茯苓多糖对癫痫大鼠海马神经...rf2ARE信号通路的影响_梁静.pdf

doi:10 3969/j issn 1002 7386 2023 02 007论著茯苓多糖对癫痫大鼠海马神经细胞凋亡及Nrf2ARE 信号通路的影响梁静陈汉仁毛敏芸蒋静子彭天婵作者单位:541001广西壮族自治区桂林市，桂林医学院附属医院神经内科【摘要】目的探讨茯苓多糖(PPC)对癫痫大鼠海马神经细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法将 SD 大鼠分为 NC 组、Model 组、茯苓多糖、中、高低剂量组(PPC-L 组，50 mg/kg;PPC-M 组，100 mg/kg;PPC-H 组，200 mg/kg)，每组 12 只。除 NC 组外，其他组均需构建癫痫大鼠模型。建模成功后，给药处理，1 次/d，连续 14 d。比较 5 组大鼠癫痫发作潜伏期的差异;通过 Morris 水迷宫实验检测各组大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒分别检测海马组织中 CAT、SOD、GSH 水平;TUNEL 染色检测神经细胞凋亡;western blot 检测大鼠海马组织中活化的 Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Bax、核因子 E2 相关因子 2(Nrf2)、血红素氧化酶(HO-1)、醌氧化还原酶 1(NQO-1)蛋白表达。结果与 NC 组比较，Model 组大鼠逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，海马组织中 SOD、CAT、GSH 水平及 Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达水平显著降低，神经细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Bax 蛋白表达水平显著升高(P 0 05);与 Model 组比较，PPC-L 组、PPC-M 组、PPC-H 组大鼠癫痫发作潜伏期延长，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，海马组织中 SOD、CAT、GSH 水平及 Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达明显升高，神经细胞凋亡率、Bax、Cleaved-Caspase-3 蛋白表达明显降低(P 0 05)。结论PPC 可抑制氧化应激，减少神经细胞凋亡，发挥抗癫痫作用，该机制可能与激活 Nrf2/ARE 信号通路有关。【关键词】茯苓多糖;癫痫;氧化应激;细胞凋亡【中图分类号】R 742 1【文献标识码】A【文章编号】1002 7386(2023)02 0194 04Effects of poria cocos polysaccharide on hippocampal neural apoptosis and Nrf2ARE signaling pathway in epilepticratsLIANG Jing，CHEN Hanren，MAO Minyun，et al Department of Neurology，Affiliated Hospital of Guilin MedicalUniversity，Guangxi，Guilin 541001，China【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of poria cocos polysaccharide(PCP)on hippocampal neural apoptosisin epileptic rats and possible mechanism MethodsThe SD rats were assigned to the normal control(NC)group，modelgroup，PCP low-dose group(PCP-L group，50mg/kg)，PCP medium-dose group(PCP-M group，100mg/kg)and PCP high-dose group(PCP-H group，200mg/kg)with 12 rats per group The epileptic rat models were established in the other groupsexcept for NC group The dosing regimen based on once daily for 14 days following successful modeling The differences ofseizure latency between groups were compared，Morris water maze(MWM)was used to detect escape latency，the number ofcross-platform The test kits were conducted to analyze for superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)and glutathione(GSH)The hippocampal neural apoptosis was observed by TUNEL staining Western blot was porformed to assess theprotein expression of cleaved caspase-3，Bcl-2 associated X protein(Bax)，nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)，hemeoxygenase-1(HO-1)and quinone oxidoreductase 1(NQO1)in hippocampus organization ResultsProlonged escape latencyand decreased crossing-platform were found in model group