细菌内毒素检查法操作作业规程.doc

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标 准 操 作 规 程
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细菌内毒素检验法
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SOP/QC-043(1)-
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部门：QC
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QA
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分发部门
总经理、质量部、QC

目标
建立细菌内毒素检验操作规程，确保检测结果正确性。
适用范围
全部原料、成品细菌内毒素检验。
责任人
QC检验员
内容
1 简述
1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生细菌内毒素，以判定供试品中细菌毒素限量是否符合要求一个方法。
1.2 细菌内毒素检验包含凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一个方法。当测定结果有争议时，除另有要求外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适适用于凝胶法检验。凝胶法系经过鲎试剂和内毒素产生凝集反应原理来检测或半定量内毒素方法。
1.4 细菌内毒素量用内毒素单位(EU)表示
1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及多种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检验用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用细菌内毒素检验用水，其内毒素含量应小于0.005Eu/ml。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验 在本检验法要求条件下，使鲎试剂产生凝集内毒素
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最低浓度即为鲎试剂标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检验方法和供试品配方和生产工艺或试验环境有改变，鲎试剂起源不一样或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检验法项为供试品细菌内毒素检验方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必需同时进行，不然试验结果无效。
2 试验材料及用具
2.1 天平 供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱 除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上最少一小时。
2.3 恒温水浴箱或适宜恒温器，应能在37土1℃保持一小时。
2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。
2.5 旋涡混合器
2.6 鲎试剂(应含有国家主管部门同意文号)及细菌内毒素检验用水(符合要求)。
2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有要求外应由中国药品生物制品检定所统一发放。
2.8 试验用具 移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(10× 75mm)、三角瓶、小试管(16×100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤最少1小时。塑料用具应使用其它适宜除细菌内毒素方法。
2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。
3 操作方法
3.1 试验准备
3.1.1 洗液配制 配制铬酸洗液或其它适宜细菌内毒素灭活剂。
3.1.2 玻璃器皿洗涤 将被洗涤玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜密闭金属容器中，快速置烤箱中。
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3.1.3 除去玻璃器皿表面可能存在外源性内毒素 玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定温度后开始记时，须干烤最少1小时。达成要求时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器情况下，可在两周内使用，不然须再次加热除去可能存在外源性内毒素。
3.2 内毒素限值确实定
药品、生物制品细菌内毒素限值(L) 通常按以下公式确定
L=K/M
式中 L为供试品细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、或EU/U(活性单位)表示；
K为人每千克体重每小时最大可接收内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂，K=5EU/(kg·h)，其中放射性药品注射剂K＝2.5EU/(kg·h)，鞘内用药品，K=0.2EU/(kg·h)；
M为人用每千克体重每小时最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若小于l小时，按l小时计。
按人用计量计算限值时，如遇特殊情况，可依据生产和临床用药实际情况做必需调整，但需说明理由。
3.3 确定最大有效稀释倍数(MVD)
最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被许可稀释最大倍数，在不超出此稀释倍数浓度下进行内毒素程度检测。用以下公式来确定MVD：
MVD=CL/λ
L为供试品细菌内毒素限值；
C表示供试品浓度，或供试品复溶后所得溶液浓度。当L以EU/ml表示时C为1.Oml/m1，当L以EU/mg或EU/u表示时，C单位需为mg/ml或u/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品最小有效稀释浓度C=λ/L；
λ为在凝胶法中鲎试剂标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用标准曲线上最低内毒素浓度。
3.4 鲎试剂灵敏度复核
3.4.1 内毒素标准溶液制备
3.4.1.1 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落人瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻
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划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，预防玻璃屑落入瓶内。
3.4.1.2 按标准品使用说明书用移液管加入要求量BET水溶解其内容物，用封口
膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ(λ为所复核鲎试剂标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒(具体过程请参见使用说明书)。若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至要求浓度后分装并保留。
比如使用NSE(内毒素含量为9000EU／支)时方法以下：
复溶：正确吸收BET水1ml加入NSE安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为9000EU/ml内毒素标准溶液。
稀释：取0.3ml内毒素标准溶液加上2.7mlBET水即为1→10稀释液，得到900EU/ml内毒素标准溶液。
取0.3mll→10稀释液，加上2.7mlBET水即为1→100稀释液，得到90EU/ml内毒素标准溶液。
往后依次类推。也可写成下列格式：
0.3ml 0.3ml 0.3ml 0.3ml 1ml 1ml
9000EU/ml→900EU/ml→90EU/ml→9EU/ml→lEU/ml→0.5EU/ml→
2.7ml 2.7ml 2.7ml 2.4ml lml lml
lml lml lml
0.25EU/ml→0.125EU/ml→0.0625EU/ml→0.03125EU/ml
lml lml lml
在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。
3.4.2 待复核鲎试剂准备
3.4.2.1 在制备内毒素标准溶液同时，取0.1ml/支鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，预防玻璃屑落人瓶内，加入0.1mlBET水复溶，使内容物充足溶解，避免产生气泡。
3.4.2.2 若待复核鲎试剂规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后鲎试剂溶液混匀后每0.1m1分配到10mm× 75mm凝聚管中，要求最少分配18管
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备用(或取0.1ml/支鲎试剂溶液10mm×75mm试管或复溶后0.1ml/支鲎试剂原安瓿)。
3.4.3 加样
将已充足溶解待复核：鲎试剂18支(管)．放在试管架上，排成5列，其中4支(管)4列分别加入2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ内毒素标准溶液；2支(管)l列分别加入BET水作为阴性对照。内毒素标准溶液和BET水加样量均为0.lml/支。
3.4.4 加样结束后、用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放人37士l℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟，观察结果。
3.4.5 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，而且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶不坚实、变形、并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阳性结果。
3.4.6 鲎试剂灵敏度复核试验结果计算
当最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度几何平均值，即为鲎试剂灵敏度复核结果(λC)。
λC=lg-1()
式中X为反应终点浓度对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减内毒素溶液中最终一个呈阳性结果浓度。
当λC在0.5λ～2λ(包含0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检验，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂灵敏度。
3.5 干扰试验
3.5.1 按表1制备溶液A、B、C和D，使用供试品应为未检验出内毒素且不超出最大有效稀释倍数(MVD)溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3.5.2 只有当溶液A和阴性对照溶液D全部平行管全部为阴性，而且系列溶液C结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B反应终点浓度几何平均值(E0和E1)

