红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚psy基因的分离.doc

正文： 红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离

本科生毕业设计（论文）

题 目：红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离
学 院： 化学与生命科学学院
毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明

原创性声明
本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得 及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。
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目 录

摘要 1
英文摘要 1
1 引言 1
2 材料 2
2.1 植物材料 2
2.2 实验试剂 2
2.3 主要仪器和设备 2
3 方法 3
3.1 总RNA提取 3
3.1.1 常用试剂配制 3
3.1.2 器具处理与准备 3
3.1.3 提取RNA 3
3.2 RNA的纯化 4
3.3 RNA提取质量与含量检测 4
3.3.1 总RNA的电泳分析 4
3.3.2 总RNA含量与纯度测定 4
3.4 cDNA链合成 5
3.4.1 cDNA一链的合成 5
3.4.2 cDNA第二链合成 5
3.5 基因的克隆及序列分析 6
3.5.1 基因的克隆 6
3.5.2 割胶回收 6
3.5.3 T-载体连接 6
4 结果与分析 7
4.1 RNA电泳结果分析 7
4.2 RNA紫外分光光度计测定结果分析 7
4.3 纯化后RNA电泳结果分析 8
4.4 合成cDNA电泳结果分析 8
4.5 PSY基因的克隆 9
4.6 序列性分析 9
5 讨论 12
参考文献 14
致谢词 16

红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚PSY基因的分离
化学与生命科学学院 生物科学专业 付文佳（05260204）
指导老师：杨莉（副教授）
摘要：采用改良Bugos法提取红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚成熟果实果肉RNA，逆转录合成cDNA。根据NCBI网站公布的PSY基因全序列设计引物，采用高保真Taq聚合酶进行PCR扩增，将扩增产物连接到pUCm-T载体，转化至大肠杆菌DH5α，并送公司测序。比较发现，红肉蜜柚和琯溪蜜柚果肉PSY基因全长均为1317 bp，编码439个氨基酸，序列比对结果显示两者PSY基因与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，同源性最高达99 %。
关键词：红肉蜜柚；琯溪蜜柚；PSY基因；基因分离；序列分析
Isolating PSY Gene from Red-fleshed Sweet Pomelo and Its Parent Guanxi Sweet Pummelo
FU Wen-jia Director: YANG Li
(College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, 052 No.04)
Abstract：The total RNA was extracted from the ripe fruit of Red-fleshed sweet pomelo and Guanxi sweet pomelo using improved Bugos RNA extraction method, then were synthesised cDNA by reverse transcriptase kit. At the same time, we designed primers for PSY gene sequences according to the information PSY gene sequences on NCBI, high-fidelity Taq polymerase were used for PCR amplification and cDNA as the template. Finally, the PCR products were connected to pUCm-T vector, then sequenced and analyzed the sequences. Sequence analysis indicated that the cDNA fragment was 1317 bp, encoding a 439 amino acid protein and haved 99 % identity with those of other citrus in the highest level. The researching may be essential for the molecμLar mechanism of PSY gene mutation.
Key Words：red-fleshed sweet pomelo; guanxi sweet pummelo; PSY gene; gene isolationing; sequence analysis

