病毒核酸检测统一标准操作作业规程荧光法.doc

EB病毒（EBV）核酸检测原则操作规程（荧光PCR法）1.目规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，精确进行EB病毒DNA分析。2.应用范畴使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。3.职责由PCR实验室制定程序文献，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实行。4.内容 4.1 实验原理及其临床应用 本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反映液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA测定，为临床提供参照，4.2 标本采集4.2.1 使用标本类型：全血。4.2.2 标本采集；由合伙单位按照如下规定进行采集。4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂玻璃管，及时轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。4.2.3 标本保存和运送：标本可及时用于测试，也可以保存于-20待测，保存期为6个月。标本运送采用0冰壶。4.3 试剂准备4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应及时放回冰箱-20。4.3.3 如果试剂浮现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。4.4 质控品4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。4.4.2 质控品保存条件：置于-20冰箱中保存。4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。4.5 操作过程阐明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 质控品解决：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50ulDNA提取液充分混匀，100恒温解决101分钟；1 rpm离心5分钟，备用。4.5.1.2 样本解决4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液； 4.5.1.2.3 将稀释好全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；4.5.1.2.4 rpm离心20分钟（建议用水平离心机）； 4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，1rpm离心5分钟；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100恒温解决101分钟； 1rpm离心5分钟，上清备用。4.5.2.1 加样：取PCR反映管若干，加入解决后样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。4.5.3 PCR扩增 将准备好PCR反映管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反映：37-2min；94-2min；（94-15ses；55-45ses）40 cyclics； EBV检测荧光素：FAM； 反映体系：50ul； 荧光信号收集：55-45ses，末端收集。4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪设立及成果分析4.5.3.1 打开计算机电源。4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大概1分钟时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动声音。打开电脑上Mx3000P软件，拟定软件界面右下面联机标志呈现绿色。如果不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要继续稍等半晌，待仪器自检完毕，会自动连接计算机。4.5.3.3 在软件弹出框中选取您要进行实验类型，普通选取第一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。4.5.3.4 拟定卤钨灯已经打开。(绿色)则阐明卤钨灯已经打开；（黄色）则阐明卤钨灯正在预热；（红色）则阐明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开状况下，软件界面右下方会显示（绿色）。4.5.3.5 最佳在仪器与光源预热20分钟后开始实验。4.5.3.6 在里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard（原则 品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选取对的荧光通道（FAM，HEX，ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。对于原则品，在Well type中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。办法为：点击 ，10倍浓度梯度可以直接点击，在下拉菜单中选取不同系数关系后，依次点击设定为原则品此外几种孔，浓度将实时显示。也可以直接点击原则品各个孔位， 在一栏，手工输入浓度。若要对不同样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。或者点击版面右上方，导入此前使用96孔板设定。4.5.3.7 点击，进行PCR循环设定，可以直接点击温度、时间变化各项温度、时间、循环数等。在选定大环节之后添加环节可选定该大环节后，点击，或点击鼠标右键，在弹出对话框中，选取Add Segment，则可在该大环节之后添加一种大环节；若是在选定大环节里面小环节后边添加一小环节，选中该小环节，点击鼠标右键，在弹出对话框中选取“Add Plateau with Ramp”。要删除某个大环节，直接选定大环节，点击界面右边“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该环节。如果要删除一种大环节里小环节，可先选定此环节时间和温度中间横线，将其变红，如图，点击界面右边“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该环节。点击，导入此前设定PCR程序。（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步全过程都采集荧光信号，普通用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号地方。若要去除，可将其拖出循环设定区域。4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方。