无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C的B细胞抗原表位预测与鉴定.pdf

新 疆 农 业 大 学 学 报 2 0 2 3,4 6(4):2 7 72 8 4 J o u r n a l o f X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t yD O I:1 0.2 0 0 8 8/j.c n k i.j x a u.2 0 2 3.0 4.0 0 3无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C的B细胞抗原表位预测与鉴定李胜男1,王汉青1,吕芬芬1,赵海利2,苏 艳1(1.新疆农业大学 动物医学学院,乌鲁木齐 8 3 0 0 5 2;2.新疆昭苏县农业农村局,昭苏 8 3 5 5 0 0)摘 要:旨在表达牛源无乳链球菌(S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e)甘油醛-3-磷酸脱氢酶C(G a p C)蛋白并对其免疫效果进行评估,预测并鉴定其优势B细胞抗原表位。本研究对无乳链球菌X 1 6 0 8 7株的G a p C基因扩增,构建重组质粒p E T-2 8 a-WR-X 1 6 0 8 7,经诱导表达后纯化G a p C蛋白,免疫小鼠并分析免疫效果。对G a p C蛋白进行生物信息学分析,预测并鉴定其B细胞表位。结果表明,重组质粒经诱导表达纯化后,获得大小为4 4 k D a的目的蛋白,免疫小鼠后抗体效价可达12 1 8 7 0 0,抗体亚型以I g G 1和I g G 2 b为主;小鼠免疫后保护率可达1 0 0%;G a p C免疫后可显著减少攻击后小鼠肝、脾、肺、肾中的菌体载量;G a p C蛋白可减少细菌入侵对小鼠造成病理损伤。预测并筛选了G a p C的B细 胞 表 位,确 定 了3个 具 有 良 好 抗 原 性 的B细 胞 线 性 表 位,分 别 为:4 6KY D T T QG R F D G T V E VK D G6 3、1 2 1TA P G GN D V1 2 8、1 8 6MV L D G P HR G G D L R R A R2 0 1。鉴定表明,3个B细胞表位有成为牛源无乳链球菌预防性表位疫苗的潜力。关键词:无乳链球菌;G a p C蛋白;免疫效果;B细胞表位;筛选与鉴定中图分类号:S 8 5 2.4 文献标识码:A P r e d i c t i o n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f B C e l l E p i t o p e s o f G a p C P r o t e i n o f S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a eL I S h e n g-n a n1,WANG H a n-q i n g1,L V F e n-f e n1,Z HAO H a i-l i2,S U Y a n1(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,X i n j i a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 5 2,C h i n a;2.A g r i c u l t u r a l a n d R u r a l B e u r a u o f Z h a o s u C o u n t y,X i n j i a n g,Z h a o s u 8 3 5 5 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:T o e x p r e s s t h e G l y c e r a l d e h y d e-3-P h o s p h a t e D e h y d r o g e n a s e(G a p C)p r o t e i n o f S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e f r o m b o v i n e a n d e v a l u a t e i t s i mm u n e e f f e c t,p r e d i c t a n d i d e n t i f y i t s d o m i n a n t B c e l l e p i t o p e.I n t h i s s t u d y,t h e G a p C g e n e o f S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e X 1 6 0 8 7 s t r a i n w a s a m p l i f i e d a n d t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T-2 8 a-WR-X 1 6 0 8 7 w a s c o n s t r u c t e d.A f t e r