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式中 X0、X1分别为系列溶液C和溶液B反应终点浓度对数值(lg)。
当E0在0.5λ～2λ(包含0.5λ和2λ)及E1在0.5 E0～2 E0(包含0.5 E0和2 E0)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超出MVD深入稀释，再反复干扰试验。
3.5.3 表1 凝胶法干扰试验溶液制备
编号
内毒素浓度/配制内毒素溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素浓度
平行管数
A
无/供试品溶液
-
-
-
2
B
2λ/供试品溶液
供试品溶液
1
2
4
8
2λ
1λ
0.5λ
0.25λ
4
4
4
4
C
2λ/检验用水
检验用水
1
2
4
8
2λ
1λ
0.5λ
0.25λ
4
4
4
4
D
无/检验用水
-
-
-
2
注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度对照系列；D为阴性对照。
3.5.4 可经过对供试品进行更大倍数稀释或经过其它适宜方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理供试品溶液进行干扰试验。
3.6 供试品细菌内毒素检验法。
3.6.1 凝胶限量试验
3.6.1.1表2凝胶限量试验溶液制备
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内毒素浓度/配制内毒素溶液
平行管数
A
无/供试品溶液
2
B
2λ/供试品溶液
2
C
2λ/检验用水
2
D
无/检验用水
2
注：A 为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
一些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。通常要求供
试品溶液pH值在6.0～8.0范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力供试品，需调整被测溶液(或稀释液)pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐适宜缓冲液调整pH值。酸、碱溶液须用细菌内毒素检验用水在已去除内毒素窗口容器中配制。缓冲液必需经过验证不含内毒素和干扰因子。
3.6.1.2 检验方法
按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD而且已经排除干扰供试品溶液来制备A和B，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
取0.1ml/支鲎试剂溶液10mm×75mm试管或复溶后0.1ml/支鲎试剂原安瓿8支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数(MVD)供试品溶液（表2中A）；
2支加入0.1ml用细菌内毒素检验用水将内毒素工作标准品制成2λ浓度内毒素溶液作为阳性对照管（表2中C）；2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液[用供试品溶液将同一支(瓶) 内毒素工作标准品制成2λ浓度内毒素溶液]作为供试品阳性对照阳性对照管（表2中B），2支加入0.1ml细菌内毒素检验用水作为阴性对照管（表2中D）
3.6.1.3 结果判定
保温60±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D平行管均为阴性(-)，供试品阳性对照溶液B平行管均为阳性(+)，阳性对照溶液C平行管均为阳性(+)，试验有效。
若溶液A两个平行管均为阴性(-)，判供试品符合要求；若溶液A两个平行管均为阳性，判供试品不符合要求。若溶液A两个平行管中一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若全部平行管均为阴性，判供试品符合要求；不然判供试品不符合要求。
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3.6.2 凝胶半定量试验
本方法系经过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素含量。按表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3.6.2.1 结果判定
若阴性对照溶液D平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B平行管均为阳性，系列溶液C反应终点浓度几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。
系列溶液A中每一系列平行管终点稀释倍数乘以λ,为每个系列终点反应浓度
全部平行管反应终点浓度几何平均值即为供试品溶液内毒素浓度[按公式CE=lg-1(∑X/2)]。假如检验时采取供试品稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如试验中供试品溶液全部平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ(假如检验是稀释过供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验初始稀释倍数)。假如供试品溶液全部平行管均为阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于要求限值，判供试品符合要求。若内毒素浓度大于或等于要求限值，判供试品不符合要求。
3.6.2.2 表3凝胶半定量试验溶液制备
编号
内毒素浓度/配制内毒素溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素浓度
平行管数
A
无/供试品溶液
检验用水
1
2
4
8
-
-
-
-
2
2
2
2
B
2λ/供试品溶液