as compared to in NC group;the level of SOD，CAT，GSH and theprotein expression of Nrf2，HO-1 and NQO1 in model group were significantly decreased than those in NC group，while therate of neuronal apoptosis，cleaved-caspase-3，Bax expression in model group were evidently increased(P 0 05)Compared with model group，the seizure latency in PCP-L，PCP-M and PCP-H groups was prolonged，the escape latency wasshortened，crossing-platform frequency increased，the level of SOD，CAT，GSH and the protein expression of Nrf2，HO-1 andNQO1 were notably elevated，the rate of neuronal apoptosis，cleaved-caspase-3 and Bax expression were obviously decreased(P 0 05)ConclusionPCP functionalizes anti-epileptic effect by inhibiting the oxidative stress and reducing neuronalapoptosis，and the mechanism may be related to the activated Nrf2/ARE signaling pathway【Key words】poria cocos polysaccharide;epilepsy;oxidative stress;apoptosis癫痫是最常见的神经系统疾病之一，影响全球超过 7 000 万人，给患者、护理人员和社会带来巨大的身体、心理、社会和经济负担1。尽管癫痫研究取得了实质性进展，但约 35%的癫痫患者对抗癫痫药有抗药性，并长期经历反复自发性癫痫发作2。据报道，癫痫持续状态会导致线粒体呼吸链功能障碍并导致能量衰竭，进而加剧氧化应激的严重程度，并导致海马神经元损伤或死亡3。因此，从抑制氧化应激，降低海马491河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2神经细胞凋亡的角度开发新的药物，对于癫痫的治疗具有重要的意义。茯苓多糖(polysaccharides of poriacocos，PPC)来源于真菌茯苓的菌核，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种生物活性4。有研究显示，PPC 可抑制神经元凋亡，进而发挥对 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的帕金森小鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用5。本研究主要探讨 PPC 对癫痫大鼠海马神经细胞凋亡的影响以及可能的机制。1材料与方法11实验动物60 只 SPF 级 SD 大鼠购自广州赛业百沐生物科技有限公司，生产许可证号:SCXK(粤)2020-0055，大鼠均在标准条件下饲养。动物实验均遵循 3R 原则，本研究得到医院动物伦理委员会的批准。1 2主要试剂茯苓购自广印堂中药股份有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司;兔源一抗活化的 Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Bax、核因子 E2 相关因子 2(Nrf2)、血红素氧化酶(HO-1)、醌氧化还原酶 1(NQO-1)、-actin及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自天驰生物科技有限公司;TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物有限公司。13PPC 的制备参照文献6，用 95%乙醇脱脂，水提醇沉法提取，沉淀出的多糖经 Sevag 法除蛋白后透析，冷冻干燥，即可得到粗多糖提取物。1 4癫痫大鼠模型的构建及动物分组随机选取 48只大鼠构建癫痫大鼠模型，剩余 12 只作为 NC 组。参照文献7 进行癫痫模型构建:将大鼠按照 127 mg/kg的剂量腹腔注射氯化锂，20 h 后按照 1 mg/kg 的剂量皮下注射东莨菪碱，30 min 后按照 50 mg/kg 的剂量腹腔注射毛果芸香碱。NC 组大鼠腹腔注射等量的0 9%氯化钠溶液。通过 Racine 分级 8 判定癫痫发作级别，4 级持续 30 min 进入癫痫持续状态则认为造模成功。造模成功后，将癫痫大鼠模型随机分为 Model组、茯苓多糖低剂量组(PPC-L 组)、茯苓多糖中剂量组(PPC-M 组)、茯苓多糖高剂量组(PPC-H 组)，每组 12只。参考文献 9，10 及前期预实验结果，PPC-L 组、PPC-M组、PPC-H 组 大 鼠 分 别 按 照 50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg的剂量灌胃 PPC，1 次/d，连续14 d。NC 组和Model 组灌胃等量的09%氯化钠溶液。1 5大鼠癫痫发作潜伏期测定观察并记录 5 组大鼠末次给药 12 h 至首次出现 4 级癫痫的发作时间。1 6Morris 水迷宫实验7(1)学习能力:将大鼠放到任意一入水点，将其游到平台的时间记为逃避潜伏期，如果在 120 s 内不能游到平台，就引导其爬到平台，连续训练 5 d，记录第 6 天的逃避潜伏期。(2)空间记忆能力:第 7 天撤去平台，以距平台最远的地方为入水点，观察并记录大鼠 120 s 内穿越平台的次数。1 7氧化应激指标 SOD、CAT、GSH 水平的测定严格按照 SOD、CAT、GSH 试剂盒说明书操作步骤测定大鼠海马组织中 SOD、CAT、GSH 水平。