炎;成纤维样滑膜细胞增殖;迁移;炎症反应 中图分类号593 22 文献标志码A 文章编号1671-7562(2023)04-0454-08doi:10 3969/j issn 1671-7562 2023 04 005Impacts of CircPTTG1IP on the proliferation，migration andinflammatory response of rheumatoid arthritis fibroblast likesynoviocytes by regulating mi-223-3p/SMAD3 axisLENG Dongyue1，FANG Xinggang1，LI Xufeng2 1 Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Taihe Hospital(AffiliatedHospital of Hubei University of Medicine)，Shiyan 442000，China;2 Department ofTraditional Chinese Medicine，Shiyan Peoples Hospital，Shiyan 442000，China AbstractObjective:To investigate the impacts of CircPTTG1IP on the proliferation，migration and inflammatoryresponse of fibroblast like synovial(FLS)cells in rheumatoid arthritis(A)by regulating mi-223-3p/SMAD3axis Methods:eal-time quantitative fluorescence polymerase chain reaction(qT-PC)and western blot wereused to detect the expression of CircPTTG1IP，mi-223-3p and SMAD3 protein in normal FLS cells and A-FLScells The relationships between Circ-PTTG1IP and mi-223-3p，mi-223-3p and SMAD3 were verified by dualluciferase assay A-FLS cells was divided into A-FLS group，si-NC group，si-PTTG1IP group，si-PTTG1IP+anti-NC group，and si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p group The expression of CircPTTG1IP and mi-223-3p inA-FLS was detected by qT-PC;CCK8 was used to detect the proliferation of A-FLS cells;flow cytometry wasused to detect the apoptosis rate of A-FLS cells;Transwell assay was used to detect migration and invasion of A-FLS cells;Western blot was used to detect the expression of SMAD3 and EMT related proteins;ELISA was used todetect the levels of IL-2 and IL-6 esults:Compared with FLS group，CircPTTG1IP and SMAD3 were up-regulated，and mi-223-3p was down-regulated in A-FLS group;Compared with A-FLS group and si-NCgroup，the OD value，the numbers of A-FLS cells migration and invasion，CircPTTG1IP，SMAD3，N-cadherin，Vimentin protein expression，IL-6 and MMP-2 levels in si-PTTG1IP group were significantly decreased(P 0.05)，the expression of mi-223-3p，apoptosis rate，the protein expression of E-cadherin and the level of IL-2were significantly increased(P 0 05);mi-223-3p silencing alleviated the changes of the above indicators;CircPTTG1IP targeted and regulated the mi-223-3p/SMAD3 