i n d u c t i o n a n d e x p r e s s i o n,p u r i f i e d G a p C p r o t e i n w a s u s e d t o i mm u n i z e m i c e a n d t h e i mm u n e e f f e c t w a s a n a l y z e d.T h e n b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d t o p r e d i c t a n d i d e n t i f y t h e B c e l l e p i t o p e s o f G a p C p r o t e i n.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t a f t e r i n d u c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n,t h e t a r g e t p r o t e i n w i t h a s i z e o f 4 4 k D a w a s o b t a i n e d.A f t e r i mm u n i z i n g,t h e m i c e a n t i b o d y t i-t e r r e a c h e d 12 1 8 7 0 0,a n d t h e a n t i b o d y s u b t y p e s m a i n l y w e r e I g G 1 a n d I g G 2 b;m i c e p r o t e c t i o n c o u l d r e a c h 1 0 0%.G a p C i mm u n i z a t i o n c o u l d s i g n i f i c a n t l y r e d u c e t h e b a c t e r i a l l o a d i n l i v e r,s p l e e n,l u n g a n d k i d-n e y o f m i c e.G a p C p r o t e i n c o u l d r e d u c e t h e p a t h o l o g i c a l d a m a g e c a u s e d b y b a c t e r i a l i n v a s i o n i n m i c e.T h e B c e l l e p i t o p e s o f G a p C w e r e p r e d i c t e d a n d s c r e e n e d.B a s e d o n t h e s p e c i f i c a n t i b o d i e s,t h r e e l i n e a r B c e l l e p i t o p e s o f G a p C w e r e i d e n t i f i e d:4 6KY D T T QG R F D G T V E VK D G6 3,1 2 1T A P G GN D V1 2 8,1 8 6MV L D G P HR-G G D L R R A R2 0 1.T h e f i n d i n g s h o w e d t h a t t h e t h r e e B c e l l e p i t o p e s h a d t h e p o t e n t i a l t o b e u s e d i n p r o p h y-l a c t i c e p i t o p e v a c c i n e s a g a i n s t b o v i n e m a s t i t i s o f S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e.收稿日期:2 0 2 3-0 6-1 5基金项目:新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目(X J E D U 2 0 1 8 I 1 0 0 9)通讯作者:苏 艳,E-m a i l:2 0 0 6 a u 1 6 3.c o m新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 K e y w o r d s:S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e;G a p C p r o t e i n;i mm u n e e f f e c t;B c e l l e p i t o p e s;s c r e e n i n g a n d i d e n-t i f i c a t i o n 奶牛乳房炎是奶牛养殖业中的重要疾病1,2。能引起奶牛乳房炎的致病菌有1 5 0余种3,其中无乳链球菌(S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e)是最重要的病原体之一4,大多引起隐性乳房炎,而隐性乳房炎所造成的经济损失比临床型乳房炎更大5。