1 引言
芽变是体细胞突变的一种，即突变发生在芽分生组织细胞中，当芽萌发长成枝条，表现出与原来植株不同的性状即为芽变，经突变的芽长成枝条经繁育可成为变异单株，是果树等多年生作物的一种特殊育种途径[1]。红肉蜜柚源自琯溪蜜柚芽变，
是平和县小溪镇厝丘村果农林金山于1988年在自家果园发现的优良芽变株[2]。之后，由福建省农科院果树研究所及平和县农业局等组成课题组，进行新品种的选育、保护和繁殖工作。经专家3年实地跟踪验证，认为该品种具备新颖性、特异性、一致性和稳定性，并于2006年正式通过了专家组的品种认定，正式命名红肉蜜柚[3]。经检测：红肉蜜柚的微量元素比野生型琯溪蜜柚含量更丰富，所含的黄酮类和类胡萝卜素共同具有抗癌作用，比其它柚类更具防心脏病，降血脂功效。红肉蜜柚也是目前国内外已选育出的红肉类型柚中果形最大，品质最优，成熟期早呈色最红、有益天然色素含量最高的品种，其开发前境较大。
近年来，越来越多的医学研究表明，除了不少类胡萝卜素代谢中间产物是维生素A的前体外，在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面也起着十分重要的作用[4]。因此类胡萝卜素既是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素，也是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标。了解植物类胡萝卜素积累的特点与代谢的生理机制，对于进一步调控植物类胡萝卜素的生物合成途径具有重要的意义。类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合成酶[5~7]。在番茄和油菜等植物中，PSY被证实是类胡萝卜素生物合成的关键调节酶之一。因此，PSY基因是应用植物基因工程改善转基因植物中类胡萝卜素含量的首选目的基因。此外，该基因在成熟叶片中的表达高于幼叶[8]。前人在温州蜜柑果实发育过程中的研究，已经明确在b-隐黄质的积累起关键作用的主要是位于类胡萝卜素生物合成途径上游的PSY基因，而非下游的BCH基因[9]。
本实验拟分离红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实PSY基因全长，比较分析二者序列是否存在差异，以了解PSY基因在突变体中的具体功能，为解释红肉蜜柚发生变异的分子机制提供理论基础。
2 材料
2.1 植物材料
成熟红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实由福建省农科院提供。
2.2 实验试剂
试剂Tris-HCl，EDTA，SDS购自北京博大泰克生物有限公司，b-巯基乙醇，DEPC（焦碳酸二乙酯），Tris饱和酚，LiCl购自北京鼎国生物有限公司，内切酶、连接酶，pUCm-T，DNase I载体购自宝生物工程（大连）有限公司，高保真Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，逆转录酶购自Promega生物技术有限公司，实验中涉及的引物由上海赛百盛生物有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯。
2.3 主要仪器和设备
高速台式冷冻离心机，电泳仪，电热恒温水浴锅，PCR仪，烘箱等。
3 方法
3.1 总RNA提取
3.1.1 常用试剂配制
①0.1 % DEPC溶液：在经高温烘烤4 h除RNA酶的试剂瓶中用ddH2O配制成0.1 % DEPC溶液，37 ℃放置12 h以上，120 ℃高压灭菌30 min；
②2 M NaCl：11.688 g NaCl溶于100 mL DEPC处理的ddH2O，120 ℃高压灭菌30 min；
③0.5 M EDTA：9.306 g EDTA溶于50 mL DEPC ddH2O，用氢氧化钠固体调节pH至9.0，120 ℃高压灭菌30 min；
④12 M LiCl：144.98 g L iCl加热溶解于200 mL DEPC ddH2O，120 ℃高压灭菌30min；
⑤0.1 M Tris-HCl：12.11 g Tris-HCl溶于灭菌过的 DEPC ddH2O，用浓HCl调节pH至9.0；
⑥3 M NaAc：12.3045 g NaAc溶于30 mL DEPC ddH2O，加冰乙酸调节pH至5.2，定容至50 mL，120 ℃高压灭菌30 min。
⑦70 %乙醇：取30 mL的DEPC ddH2O至70 mL无水乙醇中（DEPC ddH2O需先高压灭菌处理）。
3.1.2 器具处理与准备
①塑料制品（包括枪头、EP管等）：用DEPC ddH2O浸泡枪头、EP管，37 ℃放置过夜，121 ℃ 高压灭菌30 min，65 ℃烘干备用；
②玻璃制品：清洗干净，0.1 % DEPC ddH2O处理，65 ℃烘烤4 h。
③研钵：清洗干净，用锡泊纸包裹，180 ℃烘烤6~8 h。
3.1.3 提取RNA
参照徐昌杰等建立的适于柑橘果实RNA的改良Bugos方法提取成熟红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果肉总RNA[10, 11]。
①取3.5 mL提取液（提取液配方为0.1 M Tris，0.2 M NaCl，15 mM EDTA，0.5 % SDS，1 % b-巯基乙醇，pH 9.0），加1 g果肉（液氮研磨），混匀，室温放置5 min，加入1.5 mL Tris饱和酚，混匀，室温放置3 min；
②加入0.7 mL氯仿，混匀，室温放置3 min；
③加入0.28 mL NaAc，混匀，冰上放置15 min，4 ℃，10000 rpm离心20 min；
④上清液转至新的离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提；
⑤上清液转至新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）抽提；
⑥上清液移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，-70 ℃沉淀20 min；
⑦沉淀用1 mL DEPC ddH2O溶解，加入1/4 V LiCl混匀，冰上放置2 h（如有不溶杂质，在加LiCl前要离心去除）；
⑧4 ℃，10000 rpm离心20 min，沉淀用1 mL DEPC ddH2O溶解，加入1/4 VLiCl混匀，冰上放置2 h以上；
⑨离心，沉淀用0.6 mL DEPC ddH2O溶解；加等体积酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇各抽提一次，上清液加入2 V无水乙醇，1/10 V NaAc，-70 ℃沉淀20 min；
⑩离心，沉淀用70 %无水乙醇漂洗，室温晾干，最后视沉淀的量加入50~100 μL DEPC ddH2O溶解。
3.2 RNA的纯化
DNase I处理：将提取得到的红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果肉总RNA，加DEPC ddH2O补足到44.5 μL，再加入5 μL 10×反应缓冲液和0.5 μL DNase I，于37 ℃保温30 min。反应结束按如下操作处理：
①加DEPC ddH2O补足至300 μL，加等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，离心；
②上清液再加等体积氯仿/异戊醇抽提一次；
③加入1/10 V NaAc，2 V无水乙醇，混匀，-70 ℃沉淀20 min；
④4 ℃，12000 rpm离心15 min；
⑤沉淀用70 %乙醇漂洗；
⑥晾干，溶于20 μL的DEPC ddH2O。
3.3 RNA提取质量与含量检测
3.3.1 总RNA的电泳分析
取1 μL总RNA样品，稀释10倍，于1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，观察总RNA条带情况，凝胶成像，拍照。
3.3.2 总RNA含量与纯度测定
取1 μL总RNA样品，于紫外分光光度计上测OD230，OD260，OD280根据比值分析RNA纯度及含量。
3.4 cDNA链合成
参照Promega MMLV反转录酶使用说明，所使用引物如下：
SMART Oligonucleotide：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'
3' SMART™ CDS Primer II A：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30个T碱基)V N-3' (N = A，C，G or T；V = A，G or C)
5' PCR Primer II A：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
3.4.1 cDNA一链的合成
具体操作参见表1-1，表1-2。
表1-1 cDNA第一链合成