axis Conclusion:Silencing CircPTTG1IP mayinhibit the expression of SMAD3 by up-regulating mi-223-3p，thereby inhibiting the proliferation，migration andinflammatory response of A-FLS Key words CircPTTG1IP;mi-223-3p;rheumatoid arthritis;fibroblast-like synovial cells proliferation;migration;inflammatory reaction类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，A)是一种慢性自身免疫性疾病，具有肌肉骨骼疼痛、肿胀和僵硬等常见症状，可损害患者的身体功能和生活质量1。滑膜组织是关节腔内的膜器官，在 A 的关节破坏中起重要作用2。作为与滑膜组织形成相关的关键细胞，成纤维样滑膜(fibroblast-like synovial，FLS)细胞参与滑膜关节的炎症反应，进而导致 A3。此外，研究4 报道称 A-FLS 具有类肿瘤细胞的性质，如增殖、侵袭、迁移和抗凋亡。因此，探索 FLS 在 A 中的病理机制可能有助于找到治疗 A 的新方法。研究5 发现非554冷冬月，等 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响编码 NA 参与自身免疫和炎症，在 A 发展中发挥重要作用。环状 NA(CircNA)是一种封闭的非编码NA，它可以通过与微小 NA(miNA)结合降低miNA 活性，进而增加 mNA 的稳定性，这在 A 疾病治 疗 中 起 关 键 作 用6。已 有 研 究7 发 现CircPTTG1IP 敲低可以抑制 A 的进展，而 Wu 等8 研究发现上调 mi-223-3p 可以抑制炎症因子表达进而缓 解 A。SMAD 同 源 物 3(SMAD homologue 3，SMAD3)在 A 患者中高表达，是 A 的潜在诊断生物标志物9。CircNA-miNA-mNA 轴在 A 中的作用已经被证实，如 circ_0088036 通过海绵化 mi-140-3p 和上调沉默信息调节因子 1(silence informationregulator 1，SIT1)促进 A-FLS 的增殖和迁移10。Circ_0000396 通过 mi-203/HMG box 蛋白 1(HMGbox protein 1，HBP1)轴抑制 A-FLS 的生长和炎症反应11。而关于 CircPTTG1IP 是否通过调控 mi-223-3p/SMAD3 对 A-FLS 增殖、迁移和炎症反应产生影响尚未见报道，本研究探究了在 A 中的 mi-223-3p、SMAD3、CircPTTG1IP 表达模式以及 CircPTTG1IP-mi-223-3p-SMAD3 在 A 中的作用和机制。1材料与方法1 1细胞及主要材料FLS(货 号:HT-X1905)、A-FLS(货 号:HT-X1835)购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司;si-NC、si-PTTG1IP、anti-NC、anti-mi-223-3p 购自上海生工生物工程有限公司;白细胞介素 2(IL-2)试剂盒(货号:IB-E10055)、白细胞介素 6(IL-6)试剂盒(货号:IB-E10049)购自江西艾博因生物科技有限公司;CCK8试剂盒(货号:SY0469-DN)、Annexin V-FITC 细胞凋亡试剂盒(货号:WK304)购自北京百奥莱博科技有限公司;SMAD3 抗体(货号:ab208182)、MMP-2 抗体(货号:ab181286)、E-cadherin 抗体(货号:ab40772)、N-cadherin 抗体(货号:ab98952)、Vimentin 抗体(货号:ab92547)购自 Abcam 公司。1 2A-FLS、FLS 细胞培养与分组将 A-FLS、FLS 置于 DMEM 培养基中培养，培养基中添加 10%FBS 和1%青霉素-链霉素，置于37，5%CO2条件下培养。待 A-FLS 培养至70%汇合时，参照 Lipofectamine 2000 试剂盒对 A-FLS 进行转染，分为 A-FLS 组(未处理的 A-FLS)、si-NC 组(si-NC转染 A-FLS)、si-PTTG1IP 组(si-PTTG1IP 转染 A-FLS)、si-PTTG1IP+anti-NC 组(si-PTTG1IP6 和 anti-NC 同时转染 A-FLS)、si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p组(si-PTTG1IP 和 anti-mi-223-3p 同时转染 A-FLS)5 组，未处理的 FLS 记为 FLS 组，所有细胞均在细胞培养箱中培养 48 h 后用于后续检测。