基于虚拟筛选技术对氟康唑细胞毒性的机制评价.pdf

论著基于虚拟筛选技术对氟康唑细胞毒性的机制评价李松哲 孙悦 蔡凌云 孙阳(黑龙江中医药大学基础医学院,哈尔滨 1 5 0 0 4 0)【摘要】目的 探讨氟康唑对细胞是否具有毒性,能否用于防治细胞污染。方法 虚拟筛选与分子对接技术筛选潜在的毒性靶点。使用人肝癌S MMC-7 7 2 1细胞、人胚肝HHL-5细胞与人胚肾HE K-2 9 3细胞进行体外实验。C C K 8实验验证氟康唑对细胞活性的影响。H o e c h s t 3 3 3 4 2/P I双染实验进行形态学观察。q R T-P C R实验进一步验证氟康唑对虚拟筛选所获的靶点是否有影响,明确对细胞影响的机制。结果 虚拟筛选前6个核心毒性靶点是I L-6、T P 5 3、T N F、I L-1、V E G F A以及E G F R。C C K 8实验与H o e c h s t 3 3 3 4 2/P I双染实验显示氟康唑对S MMC-7 7 2 1细胞和HHL-5细胞具有抑制作用,对HE K-2 9 3细胞具有促增殖作用。q R T-P C R实验表明氟康唑导致细胞毒性的核心靶点是I L-6、I L-1和E G F R。结论 氟康唑不适合广泛应用于预防细胞污染。【关键词】氟康唑;虚拟筛选;分子对接;细胞污染【中图分类号】R 9 7 8.5 【文献标志码】A 【文章编号】1 6 7 3-3 8 2 7(2 0 2 3)1 8-0 3 9 1-0 6M e c h a n i s m e v a l u a t i o n o f f l u c o n a z o l e c y t o t o x i c i t y b a s e d o n v i r t u a l s c r e e n i n g t e c h n o l o g yL I S o n g z h e,S UN Y u e,C A I L i n g y u n,S UN Y a n g(C o l l e g e o f B a s i c M e d i c i n e,H e i l o n g j i a n g U n i v e r s i t y o f C h i n e s e M e d i c i n e,H a r b i n 1 5 0 0 4 0,C h i n a)【A b s t r a c t】O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e w h e t h e r f l u c o n a z o l e i s t o x i c t o c e l l s a n d w h e t h e r i t c a n b e u s e d t o p r e v e n t a n d c o n t r o l c e l l c o n t a m i n a t i o n.M e t h o d s V i r t u a l s c r e e n i n g a n d m o l e c u l a r d o c k i n g t e c h n o l o g y w e r e u s e d t o s c r e e n p o t e n t i a l t o x i c t a r g e t s.I n v i t r o e x p e r i m e n t s u s i n g h u m a n h e p a t o m a S MMC-7 7 2 1 c e l l s,h u m a n e m b r y o n i c l i v e r HHL-5 c e l l s a n d h u m a n e m b r y o n i c k i d n e y HE K-2 9 3 c e l l s w e r e p e r f o r m e d.T h e e f f e c t o f f l u c o n a z o l e o n c e l l v i a b i l i t y w a s v e r i f i e d b y C C K 8 a s s a y.H o e c h s t 3 3 3 4 2/P I d o u b l e s t a i n i n g e x p e r i m e n t w a s u s e d f o r m o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n.q R T-P C R e x p e r i m e n t s f u r t h e r v e r i f i e d w h e t h-e r f l u c o n a z o l e h a d a n e f f e c