红肉蜜柚（μL）
琯溪蜜柚（μL）
RNA（2 ug）
3.5
1
3' SMART CDS primer 5'A (10 uM)
0.5
0.5
SMART Oligo(10 uM)
0.5
0.5
ddH2O
12.45
14.75
表1-1 cDNA第一链合成
70 ℃温育5 min后，立即转到冰上放置5 min；
表1-2 cDNA第一链合成

红肉蜜柚（μL）
琯溪蜜柚（μL）
5×RT Buffer
5
5
5' PCR Primer II A (10 uM)
1.25
1.25
RNA inhibitor
1
1
M-MLV 
1
1
42 ℃温育60 min，转至72 ℃温育10 min后，放置冰上保存。
3.4.2 cDNA第二链合成
反应体系及程序如下：
表1-3 cDNA第二链合成

红肉蜜柚（μL）
琯溪蜜柚（μL）
10×PCR Buffer
5
5
dNTPs
1.5
1.5
Taq DNA聚合酶
1
1
模板cDNA
3
3
ddH2O
38.5
38.5
total
50
50
PCR循环条件：95 ℃预变性1 min后，95 ℃15 s，65 ℃30 s，68 ℃6 min，28个循环，68 ℃延伸7 min，4 ℃保存。
3.5 基因的克隆及序列分析
3.5.1 基因的克隆
以成熟红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实cDNA为模板，以上游引物5’-ATGTCTGTTACATTGCTGTGGG-3’和下游引物5’-TTAAGCCTTACTGGTATAT
ATTCTTG-3’，PCR扩增程序如表1-4。
表1-4 PSY基因PCR扩增体系