会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“立即运营”或者是“灯预热完毕后再运营”？普通可直接点击“立即运营”，但最佳点击“灯预热完毕后再运营”，可以保护灯源。软件界面右下方会浮现运营状态显示框Run Status，点击Start开始实验。在运营过程中可以通过点击Add Cycles来增长扩增循环数。还可以选取勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运营结束之后软件将自动关闭卤钨灯。4.5.3.9 在PCR运营过程中可以点击，观测样品实时扩增原始成果。4.5.3.10 PCR运营结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行成果分析，也可点击手动进行成果分析。可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。点击可显示原则曲线，看斜率、截距、线性有关与否在可控范畴内。左下角可选取相应荧光观测扩增曲线。右边可依照自己需要选取显示界面。是扩增曲线，Ct值列表，原则曲线，样本起始浓度，成果excel表格输出，合并面板，涉及设立、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。4.5.3.11 分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中Smoothing对曲线进行调节，普通Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调节后曲线将更光滑，但是Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，普通状况下，不建议这样做。4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独基线设立，点击中Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面相应各孔，单独进行基线起始和终结位置调节。 4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验原则曲线补充阐明。点击桌面Mx3000P软件图标，弹出话框：选取Multiple Experiment Analysis （多项实验成果分析）选项，点击“OK”，浮现如下对话框，建议选取“Use common threshold”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析上机文献，点击“Finish”即可。4.5.3.14 这里选取时要注意：1.两个或者各种实验成果要有相似实验程序 ；2.每次程序中循环数应当一致。在分析栏可以选取不同实验不同反映孔进行同步分析。4.5.3.15 分析质控成果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。阳性质控品：EBV（FAM）Ct值33，且有较好对数增长曲线。以上规定需在同一次实验中同步满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.3.16 记录实验数据。4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪设立及成果分析4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。4.5.4.3 在弹出对话框中，输入顾客名和密码，进入软件设立界面。4.5.4.4 在弹出界面中，点击“”，进入新实验设立界面：。 4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。 4.5.4.6 将“Detection Format”选取为Daul或3 color探针杂交类型。4.5.4.7 将“Reaction Volume”设立为“50ul”。4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增长总循环阶段及阶段循环数，并在“变性延伸退火”循环阶段“Analysis Mode”下选取Quantification。4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增长每个循环阶段里小环节，并在采集荧光小环节“Acquisition Mode”里选取“single”，采集荧光。4.5.4.10 在“”菜单栏下，通过“”增长或者减少实验项目类型，通过右边孔位选取，设立不同项目区域，然后点击“Apply”保存。4.5.4.11 在“”菜单栏下，Step 1处，选取“Abs Quant”；Step 2处，编辑原则品及样本。 4.5.4.12 原则品设立：在Step 2下96孔面板中，选中原则品反映孔，然后选取右侧模 板检测通道，如“483-533”，然后将下方孔位“Quantification Sample Type”选取为“Standard”，并在“Concentration”处输入其浓度即可。4.5.4.13 样本设立：类似于原则品设立，但仅需要编辑其“Sample Name”即可。4.5.4.14 返回“”菜单，在“”子菜单右下角点击“”，运营实验。4.5.4.15 实验结束后，在“”菜单下，选取“Abs Quant/Fit Points”，进入成果分析界面： 【Analysis】：在此菜单下对阈值线进行调节；【Noise Band】：对实验信噪比进行调节；【Filter Comb】：对不同荧光通道进行选取；【Std Curve】：对定量参照品进行选取，涉及实验中参照品、导入原则品等；4.5.4.16 在上述操作完毕后，点击“”；在“”菜单中，依照需要选取报告中需包括项目，然后得出成果。4.5.4.17 分析质控成果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。阳性质控品：EBV（FAM）Ct值33。以上规定需在同一次实验中同步满足，否则本次实验无效，需重新检测。4.5.4.18 记录实验数据。4.5.4.20 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。4.5.4.21 关闭扩增仪电源和计算机电源。4.6 成果鉴定EBV阳性：（EBV-FAM）Ct36，且有较好对数增长曲线。EBV阴性：（EBV -FAM）Ct值=40或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。EBv检测灰度区：（EBV -FAM）36Ct样本40，因实验存在系统及人为不拟定性因素，应重复检查确认。4.7 参照值：阴性。4.8 注意事项4.8.1 PCR荧光定量检测法比较容易受污染，因此实验过程中应尽量避免重复开盖，所用耗材均需高压灭菌。4.8.2 试剂使用前要完全解冻，但应避免重复冻融。4.8.3 实验完毕应用有效氯终浓度为mg/L消毒液擦拭桌面，并打开紫外线灯消毒。本作业指引书颁发部门：质管部本作业指引书分发部门：PCR室本作业指引书编写人： 编写日期： 年 月 日本作业指引书审核人： 审核日期： 年 月 日本作业指引书审批人： 执行日期： 年 月 日