t o n t h e t a r g e t s o b t a i n e d b y v i r t u a l s c r e e n i n g,a n d c l a r i f i e d t h e m e c h a n i s m o f t h e e f f e c t o n c e l l s.R e s u l t s T h e f i r s t s i x c o r e t o x i c i t y t a r g e t s o f v i r t u a l s c r e e n i n g w e r e I L-6,T P 5 3,T N F,I L-1,V E G F A a n d E G F R.C C K 8 a s s a y a n d H o e c h s t 3 3 3 4 2/P I d o u b l e s t a i n i n g a s s a y s h o w e d t h a t f l u c o n a z o l e h a d i n h i b i t o r y e f f e c t s o n S MMC-7 7 2 1 c e l l s a n d HHL-5 c e l l s,a n d h a d a p r o l i f e r a t i v e e f f e c t o n HE K-2 9 3 c e l l s.q R T-P C R e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e c o r e t a r g e t s o f f l u c o n-a z o l e-i n d u c e d c y t o t o x i c i t y w e r e I L-6,I L-1 a n d E G F R.C o n c l u s i o n s F l u c o n a z o l e i s n o t s u i t a b l e f o r w i d e s p r e a d u s e i n t h e p r e v e n t i o n o f c e l l u l a r c o n t a m i n a t i o n.【K e y w o r d s】f l u c o n a z o l e;v i r t u a l s c r e e n i n g;m o l e c u l a r d o c k i n g;c e l l c o n t a m i n a t i o nC h i n J M y c o l,2 0 2 3,1 8(5):3 9 1-3 9 6 氟康唑作为一种广谱抗真菌药物1,在体外对各种真菌酵母菌有效2。基于这一特性,氟康唑被认为可以作为防治细胞污染的手段 3,并有观点指基金项目:国家自然科学基金青年基金(8 1 7 0 4 0 5 4);黑龙江省博士后科研启动金(L B H-Q 1 9 1 8 4)作者简介:李松哲,男(汉族),博士研究生在读.E-m a i l:s o n g z h e 9 9s i n a.c n通信作者:孙阳,E-m a i l:y a n g s u n 6 6s i n a.c o m出在5%1 0%用量时不 会对细胞造 成明显损害3-5。细胞培养过程中的污染现象虽然偶发,但由于感染来源及菌种众多,一旦出现便较为棘手,影响实验进展,尤其对于贵重细胞常采取保守的补救措施。但是,随着研究的进一步深入,有相关文献认为氟康唑可能对细胞具有遗传毒性/致突变的作用6,不仅如此,根据美国食品药品监督管理局(F D A)的用药指导,氟康唑具有肝毒性风险,且对193 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 0月 第1 8卷 第5期 C h i n J M y c o l,O c t o b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.5 于肾功能不全的患者,应当减少氟康唑的使用剂量。这意味着氟康唑可能会导致细胞损伤而影响实验的客观性,本文将通过虚拟筛选技术,使用3种细胞株验证氟康唑对细胞活性的影响。1 材料与方法1.1 细胞与试剂人肝 癌S MMC-7 7 2 1细 胞 购 自F u H e n g(上海)。人胚肝HHL-5细胞和人胚肾HE K-2 9 3细胞购 自O t w o B i o t e c h(深 圳)。DMEM高 糖 和1 6 4 0培养液购自B O S T E R。氟康唑氯化钠注射液购自四川科伦药业股份有限公司。细胞增殖及毒性检测试剂盒和H o e c h s t 3 3 3 4 2染色液购自M e i-l u n B i o。