红肉蜜柚（μL）
琯溪蜜柚（μL）
ddH2O
19.7
19.7
10×PCR Buffer(含Mg2+)
2.5
2.5
dNTPs
0.3
0.3
模板
1
1
P13
0.5
0.5
P14
0.5
0.5
Pfu Taq
0.5
0.5
total
25
25
PCR循环条件：94 ℃预变性4 min后，94 ℃50 s，50 ℃50 s，72℃90 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，5 ℃保存。
3.5.2 割胶回收
对目的条带进行割胶回收，回收步骤如下：
①将PCR产物在1 ％琼脂糖凝胶上电泳，切下所需DNA条带，将其装入1.5 mL离心管；
②200~400 mg琼脂糖凝胶加入0.4 mL纯化树脂，70 ℃保温5~10 min，每2 min颠倒混匀一次，使琼脂糖凝胶完全融化；
③将混合液用移液器装入离心纯化柱，13000 rpm离心30 s，倒掉废液；
④加入500 μL 80 ％乙醇，13000 rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液；（重复第4步一次，此步骤13000 rpm 离心2 min，务必将乙醇除尽）
⑤将纯化柱套入干净1.5 mL离心管中，加入25 μL超纯水于纯化树脂，70 ℃水浴2 min，13000 rpm 离心30 s；
⑥离心管中液体即是纯化DNA片段，取3 μL电泳检测并且测定含量。
3.5.3 T-载体连接、转化
按如下反应体系于16 ℃进行连接反应：pUCm-T 0.5 μL，DNA连接酶缓冲液1 μL，T4 DNA连接酶1 μL，回收产物7.5 μL。回收产物与生工pUCm-T载体进行连接克隆。使用自制DH5α感受态细胞进行转化，涂板于Amp抗生素的LB培养基中过夜培养，挑取单菌落，于含Amp抗生素的液体LB培养基进行培养，提取质粒，链接产物。
3.5.4 序列测定
鉴定后的克隆送至上海英俊生物技术有限公司测序，测序结果提交到NCBI中核酸数据库做BLAST同源性检索，并利用Clustal X软件对所得序列进行分析。
4 结果与分析
4.1 RNA电泳结果分析
RNA样品的凝胶电泳分析是判断RNA质量的一种重要手段，从电泳胶上28S rRNA和18S rRNA的完整性可以判断RNA有无降解及降解程度，也可以判断有无DNA污染。
　　　 1　　　 2
采用改良Bugos法提取红肉蜜柚突变体及其亲本琯溪蜜柚果实总RNA，色泽白，较为透明，易于溶解。样品经电泳检测表明，提取出总RNA能清楚地看到28S rRNA和18S rRNA两条RNA条带，提取的RNA完整，没有发生降解。

图1-1 果肉RNA琼脂糖凝胶电泳图谱
注：1. 红肉蜜柚；2. 琯溪蜜柚
4.2 RNA紫外分光光度计测定结果分析
一般情况下，紫外测定结果OD260/OD280比值为1.7-2.0，OD260/OD230比值大于2.0时认为获得的RNA样品较纯净。当OD260/OD280比值小于1.7时，可能有蛋白
表1-5 总RNA比色测定结果
紫外比色及比值
样品名称

红肉蜜柚
琯溪蜜柚
RNA的含量
564.0 ng/μL
1959.8 ng/μL
OD260/OD280
2.00
2.11
OD260/OD230
2.22
2.24
质污染；OD260/OD230比值小于2.0时，RNA样品可能还有其它如酚类化合物的干扰物存在[12]。从表1-5测定结果可以看出，OD260/OD230的吸光度比值大于2.0，说明没有多糖、盐或其他杂质的重大污染。OD260/OD280处的吸光度比值接近2.0，说明也没有蛋白质的重大污染，故用此法所提总RNA纯度较好，所以进行后续试验。