1 8TUNEL 染色检测大鼠海马神经细胞凋亡将海马组织切片脱蜡至水，加入 3%H2O2及蛋白酶 K 孵育30 min 后，再加入 50 l TUNEL 反应混合物，在 37下孵育 60 min。最后加入 DAPI 染色 10 min，应用倒置显微镜观察细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=(染色阳性细胞数目/细胞总数)100%。1 9Western blot 检测蛋白表达RIPA 裂解缓冲液裂解并提取大鼠海马组织中的总蛋白。BCA 试剂盒测定蛋白质浓度，经电泳、转膜、封闭后，添加一抗Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1、-actin，均为 1 2 000 稀释，在 4下孵育过夜，然后与 HRP 偶联的羊抗兔二抗(1 1 000)孵育 1 h 后，通过 Image J 软件分析蛋白质条带灰度值。1 10统计学分析应用 SPSS 22 0 统计软件，计量资料以 珋x s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步 2 组间比较采用 snk-q 检验，P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1PPC 对大鼠癫痫发作潜伏期的影响NC 组大鼠没有癫痫发作的迹象，与 Model 组比较，PPC-L 组、PPC-M 组、PPC-H 组大鼠癫痫发作潜伏期延长，且呈剂量依赖性(P 0 05)。见表 1。表 15 组大鼠癫痫发作潜伏期比较n=12，min，珋x s组别癫痫发作潜伏期NC 组Model 组18 59 2 03PPC-L 组29 68 3 22*PPC-M 组41 34 3 87#PPC-H 组62 25 4 36#注:与 Model 组比较，*P 0 05;与 PPC-L 组比较，#P 0 05;与 PPC-M 组比较，P 0 052 2PPC 对大鼠学习与记忆能力的影响与 NC 组比较，Model 组逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P 0 05);与 Model 组比较，PPC-L 组、PPC-M 组、PPC-H 组大鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，且呈剂量依赖性(P 0 05)。见表 2。2 3PPC 对大鼠海马组织中氧化应激指标的影响与 NC 组比较，Model 组 CAT、SOD、GSH 水平明显降低591河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2表 25 组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数比较n=12，珋x s组别逃避潜伏期(s)穿越平台次数(次)NC 组12 35 1 178 12 0 54Model 组52 56 3 12*2 86 0 27*PPC-L 组43 67 3 343 98 0 41PPC-M 组31 78 2 85#5 05 0 46#PPC-H 组18 05 1 25#7 25 0 4#注:与 NC 组比较，*P 0 05;与 PPC-L 组比较，#P 0 05;与 PPC-M 组比较，P 0 05(P 0 05);与 Model 组比较，PPC-L 组、PPC-M 组、PPC-H 组 CAT、SOD、GSH 水平明显升高，且呈剂量依赖性(P 0 05)。见表 3。2 4PPC 对大鼠海马神经细胞凋亡的影响与 NC表 35 组大鼠海马组织中氧化应激指标 SOD、CAT、GSH 水平比较n=4，珋x s组别SOD(U/mg)CAT(U/g)GSH(mg/g)NC 组386 25 18 3925 86 1 621368 34 121 33Model 组128 85 8 36*8 35 1 02*589 62 40 95*PPC-L 组182 23 9 1213 05 1 11702 25 46 36PPC-M 组263 35 11 67#17 99 1 25#925 85 87 87#PPC-H 组340 21 15 52#23 36 1 37#1186 68 108 97#注:与 NC 组比较，*P 0 05;与 PPC-L 组比较，#P 0 05;与 PPC-M 组比较，P 0 05组比较，Model 组海马神经细胞凋亡率显著升高(P 0 05);与 Model 组比较，PPC-L 组、PPC-M 组、PPC-H组大鼠海马神经细胞凋亡率显著降低，且呈剂量依赖性(P 0 05)。见图 1，表 4。NC 组Model 组PPC-L 组PPC-M 组PPC-H 组图 15 组大鼠海马神经细胞凋亡(TUNEL 200)表 45 组大鼠海马神经细胞凋亡率比较n=4，珋x s组别细胞凋亡率(%)NC 组4 67 0 35Model 组48 75 2 54*PPC-L 组36 65 1 85PPC-M 组20 54 1 27#PPC-H 组9 87 0 84#注:与 NC 组比较，*P 0 05;与 PPC-L 组比较，#P 0 05;与 PPC-M 组比较，P 0 052 5PPC 对 5 组大鼠海马组织中凋亡蛋白及(Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)通路蛋白表达的 影 响与 NC 组 比 较，Model 组Cleaved-Caspase-3、Bax 蛋白表达明显升高(P 0 05)，Nrf2、NQO-1、HO-1 蛋白表达明显降低(P 0 05);与Model 组比较，PPC-L 组、PPC-M 组、PPC-H 组大鼠海马组织中 Cleaved-Caspase-3、Bax 蛋白表达降低(P 0 05)，Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达升高，且呈剂量依赖性(P 0 05)。见图 2，表 5。