1 3双 荧 光 素 酶 报 告 实 验 检 测 mi-223-3p、SMAD3、CircPTTG1IP 关系将含有 mi-223-3p 结合位点的野生型 Circ-PTTG1IP/SMAD3 序列和不含 mi-223-3p 结合位点的突变型 Circ-PTTG1IP/SMAD3 序列克隆到 pmirGLO 载体中，分别命名为 WT-PTTG1IP、MUT-PTTG1IP、WT-SMAD3、MUT-SMAD3，然后将上述序列与 mimic-NC或 mi-223-3p mimic 共转染到 A-FLS 中，分别记为mi-NC+WT-PTTG1IP 组、mi-223-3p mimic+WT-PTTG1IP 组、mi-NC+MUT-PTTG1IP 组、mi-223-3pmimic+MUT-PTTG1IP 组和 mi-NC+WT-SMAD3 组、mi-223-3p mimic+WT-SMAD3 组、mi-NC+MUT-SMAD3 组、mi-223-3p mimic+MUT-SMAD3 组。培养48 h 后使用双荧光素酶检测系统检测 A-FLS 的荧光素酶活性。1 4qT-PC 检测 mi-223-3p、CircPTTG1IP 表达使用 Trizol 试剂提取细胞的总 NA，根据反转录试剂盒说明书合成 cDNA。根据 qT-qPC 试剂盒配制 20 l 反应体系上机扩增以测定 mi-223-3p、CircPTTG1IP 的相对表达量。反应条件为:预变性95、5 min，38 个循环(95、45 s，62、30 s)，以U6 或 GAPDH 为内参基因，采用 2 ct计算 mi-223-3p、CircPTTG1IP 的相对表达量。引物序列见表 1。表 1qT-PC 的引物序列基因正向序列反向序列mi-223-3p5-GGCGCTTTGTCAGTTTGTCAAAT-35-GTGCAGGGTCCGAGGT-3CircPTTG1IP5-AGGAACGGAGAGCAGAGATG-35-GCGTGCAGAGCTCAATTTAC-3U65-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-35-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3GAPDH5-GGAGAGTGTTTCCTCGTCCC-35-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG-3654现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)1 5CCK8 检测 A-FLS 细胞增殖情况将各组细胞按每孔 1 104个的密度接种在 96 孔板上，48 h 后每孔加入 10 l CCK-8 试剂，共同孵育3 h后使用酶标仪检测 450 nm 处的光密度(OD)值。1 6流式细胞术检测 A-FLS 细胞凋亡用胰酶将各组细胞消化成细胞悬液，调整细胞浓度为 2 105个ml1。然后取 100 l 细胞悬液与10 l Annexin V-FITC 和 10 l 碘化丙啶混合染色10 min，用 PBS 洗涤两次后加入 480 l 结合缓冲液使细胞重悬，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率(%)=(细胞凋亡数目/细胞总数)100%。1 7Transwell 实验检测 A-FLS 细胞迁移及侵袭取对数生长期的细胞，加入无血清 DMEM 培养基重悬细胞后，将细胞浓度调整为1 105个ml1，上室包被 Matrigel 基质胶(迁移实验不包被 Matrigel 基质胶，其余同)，并加入 300 l 的细胞悬液，下室加入500 l含血清的 DMEM 培养基，将小室置于37、5%CO2条件下培养 24 h 后，棉签擦拭上室细胞，4%多聚甲醛固定，结晶紫溶液染色 20 min 后，置于显微镜(200 倍)下观察细胞侵袭(迁移)情况，并计数侵袭(迁移)细胞数。1 8ELISA 试剂盒检测 IL-2、IL-6 水平收集所有细胞的上清液，按照 IL-2、IL-6 ELISA 试剂盒说明书检测 IL-2、IL-6 水平。1 9蛋白质印迹法(Western blot)检测 SMAD3、MMP-2 以及 EMT 相关蛋白表达将细胞经 IPA 裂解缓冲液裂解后提取总蛋白，测定蛋白浓度后经凝胶电泳分离蛋白质，转移到 PVDF 膜上，用脱脂牛奶封闭，随后加入一抗 SMAD3(1 2 000)、MMP-2(1 1 000)、E-cadherin(1 2 000)、N-cadherin(1 1 000)、Vimentin(1 1 000)和 GAPDH 抗体(1 2 000)，在 4 下孵育过夜，TBST 洗涤 3 次后加入二抗，37 下孵育 1 h 后加入显色剂，用 Image J软件量化目的蛋白的灰度值。1 10统计学处理数据均使用 SPSS 25 0 软件处理，符合正态分布的数据均以均数 标准差表示，两组间比较采用 t 检验，多组间均值差异比较采用单因素方差分析，两两组间差异比较采用 SNK-q 检验。P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1CircPTTG1IP 与 mi-223-3p、SMAD3 的靶向关系分析通过 TargetScan 网站发现 CircPTTG1IP 与 mi-223-3p、mi-223-3p 与 SMAD3 存在结合位点，见图 1。