碘化丙啶(P I)购自S i g m a。R NA e a s yTM A n i m a l R NA I s o l a t i o n K i t w i t h S p i n C o l u m n和B e y o R TTM I I I F i r s t S t r a n d c D NA S y n t h e s i s M a s-t e r M i x(5 X)购自B e y o t i m e。C h a mQ U n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x购自V a z y m e。引物合成购自C o m a t e B i o s c i e n c e C o.,L t d,引物序列见表1。表1 q R T-P C R引物序列T a b.1 q R T-P C R p r i m e r s e q u e n c e s基因序列G A P DHF:5-T G G T A T C G T G GAA G GA C T C A-3R:5-C C A G T A GAG G C A G G G GA T GA T-3I L-6F:5-A G T GA G GAA C AA G C C A GA G C-3R:5-A G C T G C G C A GAA T GA GA T GA-3T P 5 3F:5-T T C C T GAAAA C AA C G T T C T G T C-3R:5-AA C C A T T G T T C AA T A T C G T C C G-3TNFF:5-A G C C C T G G T A T GA G C C C A T C T A T C-3R:5-T C C C AAA G T A GA C C T G C C C A GA C-3I L-1F:5-G C C A G T GAAAT GA T G G C T T A T T-3R:5-A G GA G C A C T T C AT C T G T T T A G G-3V E G F AF:5-T G C A GA T T AT G C G GA T C AAA C C-3R:5-T G C A T T C C A T T T G T T G T G C T G TA G-3E G F RF:5-G GA GAA C T G C C A GAAA C T GA C C-3R:5-G C C T G C A G C A C A C T G G T T G-31.2 虚拟筛选实验潜在靶点的收集 根据F D A对氟康唑的用药原则,推测可能损伤的靶点范围,以“h e p a t o t o x i c i t y”“n e p h r o t o x i c i t y”和“c y t o t o x i c i t y”分别作为关键词,挖掘G e n e C a r d s数据库(h t t p s:/w w w.g e n e c a r d s.o r g)(2 0 2 2年1月下载)涉及毒性损伤的潜在靶点,所搜集的靶点仅保留相关性得分 3 0的信息。构建与分析“毒性靶点”P P I网络 为进一步明晰核心毒性靶点,将3次检索所得的潜在靶点取交 集,通 过V e n n(h t t p:/b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/p e o p l e)完成h e p a t o t o x i c i t y、n e p h r o t o x-i c i t y和c y t o t o x i c i t y的交集处理,并绘制韦恩图。再将交集靶点提交至S T R I NG数据库7(h t t p s:/s t r i n g-d b.o r g)构建蛋白互作(P P I)网络模型,“O r-g a n i s m”设定为“H o m o s a p i e n s”,置信度设为0.4,得到P P I网络。再将此网络导入C y t o S c a p e 3.7 0中分析,根据各个节点的“C o m b i n e d d e g r e e”值大小,通过对可视化参数的调整筛选核心潜在蛋白质。氟康唑与核心靶点蛋白的搜集 通过Z i n c 1 5数据库8检索氟康唑分子结构,下载m o l 2文件。根据P P I网络明确潜在的核心靶点,通过R C S B P D B数据库(h t t p:/www.r c s b.o r g/)下载这些靶基因对应的蛋白晶体结构。分子对接软件及前期准备 分子对接软件采用a u t o d o c k T o o l s 1.5.6中的v i n a模块9,其中根据v i n a报道,经v i n a处理的分子-靶点对接结果中,均 方 根 偏 差(r o o t m e a n s q u a r e d e v i a t i o n,RM S D)2的比例高达7 8%,RM S D2被认为对接方案可行,故通过v i n a的分子对接预测可以被认为 可 行 性、准 确 性 较 高。