近年来,疫苗成为防治奶牛乳房炎的研究热点6,7,蒋业慧等用无乳链球菌灭活疫苗免疫奶牛8,但灭活疫苗对奶牛免疫保护力较差9。胡长敏等用无乳链球菌S I P亚单位疫苗免疫小鼠,发现其免疫效果优于灭活疫苗1 0。G a p C蛋白具有3-磷酸甘油醛脱氢酶(GA P DH)活性,是参与细胞基本代谢和糖酵解途径的一种关键酶;G a p C蛋白是该菌的毒力因子和保护性抗原1 1。孔智翔等通过对G a p C序列进行同源性比对研究发现G a p C在停乳链球菌(S t a p h y-l o c o c c u s d y s g a l a c t i a e)、乳房链球菌(S t a p h y l o c o c-c u s u b e r i s)和无乳链球菌中具有交叉免疫保护作用1 2。魏玉华等用停乳链球菌G a p C重组亚单位疫苗免疫奶牛,使停乳链球菌引起的乳房炎发病率降低7 0%1 3。抗原表位是抗原分子中能够有效被免疫系统识别并诱发免疫的区域,安全性高且免疫效果好1 4,张丽萌等对G a p C蛋白筛选获得了一个高度保守的B细胞表位1 5;E v e r t设计了针对疟原虫孢子P h a C基因的B细胞、T 细胞表位融合蛋白1 6。张涛将细粒棘球绦虫E g G 1 Y 1 6 2蛋白的T细胞、B细胞表位串联至H S P 7 0蛋白,构建了多表位疫苗H S P 7 0-E g G 1 Y 1 6 21 7。本研究对分离的无乳链球菌X 1 6 0 8 7菌株的G a p C蛋白进行了表达与纯化,免疫小鼠评估了免疫效果,通过生物信息学方法对其潜在B细胞抗原表位进行预测筛选,并利用特异性抗体进一步对预测的抗原表位进行鉴定,将为G a p C功能性研究及表位疫苗的研发提供理论基础和实验依据。1 材料与方法1.1 材 料S.a g a l a c t i a e X 1 6 0 8 7菌株分离并保存于新疆农业大学动物医学学院微生物实验室;大肠杆菌DH 5、B L 2 1(D E 3)、原核表达载体p E T-2 8 a(+)由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室保存;体重1 72 0 g的健康雌性昆明白小鼠购于新疆医科大学实验动物中心。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;D L 2 0 0 0 D NA M a r k e r、限制性内切酶B a mH、X h o、T a q D NA聚合酶、T 4 D NA连接酶购自T a K a-R a公司;弗氏佐剂购于S i g m a公司;I P T G、HR P标记抗体等试剂购自中杉金桥生物技术有限公司;TMB显色液购自北京索莱宝科技有限公司。1.2 方 法1.2.1 G a p C基因扩增及重组表达质粒的构建根据无乳链球菌G a p C基因序列(G e n B a n k:AAM 7 3 7 7 0.1)设计引物扩增G a p C基因,并引入B a mH、X h o酶切位点,引物序列为F:5 -G C G-GAT C C AT G G T AG T T AAA-3,R:5 -GA C C T C-GAG T AG C GAT T T T T-3;由生工生物工程(上海)股份 有 限 公 司 合 成。以S.a g a l a c t i a e分 离 株X 1 6 0 8 7基因组为模板进行P C R扩增G a p C基因,P C R扩增条件为:9 5 预变性3 m i n;9 5 变性3 0 s;5 6 退火1 m i n;7 2 延伸1 m i n 3 0 s;3 2次循环;7 2 复性1 0 m i n,回收P C R扩增的目的基因与p E T-2 8 a载体分别经双酶切后用T 4 D NA连接酶连接并转化至大肠杆菌DH 5,挑取单菌落进行P C R验证,阳性菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。1.2.2 重组蛋白的诱导表达与纯化将已鉴定成功的重组菌参考王汉青1 4的方法纯化蛋白,S D S-P AG E检测蛋白的表达。纯化后的G a p C蛋白进行S D S-P AG E电泳半干转印法转移至N C膜,5%脱脂乳封闭2 h,P B S T洗涤3次,S.a g a l a c t i a e G a p C阳性 血清为一抗(13 0 0 0),3 7 孵育1 h,以HR P标记山羊抗鼠I g G(11 0 0 0 0)为二抗,用D A B显色。1.2.3 无乳链球菌G a p C蛋白B细胞表位预测根据S.a g a l a c t i a e X 1 6 0 8 7 G a p C蛋白序列信息,分 析 该 蛋 白 的 一 级 结 构 和 二 级 结 构,采 用B e p i P r e d与A B C p r e d两种方法预测与分析3个B细胞抗原表位P L 1、P L 2、P L 3,表位多肽由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2.4 小鼠免疫对小鼠分组,分别为:空白对照组、G a p C免疫组、灭活全菌组及P B S对照组,每组1 1只。