T∕CACM 1326.33-2019 假鹰爪种子超低温保存技术规程.pdf

ICS 11.120.01 C 23 团体标准 T/CACM 1326.332019 假鹰爪种子超低温保存技术规程 Technical code of practice for cryopreservation of Desmos chinensis seeds 2019-10-17 发布 2019-10-17 实施 中 华 中 医 药 学 会 发 布T/CACM 1326.332019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 种子采收及选择.1 4.1 种子采收.2 4.2 种子选择.2 5 种子前处理.2 5.1 活力.2 5.2 含水量范围.2 6 种子保存量.3 7 种子冷冻方式.3 8 恢复培养.3 8.1 种子解冻处理.3 8.2 冻后种子活力检测.3 8.3 萌芽成苗.3 附录 A（规范性附录）试剂的配制和保存方法.4 参考文献.5 T/CACM 1326.332019 II 前 言 本标准是药用植物顽拗性种子超低温保存系列标准之一，该系列标准结构和名称如下：T/CACM 1326.1 药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则；T/CACM 1326.2 白木香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.3 降香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.4 益智种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.5 高良姜种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.6 朱砂根种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.7 草豆蔻种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.8 化州柚种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.9 樟种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.10 两面针种子超低温保存技术规程；。本标准按照 GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所，中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳，魏建和，郑希龙，李榕涛，王秋玲，何明军，金钺，顾雅坤，符丽。T/CACM 1326.332019 1 假鹰爪种子超低温保存技术规程 1 范围 本标准规定了假鹰爪（Desmos chinensis）种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等内容。本标准适用于假鹰爪种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 假鹰爪 Desmos chinensis 为番荔枝科（Annonaceae）假鹰爪属（Desmos Lour.）灌木，在我国南部山丘上常见，花美丽，海南民间有用其叶制酒饼，故也有“酒饼叶”之称。其根在广西壮药中称“棵漏挪”，瑶药中称“鸡爪风”，具有祛风利湿、健脾和胃、化瘀止痛等功效，用于水肿、风湿痹痛、烂脚等。收载于中华本草（1999）。3.2 假鹰爪果实 Desmos chinensis fruits 假鹰爪果实为浆果，有柄，呈念珠状连接成串，每串长 2 cm5 cm，聚生于果梗上，子房柄明显。内有种子 17 颗。3.3 假鹰爪种子 Desmos chinensis seeds 假鹰爪的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子淡黄色，球状，直径约 5 mm。3.4 种子超低温保存 seed of cryopreservation 将经过前处理的假鹰爪种子置于液氮（-196）中保存。4 种子采收及选择 T/CACM 1326.332019 2 4.1 种子采收 6 月翌年春季，果实成红色时，即可采收，去除果肉和果柄，取出种子。4.2 种子选择 挑选发育饱满、均匀、健康的种子，置于 4 冰箱中保存备用（存放时间不超过 2 个月）。5 种子前处理 5.1 活力 5.1.1 检测 假鹰爪种子活力以种子生活力为判别标准。按照植物生理学实验指导中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定假鹰爪种子生活力。待测种子在 30 35 温水中浸种 2 h，随后取吸胀种子 20 粒，整齐地埋于备好的 1.5 BTB 琼脂凝胶中，注意要将胚埋入凝胶中。将培养皿置于 35 温箱中 26 h后观察结果。BTB 的配制和保存方法见附录 A 的 A.1。5.1.2 鉴定及要求 在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。待保存的假鹰爪种子生活力应 50%。5.1.3 计算 生活力按照公式（1）进行计算：式中：A生活力；y有活力的种子数；x总的种子数。5.2 含水量范围 用尼龙网袋包裹假鹰爪种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为 60：1，室温条件下干燥处理 0 h22 h，在干燥过程可定期测定种子含水量，将种子含水量由 1520 降至 1415。按照 GB/T 3543.6 中的高恒温烘干法（130 烘干 1 h）测定种子含水量（W0），并按照公式（2）进行计算：T/CACM 1326.332019 3 式中：W0 种子含水量，用百分数表示（）；M1种子鲜重，单位为克（g）；M2种子烘后重量，单位为克（g）。6 种子保存量 假鹰爪种子保存量不少于 900 粒，以便后期的活力检测使用。7 种子冷冻方式 假鹰爪种子超低温保存的冷冻方式为玻璃化冷冻法，即将装有种子的 5 mL 冻存管（每管 45 粒种子）置于装载液（LS）中并于 25 处理种子 20 min，再用玻璃化保护溶液（PVS2）冰浴处理种子 30 min，换上预冷新鲜的 PVS2 后迅速投入液氮中进行超低温保存。LS 和 PVS2 的配制及保存方法见附录 A 的 A.2 和 A.3。8 恢复培养 8.1 种子解冻处理 液氮中至少冻存 24 h 后，取出 2 个冻存管，立即放入 40 水浴中快速解冻 2 min，而后用洗涤液（DS）浸泡 15 min，并用纯净水洗涤 3 次。DS 的配制及保存方法见附录 A 的 A.4。8.2 冻后种子活力检测 取出 1 管解冻后的种子，按照 5.1 活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力 20 时视为保存成功。8.3 萌芽成苗 将剩下 1 管解冻后的假鹰爪种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度 25 30，湿度 7085 条件下培养。T/CACM 1326.332019 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂的配制和保存方法 A.1 BTB 的配制和保存方法 精密称取 BTB 0.1 g，溶解于煮沸过的 100 mL 纯水中，然后用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，置于棕色瓶中长期贮存。1.5 BTB 琼脂凝胶：称量 0.1 BTB 溶液 40 mL 置于烧杯中，称取 0.5 g 琼脂，将其剪碎后加入杯中，加热并不断搅拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷却即可趁热倒入 9 cm 培养皿中，使之成一均匀的薄层，完全冷却后备用。A.2 装载液（LS）的配制及保存方法 精密称取蔗糖 13.7 g，称量甘油 11.9 mL，溶于液体 MS 培养基中，调 pH 至 5.8，并定容至 100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。A.3 玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法 精密量取甘油 23.8 mL、乙二醇 13.6 mL、二甲亚砜 13.6 mL，称取蔗糖 13.7 g，溶于 MS 溶液中，调 pH 至 5.8 后，定容至 100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。注：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。A.4 洗涤液（DS）的配制及保存方法 精密称取蔗糖 41.1 g 溶于MS溶液中，调 pH 至 5.8 后，定容至 100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。T/CACM 1326.332019 5 参 考 文 献 1 国家中医药管理局 中华本草 编委会.中华本草（第三册）M.上海科学技术出版社.1999:6 2 Li Ping-tao,Michael G.Gilbert.Annonaceae M/Flora Of China Beijing:Science Press/St.Louis:Missouri Botanical Garden Press.2011.19:681-682.3 中 国 科 学 院 中 国 植 物 志 委 员 会.中 国 植 物 志.第 30(2)卷 M.科 学 出 版 社,2004(1979):026 4 傅家瑞，宋松泉.顽拗性种子生物学M.中国科学文化出版社，2004:1 5 Reed BM.Plant CryopreservationA Practical GuideM.Springer,2010:3 _