根 据 之 前 的 对 接 办法1 0,将氟康唑小分子和靶点蛋白通过去除水分子,加氢进行预处理,采用半柔性及盲性对接法实行预测,其余参数均采用默认值,得到预测结果,因本次实验最终采取q R T-P C R实验验证,故忽略其生成氢键等可行性前提,结果仅取最小结合能作为参考,且可视化对接结果。1.3 细胞培养人肝癌S MMC-7 7 2 1细胞和人胚肾HE K-2 9 3细胞 使 用 含1 0%胎 牛 血 清 与1%青/链 霉 素 的DMEM培养液培养,人胚肝HHL-5细胞使用含1 0%胎牛血清与1%青/链霉素的1 6 4 0培养液培养。3种细胞使用2 5 c m2培养瓶常规培养,待细胞密度长至8 0%9 0%时进行传代处理,将细胞制成细胞悬液分瓶传代,传代后放入恒定3 7、5%的C O2培养箱中继续培养。实验取对数生长期细胞。1.4 细胞毒性实验分别将3种细胞等量铺于9 6孔板上,每孔体293 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 0月 第1 8卷 第5期 C h i n J M y c o l,O c t o b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.5 积1 0 0 L,然后放入细胞培养箱内孵育贴壁1 2 h。贴壁后对细胞进行加药处理,设置空白组、对照组与给药组,给药组加5%与1 0%的氟康唑,每组设置3个复孔。之后继续培养2 4 h,待完成后按每孔1 0 L加入C C K-8试剂,暗孵育11.5 h,置于酶标仪检测吸光度,酶标仪参数为3 7 环境,4 5 0 n m波长检测,得到数据统计O D值,依据公式计算细胞抑制率。抑制率=(对照孔吸光度-给药孔吸光 度)/(对 照 孔 吸 光 度-空 白 孔 吸 光 度)1 0 0%。1.5 H o e c h s t 3 3 3 4 2/P I双染实验配置H o e c h s t 3 3 3 4 2母液为1 m g/m L,P I母液为2 m g/m L。分别制备3种细胞的细胞悬液,每孔细胞配悬液加至1 m L,放入培养箱培育过夜。次日更换培养液并加入5%与1 0%的氟康唑持续2 4 h,待完成后弃上清,使用P B S清洗3次,最后每孔加入1 m L的P B S、5 L的H o e c h s t 3 3 3 4 2和2.5 L的P I,放入培养箱继续孵育2 0 m i n,于荧光显微镜下观察,1 h内完成观察拍照。1.6 总R NA提取和q R T-P C R检测设置对照组与给药组,给药组加1 0%氟康唑。作用2 4 h后,用离心柱提取对照组和给药组的总R NA。使 用B e y o R TTM F i r s t S t r a n d c D NA S y n t h e s i s M a s t e r M i x(5 X)按照说明将 R NA 逆转 录 为c D NA。采 用C h a mQ U n i v e r s a l S Y B R q P C R M a s t e r M i x配置扩增反应体系,P C R扩增4 0个循环,9 5 预变性3 0 s,9 5 持续1 5 s,5 6 处理1 5 s并在7 2 下延伸2 5 s。以G A P DH为内参基因检测目标基因相对表达量。每个样品重复3次,基因的相对表达水平根据2-c t计算。1.7 统计学分析所有统计分析均使用S P S S 2 6.0软件进行,通过独立样本t检验分析组间差异,以P0.0 5为差异具有统计学意义,P0.0 5),对HHL-5细胞具有显著的统计学意义(P0.0 1)。当药物浓度在1 0%时,对3种细胞的抑制/增殖皆有极显著的统计学意义(P0.0 1)。2.3 H o e c h s t 3 3 3 4 2/P I双染实验结果荧光染色结果见图4。镜下观察氟康唑在不同浓度下作用细胞2 4 h后的形态学变化,其中凋亡细胞呈强蓝光,晚期凋亡细胞及坏死细胞呈强红色和强蓝色荧光。由图可见,S MMC-7 7 2 1细胞与HHL-5细胞在氟康唑作用下不同程度的表现出凋亡/坏死细胞增加,其中,细胞密度随浓度的增加呈递减趋势,而5%浓度下的凋亡细胞高于1 0%浓度,可能是由于高浓度下能更快诱导细胞凋亡进而被吞噬导致的。而HE K-2 9 3细胞的凋亡/坏死细胞略有增多,但总体无明显改变。2.4 q R T-P C R检测细胞基因mR NA表达在1 0%药物浓度下对3种细胞进行了q R T-P C R检测,绘制火山图,见图3 DF。其中灰色代表表达不显著。