1
2λ
2
C
2λ/检验用水
检验用水
1
2
4
8
2λ
1λ
0.5λ
0.25λ
2
2
2
2
D
无/检验用水
-
-
-
2

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注：A为不超出MVD而且经过干扰试验供试品溶液。从经过干扰试验稀释倍数开始用检验用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最终稀释倍数不得超出MVD。
B为2λ浓度标准内毒素溶液(供试品阳性对照)。
C为鲎试剂标示灵敏度对照系列。
D为阴性对照。
4 汪意事项
4.1 试验前，须用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒
4.2 试验时，须戴工作帽和口罩。尤其在配制洗液和洗涤玻璃器皿时一定要戴手套、工作帽和口罩。
4.3 试验应在洁净室或洁净工作台内进行。
4.4 用移液管或刻度吸管等吸收样品时，须使用洗耳球，勿用嘴吸、吹，预防唾液溅入。也可使用加样器等其它方法。
4.5 注意所用鲎试剂批号、使用期、规格、灵敏度等。
4.6 进行干扰试验时，标准对照和供试晶阳性对照(含供试品内毒素溶液)应同时进行。
4.7 在进行灵敏度复核、干扰试验和供试品内毒素检验时，各个试验所要求对照应同时进行，并在有效条件下才能进行计算和判定。
注：
编制依据参考《中国药典》四部P154～157页【细菌内毒素检验法】

细菌内毒素检验统计
编号：
一、供试品
品 名：
规 格：
批 号：
进厂编号：
来 源：
本批数量：
送样日期：
检验日期：
检验依据：《中国药典》
取 样 点：
供试品溶液制备：
二、鲎试剂
批 号：
标示灵敏度： EU/ml
供样单位：
装 量： ml/支(瓶)
生产单位：
失效日期： 年 月 日
灵敏度复核日期：
复核结果： EU/ml
三、标准品
NSE批号：
效价： EU 起源：
WSE批号：
效价： EU 起源：
BET水批号：
规格： ml/支 起源：
内毒素标准品复溶时体积为 ml；
稀释方法为：
四、供试品阳性对照溶液制备
供试品内毒素程度 EU/ml 供试品检测浓度 EU/ml
五、反应结果
起止时间
～
水浴温度
℃
供试品
阴性对照
2.0λ
供试品阳性对照
管1
管2
管1
管2
管1
管2
管1
管2

结果是否有效

结 果

结果判定

检 验 人 复 核 人

REC/QC-063（1）-