与 mi-NC+WT-PTTG1IP 组比较，mi-223-3p mimic+WT-PTTG1IP 组细胞的荧光素酶活性显著降低(P 0.05)，而与 mi-NC+MUT-PTTG1IP 组比较，mi-223-3p mimic+MUT-PTTG1IP 组细胞的荧光素酶活性无显著变化(P 0 05);与 mi-NC+WT-SMAD3 组比较，mi-223-3p mimic+WT-SMAD3 组细胞的荧光素酶活性显著降低(P 005)，而与 mi-NC+MUT-SMAD3 组比较，mi-223-3p mimic+MUT-SMAD3 组细胞的荧光素酶活性无显著变化(P 005)，见表2、3。图 1TargetScan 网站预测 CircPTTG1IP 与 mi-223-3p、mi-223-3p 与 SMAD3 的结合位点表 2双荧光素酶报告实验验证 CircPTTG1IP 与mi-223-3p 的靶向关系(x s)组别n荧光素酶相对活性mi-NC+WT-PTTG1IP 组61 05 0 11mi-223-3p mimic+WT-PTTG1IP 组60 40 0 04ami-NC+MUT-PTTG1IP 组61 06 0 12mi-223-3p mimic+MUT-PTTG1IP 组61 03 0 10a 与 mi-NC+WT-PTTG1IP 组比较，P 0 05表 3双荧光素酶报告实验验证 mi-223-3p 与SMAD3 的靶向关系(x s)组别n荧光素酶相对活性mi-NC+WT-SMAD3 组61 02 0 10mi-223-3p mimic+WT-SMAD3 组60 39 0 04ami-NC+MUT-SMAD3 组61 04 0 09mi-223-3p mimic+MUT-SMAD3 组61 03 0 11a 与 mi-NC+WT-SMAD3 组比较，P 0 05754冷冬月，等 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响2 2CircPTTG1IP、mi-223-3p、SMAD3 在 FLS 细胞和 A-FLS 细胞中的表达与 FLS 细胞比较，A-FLS 细胞中 CircPTTG1IP、SMAD3 表达量显著上调(P 0 05)，mi-223-3p 表达量显著下调(P 0 05)，见图 2、表 4。图 2SMAD3 蛋白在 FLS 细胞和 A-FLS 细胞中的表达表 4CircPTTG1IP、mi-223-3p、SMAD3 在 FLS 组和 A-FLS 细胞中的表达(x s)细胞nCircPTTG1IPmi-223-3p SMAD3/GAPDHFLS61 00 0 061 00 0 050 99 0 09A-FLS61 95 0 290 34 0 031 93 0 19t 值7 85827 72610 925P 值0 0010 0010 0012 3CircPTTG1IP、mi-223-3p、SMAD3 在各组A-FLS 细胞中的表达与 A-FLS 组、si-NC 组比较，si-PTTG1IP 组 Circ-PTTG1IP 水平以及 SMAD3 蛋白水平显著降低(P 0.05)，mi-223-3p 表达显著升高(P 0 05);与 si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC 组比较，si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组 SMAD3 蛋白水平显著升高(P 0.05)，mi-223-3p 表达显著降低(P 0 05)，见图 3、表 5。图 3SMAD3 蛋白在各组 A-FLS 细胞中的表达2 4沉默 Circ-PTTG1IP 或 mi-223-3p 对 A-FLS增殖能力的影响与 A-FLS 组(0 91 0 10)、si-NC 组(0 92 0.11)比较，si-PTTG1IP 组 OD 值(0 43 0 05)显著减表 5Circ-PTTG1IP、mi-223-3p、SMAD3 在各组 A-FLS 细胞中的表达(x s)组别nCirc-PTTG1IPmi-223-3pSMAD3/GAPDHA-FLS 组61 00 0 001 00 0 001 91 0 20si-NC 组61 01 0 021 01 0 031 89 0 19si-PTTG1IP 组60 41 0 05ab1 64 0 17ab1 08 0 12absi-PTTG1IP+anti-NC 组60 42 0 041 63 0 161 09 0 10si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组60 40 0 041 03 0 11cd1 85 0 18cda 与 A-FLS 组比较，P 0 05;b 与 si-NC 组比较，P 0 05;c 与 si-PTTG1IP 组比较，P 0 05;d 与 si-PTTG1IP+anti-NC 组比较，P 0 05小(P 0 05);与 si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC组(0 42 0 04)比较，si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p组 OD 值(0 90 0 08)显著增大(P 0 05)。