绿色代表l o g 2 f o l d c h a n g e差异显著,l o g 2 f o l d c h a n g e为对照组与给药组mR NA相对表达量的差异比较,负值为药物起到抑制表达作用,正值为起到促进表达作用。蓝色代表P值显著。红色代表l o g 2 f o l d c h a n g e和P值皆显著。由图可知,通过对潜在核心毒性靶点的q R T-P C R验证,发现1 0%的氟康唑会导致细胞出现不同程度的mR NA表达改变,这种基因水平上的干预可能对 癌 细 胞 更 为 敏 感。在 靶 点 干 预 上,尤 其 对I L-1、I L-6和E G F R有更明显的调控作用。3 讨 论虚拟筛选技术是提高药物命中靶点概率的常用方法,能够降低实验成本,更快的筛选药物作用目标1 2。目前,有证据认为1 0%的氟康唑能够用来防治细胞污染,且不会对细胞造成损害,但该结论缺乏分子层面的实验检测。根据F D A的报道,氟康唑具有肝毒性1 3,药代动力学也受肾功能不全的显著影响1 4-1 5,所以,无差别地用来防治细胞污染可能会影响实验的客观性。本次实验利用虚拟筛选办法,分别对3种细胞使用了5%和1 0%浓度的氟康唑,结果发现氟康唑在5%的浓度下就已经对人胚肝HHL-5细胞产生了明显的抑制作用(P0.0 1),在1 0%浓度下对人肝癌S MMC-7 7 2 1细胞、人胚肝HHL-5细胞和人胚肾HE K-2 9 3细胞的增殖/抑制具有明显的干预作用(P0.0 1),并且会影响mR NA的表达水平。其中氟康唑对S MMC-7 7 2 1细胞和HHL-5细胞具有抑制作用,抑制率在1 0%左右,而对HE K-2 9 3细胞具有促增殖作用,荧光染色结果也符合细胞活性检测趋势。在对mR NA的检测上,对S MMC-7 7 2 1细胞的基因调控更加明显,约占6 7%;而对HHL-5细胞和HE K-2 9 3细胞的基因调控较少,各占3 3%左右。结果显示氟康唑具有普遍调控作用的核心靶点为I L-1、I L-6和E G F R。I L-1由各种类型的细胞分泌产生,能够调节基因表达、细胞因子的产生与免疫反应1 6。I L-6是具有多效性的细胞因子,抗I L-6疗法可减少炎症、肝脏急性期蛋白和贫血,并具有抗血管生成作用1 7。总之I L-11 8和I L-61 9参 与 多 条 炎 症 和 癌 症 通 路2 0。P o u r-s h e i k h a n i等2 1发现E G F R能够通过ME KK信号转导途径驱动上皮性卵巢癌细胞的化学抗性,进而起到逆转化疗耐药的作用。M o o n等2 2发现含有WW结构域的转录调节子1与E G F R信号通路的协同激活能够诱导肝细胞癌和胆管癌。除此之外,E G F R也是非小细胞肺癌2 3、乳腺癌2 4等癌种的经典治疗靶点。由此认为,氟康唑并不适合广泛的应用于治疗细胞污染,尤其对于肿瘤细胞而言,可能会影响实验结果,出现假阳性或假阴性情况,降低实验可重复性。493 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 0月 第1 8卷 第5期 C h i n J M y c o l,O c t o b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.5 图2 分子对接结果 图3 细胞毒性及q R T-P C R实验结果F i g.2 M o l e c u l a r d o c k i n g r e s u l t s F i g.3 C y t o t o x i c i t y a n d r e s u l t s o f q R T-P C R e x p e r i m e n t s 所以,当出现细胞污染时,应尽量将污染细胞舍弃处理。若要进行除菌操作,可选用低速离心法或增加三抗处理,若要通过氟康唑进行除菌操作,应摸索适合于实验细胞的毒性临界浓度,并比对除菌前后细胞靶点的表达水平,尽量避免影响实验的可重复性。4 结 论1 0%的氟康唑并不适合作为防治细胞污染的安全剂量,对于某些细胞具有一定的抑制作用,并593 中国真菌学杂志 2 0 2 3年1 0月 第1 8卷 第5期 C h i n J M y c o l,O c t o b e r 2 0 2 3,V o l 1 8,N o.5 且能够调控某些靶点mR NA水平的表达。图4 荧光染色结果F i g.4 F l u o r e s c e n c e s t a i n i n g r e s u l t s参 考 文 献1 KOWA L S KY S F,D I XON D M.F l u c o n a z o l e:a n e w a n t i-f u n g a l a g e n t J.C l i n P h a r m,1 9 9 1,1 0(3):1 7 9-1 9 4.2 D E B RUYN E D,R Y C K E L YN C K J P.C l i n i c a l p h a r m a c o k i-n e t i c s o f f l u c o n a z o l e J.C l i n P h a r m a c o k i n e t,1 9 9 3,2 4(1):1 0-2 7.3 王恩军,靳祎,王亮.