取纯化后的重组蛋白,对57周龄的昆明白小鼠进行背部皮下免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂,与G a p C蛋872 第4期李胜男,等:无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C的B细胞抗原表位预测与鉴定白充分乳化;首次免疫后第1 4天,用弗氏不完全佐剂与G a p C进行加强免疫。采集小鼠免疫前(第0天)、首次免疫后第1 4天、第3 5天、第4 2天的血清,-2 0 保存。1.2.5 免疫小鼠抗体水平、滴度及亚型的检测收集首次免疫后第1 4天、第3 5天、第4 2天的小鼠血清,用间接E L I S A方法检测小鼠血清中抗体水平及抗体滴度1 8。用G a p C蛋白作包被抗原,3 7 封闭2 h,P B S T洗涤3次,加入S.a g a l a c t i a e多抗,3 7 孵育1 h,P B S T洗涤3次,加入15 0 0 0稀释HR P标记的山羊抗小鼠I g G 1 0 0 L/孔。抗体亚型检测方法依照Q i a n等的方法1 9,抗原包被,多抗孵育1 h,P B S洗涤后再分别加入HR P标记的山 羊 抗 鼠I g G 1、I g G 2 a、I g G 2 b(1 3 0 0 0)1 0 0 L/孔,3 7 孵 育4 5 m i n,P B S T洗 涤3次,TMB显色1 0 m i n,终止后测定O D4 5 0 n m值。1.2.6 小鼠攻击与脾脏菌体载量检测首次 免 疫 第4 2天,用S.a g a l a c t i a e X 1 6 0 8 7株,分别对空白对照组、G a p C免疫组、灭活全菌组及P B S对照组小鼠每只腹腔注射5 L D5 0剂量进行攻毒,观察并记录攻击后1 0 d内小鼠发病及死亡情况,参照M a2 0等的方法计算免疫保护率。无菌采集小鼠肝、脾、肺、肾等组织进行研磨后稀释涂板计数,计算各脏器荷菌量2 1。1.2.7 病理组织学观察对攻击后第1 0天G a p C免疫组、灭活全菌组及P B S对照组(每组3只)小鼠剖检,采集肝、肾等内脏器官,4%甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,H.E染色,显微镜下观察小鼠脏器病理组织学变化2 2。1.2.8 抗原表位鉴定以表位肽P L 1、P L 2、P L 3以及G a p C蛋白为包被抗原,P B S为空白对照,生理盐水为B S A(-),以兔抗G a p C多抗(13 0 0)为一抗,HR P标记羊抗兔I g G(16 0 0 0)为二抗,用E L I S A方法2 3对预测的G a p C B细胞表位进行鉴定。1.3 数据处理用G r a p h P a d P r i s m 8.3整 理 数 据,用O n e-w a y ANOVA统计分析。2 结果与分析2.1 G a p C基因扩增及重组质粒的构建与鉴定由图1知,P C R扩增产物目的基因片段约为1 0 0 0 b p,与预期大小一致。用B a mH、X h o对构建的重组质粒p E T-2 8 a-WR-G a p C进行双酶切,电泳结果见图2,显示目的基因大小与预期一致,测序表明构建成功。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM123M.D L 2 0 0 0 D NA M a r k e r;1,2.阴 性 对 照;3.P C R扩 增G a p C基因图1 G a p C基因的P C R扩增产物电泳F i g.1 P C R a m p l i f i c a t i o n o f G a p C g e n e5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp700bp500bp250bp100bpM1M.D L 5 0 0 0 D NA M a r k e r;1.p E T-2 8 a-WR-G a p C双 酶 切产物图2 重组质粒p E T-2 8 a-WR-G a p C的双酶切鉴定F i g.2 I d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T-2 8 a-WR-G a p C2.2 G a p C蛋白的表达与纯化对诱导表 达裂解后的 上清及沉淀 进行S D S-P AG E分析,4 4.0 k D a处可见G a p C重组蛋白条带(图3)大小与理论值一致。W e s t e r n b l o t t i n g结果显示,表达的G a p C重组蛋白可与阳性血清发生反应,在4 4.0 k D a位置可见单一条带(图4),说明表达的重组蛋白免疫原性良好。97.4kDa66.2kDa44.3kDa31.0kDa20.1kDa12M3456789M.蛋白M a r k e r;1.诱导前对照;2.G a p C蛋白诱导;3.上清;4.沉淀;5.穿透液;69.纯化的G a p C蛋白图3 G a p C蛋白的诱导及纯化结果F i g.3 I n d u c t i o n a n d p u r i f y i n g r e s u l t o f G a p C p r o t e i n972新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 70kDa50kDa35kDa25kDa20kDa10kDaM12M.