图 2western blot 检测 Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达;A NC 组;B Model 组;C PPC-L 组;D PPC-M 组;E PPC-H 组表 55 组大鼠海马组织中 Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达比较n=4，珋x s组别Cleaved-Caspase-3/-actinBax/-actinNrf2/-actinHO-1/-actinNQO-1/-actinNC 组0 24 0 010 61 0 030 59 0 040 72 0 050 88 0 07Model 组0 87 0 06*1 08 0 07*0 12 0 01*0 23 0 01*0 32 0 02*PPC-L 组0 71 0 050 92 0 060 21 0 020 35 0 020 45 0 03PPC-M 组0 58 0 04#0 78 0 05#0 33 0 02#0 46 0 03#0 69 0 05#PPC-H 组0 33 0 01#0 63 0 04#0 48 0 04#0 67 0 05#0 82 0 06#注:与 NC 组比较，*P 0 05;与 PPC-L 组比较，#P 0 05;与 PPC-M 组比较，P 0 053讨论癫痫的主要特征是反复发作和一系列神经行为合并症，包括认知障碍和社会适应行为异常11。研究表明，氧化应激与癫痫的进展及严重程度密切相关12。海马组织是对学习和记忆至关重要的大脑区域，其神经元损伤可引起认知功能障碍13。癫痫发作后，可引起海马组织神经元损伤14。本研究发现大鼠存在癫痫行为，逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，说明癫痫大鼠模型存在认知功能障碍。SOD、CAT、GSH 均为抗氧化酶，在机体中具有清除自由基的作用，其水平高691河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2则表明氧化应激受到抑制15。本研究发现，与 NC 组比较，Model 组大鼠海马组织中 SOD、CAT、GSH 水平显著降低，海马神经细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达显著升高，提示在癫痫大鼠模型中氧化应激增强，海马神经细胞凋亡升高。近年来，关于 PPC 在改善机体氧化应激、细胞凋亡方面的研究越来越多。如 PPC 提取物对小鼠酒精性肝损伤具有保护作用，其机制与抑制 TLR4/NF-B炎症信号通路，减轻氧化应激和炎症损伤有关16;PPC 能增强肾脏抗氧化性，保护自由基介导的氧化损伤，可以治疗或延缓糖尿病肾病的发生17;PPC 对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤具有保护作用，其机制可能与增强肝脏抗氧化能力及减轻炎症有关18;PPC 能抑制 2 型糖尿病小鼠肾组织中 Bax 基因过多表达，使糖尿病状态下肾组织细胞凋亡趋势受到抑制19。但关于 PPC 对癫痫大鼠氧化应激及神经细胞凋亡的影响笔者尚未见报道。本研究结果显示，与 Model 组比较，PPC 低、中、高剂量组大鼠癫痫发作潜伏期延长，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，海马组织中 SOD、CAT、GSH 水平显著升高，海马神经细胞凋亡率显著降低，提示 PPC 可能通过提高抗氧化酶活性抑制氧化应激，从而减少神经细胞凋亡，进而发挥对癫痫大鼠的神经保护作用。Nrf2 是抗氧化防御系统中的重要调节剂，其可与ARE 结合形成 Nrf2-ARE 复合体，激活 HO-1、NQO-1等具有抗氧化能力的酶20。相关研究报道，辛伐他汀通过激活 Nrf2/ARE 通路增强 Nrf2 和 HO-1 表达，发挥抗氧化作用、抑制细胞凋亡，实现对急性肺损伤大鼠的保护作用21;白藜芦醇通过其抗氧化作用抑制了草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞的损伤及黏附，此作用可能与激活 Nrf2/ARE 信号通路有关22。本研究结果显示，与 NC 组比较，Model 组大鼠海马组织中 Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达水平显著降低，提示 Nrf2/ARE信号通路可能参与了癫痫大鼠的氧化应激及神经细胞凋亡过程;与 Model 组比较，PPC 低、中、高剂量组大鼠海马组织中 Nrf2、HO-1、NQO-1 蛋白表达水平显著升高，且呈剂量依赖性，提示 PPC 可能通过激活 Nrf2/ARE 信号通路抑制氧化应激，减少神经细胞凋亡，发挥抗癫痫作用。综上所述，PPC 可抑制氧化应激，减少神经细胞凋亡，发挥抗癫痫作用，该机制可能与激活 Nrf2/ARE 信号通路有关。参考文献1Thijs RD，Surges R，O Brien TJ，et al Epilepsy in adults Lancet，2019，393:689-7012Olowe R，Sandouka S，Saadi A，et al Approaches for Reactive OxygenSpecies and Oxidative Stress Quantification in Epilepsy Antioxidants(Basel)，2020，9:990-10133Lin TK，Chen SD，Lin KJ，et al Seizure-Induced Oxidative Stress inStatus Epilepticus:Is Antioxidant Beneficial Antioxidants(Basel)，2020，9:1029-10514刘星汶，徐晓飞，刘玮，等 茯苓多糖的提取、结构、活性和作用机理研究进展 食品研究与开发，2021，42:172-1785高贵珍，吴超，薛宏宇，等 硫酸化茯苓多糖对 MPTP 诱导的小鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用 中国临床药理学与治疗学，2017，2237-22426潘世杰，丁丽婷，胡婕伦，等 茯苓多糖对乙醇致小鼠急性胃黏膜损伤的辅助保护作用 食品研究与开发，2021，42:1-67周宾，冯涛，刘晓，等 铁皮石斛多糖对癫痫大鼠认知功能及海马神经元凋亡的影响 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