2 5沉默 Circ-PTTG1IP 或 mi-223-3p 对 A-FLS凋亡能力的影响与 A-FLS 组 (5 87 0 63)%、si-NC 组(5.54 0.55)%比较，si-PTTG1IP 组 A-FLS 凋亡率(38 97 1.65)%显著升高(P 0 05);与 si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC 组 (37 56 1.87)%比较，si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组 A-FLS 凋亡率(6 32 0 65)%显著下降(P 0 05)，见图 4。2 6沉默 Circ-PTTG1IP 或 mi-223-3p 对 A-FLS侵袭、迁移细胞数量以及 EMT 相关蛋白表达的影响与 A-FLS 组、si-NC 组比较，si-PTTG1IP 组 A-FLS 迁移、侵袭细胞数量以及 N-cadherin、Vimentin 蛋白表达均显著降低(P 0 05)，E-cadherin 蛋白表达显著升高(P 0 05);与 si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC 组比较，si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组 A-FLS 迁移、侵袭细胞数量以及 N-cadherin、Vimentin 蛋白表达均显著升高(P 0 05)，E-cadherin 蛋白表达显著下降(P 0 05)。见图 5 7、表 6。854现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)图 4各组 A-FLS 细胞凋亡情况的比较图 5各组 A-FLS 迁移细胞数量比较图 6各组 A-FLS 侵袭细胞数量比较图 7各组 A-FLS 细胞中 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达2 7沉默 Circ-PTTG1IP 或 mi-223-3p 对 A-FLSIL-2、IL-6 水平及 MMP-2 蛋白表达的影响与 A-FLS 组、si-NC 组比较，si-PTTG1IP 组 A-FLS IL-6、MMP-2 水平显著降低(P 0 05)，IL-2 水平显著升高(P 0 05);与 si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC 组比较，si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组 A-FLS 细胞 IL-6、MMP-2 水平显著升高(P 0 05)，IL-2水平显著下降(P 0 05)。见图 8、表 7。3讨论越来越多的研究表明，CircNA 在免疫系统调节954冷冬月，等 CircPTTG1IP 调控 mi-223-3p/SMAD3 轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎症反应的影响表 6各组 A-FLS 侵袭、迁移细胞数量以及 EMT 相关蛋白的比较(x s)组别n迁移细胞数量/个侵袭细胞数量/个E-cadherin/GAPDHN-cadherin/GAPDHVimentin/GAPDHA-FLS 组6158 97 15 75123 97 12 220 26 0 020 87 0 090 95 0 09si-NC 组6158 44 16 47125 86 13 970 26 0 020 88 0 080 97 0 10si-PTTG1IP 组6108 40 11 05ab90 86 10 95ab0 73 0 08ab0 32 0 03ab0 46 0 05absi-PTTG1IP+anti-NC 组6100 99 12 0495 64 10 670 74 0 090 33 0 020 44 0 04si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组6140 99 14 10cd117 12 12 12cd0 30 0 03cd0 83 0 08cd0 92 0 09cda 与 A-FLS 组比较，P 0 05;b 与 si-NC 组比较，P 0 05;c 与 si-PTTG1IP 组比较，P 0 05;d 与 si-PTTG1IP+anti-NC 组比较，P 0 05图 8各组 A-FLS 中 MMP-2 蛋白表达中起着至关重要的作用，并且与自身免疫性疾病(包括A)的发病和进展密切相关 12。既往研究 7 显示CircPTTG1IP 在 A 中 高 表 达，本 研 究 也 发 现CircPTTG1IP 在 A-FLS 中显著上调，表明 CircPTTG1IP可能促进 A 的进展。研究13 报道 IL-6 可诱导 A-FLS 增殖。