蛋白M a r k e r;1.纯化的G a p C蛋白;2.阴性对照图4 G a p C蛋白的W e s t e r n b l o t t i n g结果F i g.4 W e s t e r n b l o t t i n g a n a l y s i s o f t h e p u r i f i e d G a p C p r o t e i n2.3 G a p C蛋白B细胞表位预测结果选择S.a g a l a c t i a e X 1 6 0 8 7株的G a p C序列进行表位预测分析。基于氨基酸的亲水性、柔韧性、可及性、极性、暴露表面、转角等特性,预测获得G a p C的3个B细 胞 表 位(图5),P L 1:4 6KY D T T Q-G R F D G T V E VK D G6 3;P L 2:1 2 1T A P G GN D V1 2 8;P L 3:1 8 6MV L D G P HR G G D L R R A R2 0 1。经综合预测并对B细胞表位进行空间位置的显示(图6),得到G a p C蛋白的B细胞表位。PL1PL3PL2图5 G a p C蛋白的3个B细胞抗原预测表位F i g.5 B c e l l e p i t o p e s o f G a p C p r o t e i n图6 G a p C蛋白抗原预测表位空间分布F i g.6 S p a t i a l l o c a t i o n o f t h e G a p C B c e l l e p i t o p e s2.4 免疫小鼠血清抗体水平与滴度检测间接E L I S A对免疫后小鼠抗体的检测表明,G a p C免疫组小鼠的特异性抗体水平高于灭活全菌组(P0.0 1),且抗体随免疫时间增加而升高(图7)。免疫后血清抗体效价可达12 1 8 7 0 0(图8)。1.51.00.50.0?GapC?baBbAaAaBb?0?14?35?42?OD450nm相同时间G a p C免疫组与灭活全菌组间不同小写字母表示差异显著(P0.0 5),不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)图7 免疫小鼠I g G抗体水平的检测F i g.7 D e t e c t i o n o f I g G a n t i b o d y l e v e l o f i mm u n i z e d m i c e1.51.00.50.0?GapC?OD450nm1 300?1 2700?1 24300?1 218700?PBS?图8 免疫小鼠抗体滴度的检测F i g.8 D e t e c t i o n o f a n t i b o d y t i t e r o f i mm u n i z e d m i c e2.5 免疫后小鼠的抗体亚型用E L I S A检测G a p C免疫小鼠产生的特异性抗体亚 型(图9),血 清 中 的 抗 体 亚 型 以I g G 1和I g G 2 b为主,G a p C免疫组的I g G 1、I g G 2 a、I g G 2 b型抗体水平高于灭活全菌组(P0.0 1)。0.80.60.40.20.0?GapC?BbAaBbAabalgG1lgG2algG2blgG3?OD450nmAaBbG a p C免疫组与灭活全菌组间不同小写字母表示差异显著(P0.0 5),不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)图9 免疫小鼠血清抗体亚型检测F i g.9 D e t e c t i o n o f a n t i b o d y s u b t y p e s i n i mm u n i z e d m i c e2.6 试验鼠存活率及其脏器菌体载量首次免疫第4 2天,用S.a g a l a c t i a e X 1 6 0 8 7菌株攻击G a p C免疫组和P B S对照组小鼠,G a p C免疫组和灭活全菌组攻击后存活率均为1 0 0%(表1)。082 第4期李胜男,等:无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C的B细胞抗原表位预测与鉴定表1 攻击存活率检测T a b l e 1 C h a l l e n g e s u r v i v a l r a t e d e t e c t i o n分 组死亡总数(只)存活率(%)P B S对照组1 10灭活全菌组01 0 0G a p C免疫组01 0 0由表2知,以S.a g a l a c t i a eX 1 6 0 8 7菌株攻击小鼠,G a p C免疫组与灭活全菌组肝、脾、肺、肾中的细菌定殖数均小于P B S对照组(P0.0 1),G a p C免疫组与灭活全菌组均能显著减少S.a g a l a c t i a在这些组织中的定植。