4.3 纯化后的RNA电泳结果分析
采用改良Bugos法提取所得RNA存在一定的DNA污染，因而应用这些样品进行RT-PCR或其它操作前应先用Dnase去除DNA，或对本方法所得RNA进行再次LiCl沉淀以进一步去除DNA。从图1-2来看，提取的样品已无DNA的污染。
1 2

图1-2 果肉RNA纯化后的电泳图谱
注：1. 红肉蜜柚；2. 琯溪蜜柚
4.4 合成的cDNA电泳结果分析
从图1-3来看，合成的cDNA二链呈弥散状，在500~750 bp间有特征带的出现，表明该物种果实中大部分基因的长度都在该区间内。
1 2
M 1 2 3
1300bp——

图1-3 cDNA二链电泳图谱
注：M. marker；1. 红肉蜜柚；2. 琯溪蜜柚；3. 阴性对照
4.5 PSY基因的克隆
琯溪蜜柚与红肉蜜柚PSY PCR结果显示，两者扩增片段大小相同，均扩增出单一的条带，大约为1300 bp，将片段回收，连接至T-载体，转化至大肠杆菌DH5α，经实验室初步验证正确后送上海英杰公司测序。
4.6 序列性分析
将测序结果整理如下（方框内为PCR扩增时所使用引物），测序结果表明，红肉蜜柚和琯溪蜜柚PSYcDNA均长1317 bp，与NCBI网站上其他相似序列比对结果发现，该DNA序列包含完整的阅读框，编码423个氨基酸。
（1）红肉蜜柚果实PSY基因全序列（红肉蜜柚PSY基因进行了两次测序，测序结果完全一致）：

ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGTTCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGGCTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTAATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGGAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACAGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAGGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTTTATCTACCACAAGATGAGTTGGCATAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACCTCATGAAGAACCAAATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAGGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA

将测序结果在NCBI网站比对，结果如表1-6。
表1-6 红肉蜜柚果实PSY基因测序结果比对
Accession
Description
Max score
Total score
Query coverage
Maxident
gi|166343817|EU375852.1
Citrus maxima phytoene synthase mRNA, complete cds
2448
2448
100%
99%
gi|82394886|DQ235260.1
Citrus sinensis phytoene synthase mRNA, complete cds
2402
2402
100%
98%
gi|6959859|AF220218.1
Citrus unshiu phytoene synthase (Psy1) mRNA, complete cds
2402
2402
100%
98%
gi|11344506|AB037975.1
Citrus unshiu mRNA for phytoene synthase, complete cds
2402
2402
100%
98%
续表1-6
gi|166343815|EU375851.1
X Citrofortunella mitis phytoene synthase mRNA, complete cds
2390
2390
100%
98%
gi|13542331|AF152892.2
Citrus x paradisi phytoene synthase mRNA, complete cds
2384
2384
100%
98%
注：Citrus maxima：文旦；Citrus sinensis：甜橙；Citrus unshiu：温州蜜柑；Citrofortunella mitis：四季橘；Citrus × paradisi：葡萄柚
通过比对结果发现：①红肉蜜柚果实PSY基因与柑桔属PSY基因同源性都相对较高，其中与柚PSY基因（No. 166343817）同源性最高；②与柚PSY基因（No. 166343817）比对发现：有一个TAA的gap存在；9个碱基不匹配。
（2）野生型琯溪蜜柚PSY基因全序列

ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGTTCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGACTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTGATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGAAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACGGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAAGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTATATCTGCCACAAGATGAGTTGGCACAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAACCAGATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAAGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA
将测序结果在NCBI网站比对，结果如表1-7。
表1-7 琯溪蜜柚果实PSY基因测序结果比对
Accession
Description
Max score
Total score
Query coverage
Maxident
gi|166343817|EU375852.1
Citrus maxima phytoene synthase mRNA, complete cds
2442
2442
100%
98%
gi|82394886|DQ235260.1
Citrus sinensis phytoene synthase mRNA, complete cds
2396
2396
100%
98%
gi|6959859|AF220218.1
Citrus unshiu phytoene synthase (Psy1) mRNA, complete cds
2396
2396
100%
98%
gi|11344506|AB037975.1
Citrus unshiu mRNA for phytoene synthase, complete cds
2396
2396
100%
98%
gi|166343815|EU375851.1
X Citrofortunella mitis phytoene synthase mRNA, complete cds
2384
2384
100%
98%
gi|13542331|AF152892.2
Citrus x paradisi phytoene synthase mRNA, complete cds
2379
2379
100%
98%
注：Citrus maxima：文旦；Citrus sinensis：甜橙；Citrus unshiu：温州蜜柑；Citrofortunella mitis：四季橘；Citrus × paradisi：葡萄柚
通过比对可发现：①与柑桔属PSY基因同源性都较高，其中与柚PSY基因（No. 166343817）同源性最高；②与柚PSY基因（No. 166343817）比对发现：有一个TAA的gap存在；8个碱基不匹配。
此外，我们还将红肉蜜柚突变体与野生型琯溪蜜柚果实PSY基因DNA序列和氨基酸序列进行比对分析，发现在1317 bp的编码区内出现11个差异位点，439个氨基酸序列中有7个差异位点，出现差异位点表1-8，1-9：
表1-8 红肉蜜柚和琯溪蜜柚PSY基因序列不一致情况分析

样品名称
碱基位点
248
352
455
613
904
969
975
994
1054
1068
1236
红肉蜜柚
A
G
A
G
A
A
G
G
T
G
A
琯溪蜜柚
G
A
G
A
G
T
A
T
C
A
G

表1-9 红肉蜜柚和琯溪蜜柚PSY基因合成的氨基酸序列不一致情况分析
样品名称
氨基酸位点
83
118
152
205
302
332
352
红肉蜜柚
G
N
G
R
G
Z
L
琯溪蜜柚
D
D
E
G
R
Q
F
5 讨论
类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一大类帖类色素物质，类异戊二烯是自然界中分布广泛的一类化合物，目前已知的类异戊二烯化合物有23000多种。所有的光合生物以及许多非光合细菌和真菌均可以在体内合成类胡萝卜素。类胡萝卜素是其中较为重要的植物色素，不仅参与光合作用和光保护，还赋予根、叶、花和果实等多彩的颜色，使之具有较大的经济价值和观赏价值。除此之外，类胡萝卜素中一些代谢中间产物还具有较高的营养和保健价值，如番茄红素能预防心脏病和多种癌症、减缓动脉粥样硬化、保护心血管、抗老化、保护皮肤等；b-胡萝卜素是维生素A原，维生素A缺乏会引起夜盲症等多种疾病的发生。
近年来，包括番茄红素和b-胡萝卜素在内的植物类胡萝卜素代谢途径的主要成员、关键酶及其基因已基本明确[13~16]。应用类胡萝卜素合成途径中相关基因的转基因研究也取得了较大进展，“黄金稻米”就是最成功的例子[17]。例如，Ye等[18]与Romer等[19]分别向水稻和番茄中导入类胡萝卜素合成途径相关基因，并未获得预期中高水平的番茄红素积累，却导致靶器官中b-胡萝卜素含量增加。由此可见，为减少类胡萝卜素遗传工程中的盲目性，阐明植物体内类胡萝卜素代谢相关基因表达调控机制十分必要。现有研究表明，类红萝卜素合成途径可包括上游（八氢番茄红素的合成）和下游（类胡萝卜素种类间的转化）途径。研究还表明下有途径的调控通常只能影响类胡萝卜素组成而对总含量影响较小。几乎所有高等植物类胡萝卜素合成主链途径均相同，柑桔类也不例外。类胡萝卜素上游合成途径需要十种酶参与，其活性的高低直接决定了果实类胡萝卜素的含量。在番茄等模式植物上的研究表明，在上述十种酶中以DXPS和PSY最为关键[20~22]。本研究根据GenBank中报道的植物类胡萝卜素代谢相关酶基因序列，分离了红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚果实PSY基因(八氢番茄红