免疫调节因子 IL-2 可通过抑制促炎细胞表 7各组 A-FLS 中 IL-2、IL-6 水平及 MMP-2 蛋白表达的比较(x s)组别nIL-2/ngL1IL-6/ngL1MMP-2/GAPDHA-FLS 组6116 98 11 2390 07 9 420 78 0 07si-NC 组6115 65 11 5392 12 9 750 77 0 08si-PTTG1IP 组6173 82 17 85ab35 23 3 76ab0 36 0 03absi-PTTG1IP+anti-NC 组6176 45 17 7436 05 3 960 38 0 04si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组6114 54 11 76cd87 65 8 89cd0 72 0 07cda 与 A-FLS 组比较，P 0 05;b 与 si-NC 组比较，P 0 05;c 与 si-PTTG1IP 组比较，P 0 05;d 与 si-PTTG1IP+anti-NC 组比较，P 0 05因子、趋化因子以及 MMPs 水平降低 A 细胞炎症反应14。本研究发现沉默 CircPTTG1IP 后 A-FLS 增殖活性，细胞迁移、侵袭数量，N-cadherin、Vimentin 蛋白表达，IL-6、MMP-2 水 平 均 降 低，细 胞 凋 亡 率、E-cadherin 蛋白表达以及 IL-2 水平均升高，提示沉默CircPTTG1IP 可抑制 A-FLS 增殖、迁移和炎症反应，促进其凋亡，进而抑制 A 的发展。CircNA 作为 miNA 海绵来调节基因表达15。miNA 在 A 发病机制中的作用已有大量报道，如沉默 CircASH2L 通过上调 mi-129-5p 抑制 A-FLS 的恶性生物学行为和炎症16;Circ_0088194 通过下调mi-766-3p 促进 A-FLS 的侵袭和迁移17。最近有报道8 称上调 mi-223-3p 可以抑制炎症因子表达进而抑制 A 进展。我们通过 TargetScan 网站分析以及双荧光素酶检测发现 mi-223-3p 与 CircPTTG1IP 存在负向调控关系，且本研究发现 mi-223-3p 在 A-FLS 中下调，沉默 CircPTTG1IP 后 A-FLS 中 mi-223-3p 表达上调，而与 si-PTTG1IP 组、si-PTTG1IP+anti-NC 组比较，si-PTTG1IP+anti-mi-223-3p 组 OD 值、A-FLS 迁移、侵袭数量以及 N-cadherin、Vimentin 蛋白表达、IL-6、MMP-2 水平均显著增加，细胞凋亡率、E-cadherin 蛋白表达以及 IL-2 水平均显著降低，与既往研究8 结果一致。提示 CircPTTG1IP 可能通过调控mi-223-3p 对 A 的发生发展产生影响。我们通过 TargetScan 网站分析以及双荧光素酶检测发现 mi-223-3p 与 SMAD3 存在负向调控，且有研064现代医学(Modern Medical Journal)2023 年 4 月，51(4)究9 报道 SMAD3 在 A 患者中高表达，是 A 诊断的生物标志物。SMAD3 与关节组织中的促炎性 IL-6 信号传导有关，增强的 SMAD3 信号传导促进了 A 小鼠的炎症发生18。另有研究19 报道下调 SMAD3 可降低 A-FLS 的致病行为并改善 A 的严重程度。本研究结 果 显 示，SMAD3 在 A-FLS 中 上 调，且 沉 默CircPTTG1IP 后 SMAD3 蛋白水平显著下调，下调 mi-223-3p 后会使 SMAD3 蛋白水平显著上调，表明沉默CircPTTG1IP 可 能 通 过 上 调 mi-223-3p 来 下 调SMAD3 表达，进而抑制 A-FLS 细胞增殖、侵袭、迁移和炎症反应，促进细胞凋亡。综上所述，沉默 CircPTTG1IP 可能通过上调 mi-223-3p 来下调 SMAD3 表达，进而抑制 A-FLS 细胞增殖、侵袭、迁移和炎症反应，促进细胞凋亡。本研究为A 的病理学研究提供参考依据，但是 CircPTTG1IP/mi-223-3p 对 SMAD3 的具体调控机制需要未来深入探究。参考文献 1庞琳烜，杨西超，李治琴，等 类风湿关节炎患者血浆 mi-146a 表达及基因高甲基化与疾病活动程度的关系 J 东南大学学报(医学版)，2022，41(6):818-824 2KUBOTA A，SUGUO T，NAKAJIMA A，et al Effect of bio-logical agents on synovial tissues from patients with rheumatoidarthritis J Mod heumatol，2020，30(2):282-286 3KAAMI J，ASLANI S，TAHMASEBI M N，et al Epigeneticsin rheumatoid arthritis;fibroblast-like synoviocytes as an e-merging paradigm in the pathogenesis of the diseaseJ Im-munol Cell Biol，2020，98(3):171-186 4WANG Q，CHU P，YU X，et al ZFAS1 knockdown inhibi