2.7 病理组织观察P B S组小鼠死亡立即剖检,攻毒后第1 0天,G a p C免疫组、灭活全菌组随机取3只小鼠剖检,将肝脏和肾脏切片并进行H.E染色(图1 0),P B S对照组肝细胞空泡变性、坏死,炎性细胞浸润,并有多处出血;G a p C免疫组并未出现明显的病理损伤。P B S对照组肾小管肿胀,管腔间隙变小,肾间质有明显出血;G a p C免疫组仅肾间质有轻微出血;灭活全菌组部分肾小管上皮细胞肿胀变形。S.a g a l a c-t i a e X 1 6 0 8 7能引起小鼠肝、肾组织 严重病变,而G a p C蛋白与灭活全菌免疫均可减轻病理损伤。表2 攻击后小鼠脏器荷菌量T a b l e 2 T h e b a c t e r i a l b u r d e n o f o r g a n i n m i c e a f t e r c h a l l e n g eC F U/m g分 组肝脾肺肾P B S对照组2.6 31 07 A a3.2 81 08 A a2.7 01 07 A a1.1 31 07 A a灭活全菌组1.2 01 04 B b8.4 01 03 B b1.1 31 04 B b1.8 31 04 B bG a p C免疫组2.2 21 05 C c1.0 21 04 B c1.4 31 04 B c2.3 41 04 B c注:同列数据后不同小写字母表示差异显著(P0.0 5),不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)A50 mB50 mC50 mD50 mE50 mF50 mG50 mH50 mA.空白对照组肝组织;B.G a p C免疫组肝组织;C.灭活全菌组肝组织;D.P B S对照组肝组织;E.空白对照组肾组织;F.G a p C免疫组肾组织;G.灭活全菌组肾组织;H.P B S对照组肾组织图1 0 无乳链球菌X 1 6 0 8 7株攻击后小鼠肝、肾的病理组织学变化F i g.1 0 H i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l i v e r a n d k i d n e y i n m i c e a f t e r S.a g a l a c t i a e X 1 6 0 8 7 c h a l l e n g e2.8 表位的E L I S A鉴定结果利用兔抗G a p C多抗对预测的G a p C表位多肽进行E L I S A检测,结果表明(图1 1),与B S A(-)及P B S相比,P L 1、P L 2及P L 3均可特异性结合多抗(P0.0 1)。G a p C的P L 1多肽(4 6KY D T T QG R-F D G T V E VK D G6 3)、P L 2多 肽(1 2 1T A P G GN-D V1 2 8)、P L 3多 肽(1 8 6MV L D G P HR G G D L R-R A R2 0 1)具有良好的抗原性。3 讨 论无乳链球菌所引起的奶牛乳房炎可给奶牛养殖1.81.20.60.0BbBbAaCcCcPL1PL2PL3GapC?OD450nmBbPBS BSA(-)不同小写字母表示差异显著(P0.0 5),不同大写字母表示差异极显著(P0.0 1)图1 1 G a p C表位的抗体结合检测结果F i g.1 1 E L I S A t e s t r e s u l t s o f G a p C e p i t o p e182新 疆 农 业 大 学 学 报2 0 2 3年 业造成严重的危害和损失2 4,目前国内外对于乳房链球菌的免疫防控研究多集中在灭活疫苗上,但灭活疫苗有免疫原性差、副作用大的缺陷。无乳链球菌具有免疫保护性的抗原有S i p、F b s A和G a p C,且S i p作为链球菌膜表面蛋白对细菌的粘附与定植起至关 重 要 的 作 用2 5;链 球 菌 的 免 疫 逃 避 机 制 与F b s A相关2 6;G a p C能够促进链球菌的传播和迁移,从而引起宿主的炎性反应2 7。李国华2 8将链球菌G a p C基因与痘苗病毒基因进行重组获得了痘病毒载体疫苗,但并未检测保护效果。C o l l a d o等2 9从西班牙奶牛临床乳房炎病例中分离的乳房链球菌制成亚单位疫苗,可以减轻临床乳房炎的严重程度。杜琳3 0利用牛源无乳链球菌荚膜多糖-蛋白偶联亚单位疫苗免疫小鼠,可诱导小鼠产生较好的体液免疫和细胞免疫。吴金花3 1等利用表达的奶牛乳房炎无乳链球菌溶血素基因h l y免疫小鼠证明其具有良好的免疫原性。王雪吟3 2等构建了牛乳腺炎无乳链球菌菌毛A P 1-A P 2-B P蛋白制备的抗原免疫家兔,证明其有良好的免疫效果。引起奶牛乳房炎的3种链球菌都可产生G a p C蛋白3 3,该蛋白具有GA P DH活性和较强的免疫原性3 4,甘油醛-3-磷酸脱氢酶是细胞能量代谢途径中的关键酶3 5-3 8。GA P DH活性蛋白有两类:G a p B和G a p C蛋白。GA P DH蛋白位于菌体表面,是重要的毒力因子1 1,3 9,4 0,且能刺激B细胞和T细胞的增殖和分化1 3,增加I L-1 0的分泌表达4 0,是链球菌免疫的重要靶抗原。刘硕4 1等证实G a p C抗原特异性强且敏感性高,表明G a p C蛋白具有良好的免疫原性,有作为疫苗研究的潜在价值。M a d u r e i-r a4 2和张辉4 3等的研究表明,乳房链球菌G a p C蛋白对小鼠进行免疫,对乳房链球菌的保护率可达7 0%,而灭活全菌免疫的保护率仅为3 0%,而本研究中无乳链球菌G a p C免疫后的攻毒保护率可达1 0 0%,这可能是免疫剂量和感染菌株的不同引起的。本研究中G a p C免疫小鼠后产生的抗体主要以I g G 1和I g G 2 b为主,且G a p C免疫后抗体水平远高于灭活全菌免疫。乳房炎的致病菌众多且单一抗原亚单位无法满足该病预防的需要4 4,用来表达抗原蛋白的载体容量有限,抗原表位是免疫系统及细胞识别抗原的最小单位和关键分子4 5,4 6,线性B细胞表位多为69个氨基酸的短肽4 7,可有效诱导免疫应答。此外,表位抗原免疫不仅可预防多种病原感染,还能通过设计特殊抗原结构来消除不良的免疫反应,免疫效力长,且具有安全、高产的优点。随着对抗原表位研究的不断深入和完善,表位疫苗研究已成为疾病防治的热点,具有很好的发展前景4 8。利用生物信息学方法可实现对蛋白质抗原表位及高级结构的预测,有效减少表位筛选试验的盲目性4 9。孔 智 翔1 2等 预 测 了 奶 牛 乳 房 炎 链 球 菌G a p C的5个B细胞表位,其中1 2 11 2 8 a a与本研究预测的表位肽段相同,其余表位不完全相同。王汉青1 4等筛选了9个B细胞表位,但 仅有4 65 8 a a表位在3种链球菌中的同源性达到1 0 0%,其余表位的氨基酸序列在S.a g a l a c t i a e、S.d y s g a-l a c t i a e、S.u b e r i s中不完全相同,可能是由于3种链球菌的G a p C同源性达不到1 0 0%。张丽萌1 5等采用噬菌体阳性克隆的方法对B细胞抗原表位筛选获得了1 3 71 4 2 a a的表位序列,该表位序列在S.a g a l a c t i a e、S.d y s g a l a c t i a e、S.u b e r i s3种链球菌中的保守性非常高,推测可为这3种链球菌提供交叉免疫保护作用,但还未经验证。W a n g5 0同样采用噬 菌 体 阳 性 克 隆 的 方 法 获 得 了S.a u r e u s G a p C 2 3 62 4 3 a a的表位序列,将其制备成表位疫苗,发现该表位疫苗的保护率达3 0%,能诱导机体针对S.a u r e u s感染的体液免疫。Z h a n g5 1将S.d y s g a l a c t i a e表位3 0T R I N D L T3 6通过替换单个氨基酸的方式确定表位关键的氨基酸残基,使G a p C的抗原结构被揭示,但该研究仅对一个表位进行分析,不能使G a p C结构完全暴露。4 结 论本研究成功表达了4 4 k D a的无乳链球菌G a p C蛋白,纯化后经小鼠免疫评估了其免疫效果,表明G a p C蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,可诱导机体产生保护性免疫反应;利用生物信息学方法预测了G a p C的3个B细胞表位:4 66 3 a a、1 2 11 2 8 a a、1 8 62 0 1 a a,并利用特异性多抗检测了这些表位的抗原性,结果表明其有作为亚单位疫苗的潜力,可用于预防牛源无乳链球菌。参考文献:1 K e e f e G P.S t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e m a s t i t i s:a r e v i e wJ.C a n a d i a n V e t e r i n a r y J o u r n a l,1 9 9 7,3 8(7):4 2 9-4 3 7.2 白成军.奶牛隐性乳房炎的诊断及防治J.畜牧兽医科技信息,2 0 1 1,(7):5 2.3 Z a d o k s R N,M i d d l e t o n J R,M c d o u g a l l S,e t a l.M o l e c-u l a r e p i d e m i o l o g y o f m a s t i t i s p a t h o g e n s o f d a i r y c a t t l e 282 第4期李胜男,等:无乳链球菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶C的B细胞抗原表位预测与鉴定a n d c o m p a r a t i v e r e l e v a n c e t o h u m a n sJ.J o u r n a l o f M a mm a r y G l a n d B i o l o g y&N e o p l a s i a,2 0 1 1,1 6(4):3 5 7-3 7 2.4 杜琳,周雪,赵红梅,等.华北地区牛源无乳链球菌的分离鉴定及生物学特性J.微生物学通报,2 0 1 6,4 3(3):5 6 7-5 7 4.5 徐伟.乳房淋巴结部位注射白术多糖对奶牛隐性乳房炎的治疗作用及部分机理研究D.杭州:浙江大学,2 0 1 7.6 B r e y n e K,S t e e n b r u g g e J,D e m e y e r e K,e t a l.P r e