氟康唑去除细胞培养中的真菌污染J.河北职工医学院学报,2 0 0 7,2 4(4):7-8.4 王议鹤,王勤章,吴双,等.氟康唑清除h k-2细胞霉菌污染的研究J.大医生,2 0 1 8,3(3):3 4-3 5.5 UTUM I P H,F R A C A R O L,F R AGO S O F Y I,e t a l.C y-t o t o x i c i t y o f f l u c o n a z o l e o n c a n i n e d e n t a l p u l p-d e r i v e d s t e m c e l l sJ.J O r a l B i o l C r a n i o f a c R e s,2 0 2 0,1 0(4):3 6 1-3 6 8.6 C O R R E A R M D S,MO T A T C,GU I MA R E S A C,e t a l.C y t o t o x i c a n d g e n o t o x i c e f f e c t s o f f l u c o n a z o l e o n A f r i c a n g r e e n m o n k e y k i d n e y(V e r o)c e l l l i n eJ.B i o m e d R e s I n t,2 0 1 8,2 0 1 8:6 2 7 1 5 4 7.D O I:1 0.1 1 5 5 1 2 0 1 8 1 6 2 7 1 5 4 7.7 S Z K L A R C Z Y K D,GA B L E A L,L YON D,e t a l.S T R I N G v 1 1:p r o t e i n-p r o t e i n a s s o c i a t i o n n e t w o r k s w i t h i n c r e a s e d c o v e r a g e,s u p p o r t i n g f u n c t i o n a l d i s c o v e r y i n g e n o m e-w i d e e x p e r i m e n t a l d a t a s e t sJ.N u c l e i c A c i d s R e s,2 0 1 9,4 7(D 1):D 6 0 7-D 6 1 3.8 S T E R L I N G T,I RW I N J J.Z I N C 1 5-L i g a n d d i s c o v e r y f o r e v e r y o n eJ.C h e m I n f M o d e l,2 0 1 5,5 5(1 1):2 3 2 4-2 3 3 7.9 T R OT T O,O L S ON A J.A u t o D o c k V i n a:i m p r o v i n g t h e s p e e d a n d a c c u r a c y o f d o c k i n g w i t h a n e w s c o r i n g f u n c t i o n,e f f i c i e n t o p t i m i z a t i o n,a n d m u l t i t h r e a d i n gJ.C o m p u t C h e m,2 0 1 0,3 1(2):4 5 5-4 6 1.1 0 孙阳,李松哲,孙悦,等.射干抗肝癌活性生物碱成分的虚拟筛选研究J.中医药学报,2 0 2 2,5 0(3):1 1 4-1 1 8.1 1 A D A S ME M F,L I NN EMANN K L,B O L Z S N,e t a l.P L I P 2 0 2 1:e x p a n d i n g t h e s c o p e o f t h e p r o t e i n-l i g a n d i n t e r-a c t i o n p r o f i l e r t o D NA a n d RNAJ.N u c l e i c A c i d s R e s,2 0 2 1,4 9(W 1):W 5 3 0-W 5 3 4.1 2 L I S,S UN Y,S UN Y.A c o m p a r a t i v e s t u d y o f s y s t e m s p h a r m a c o l o g y a n d g e n e c h i p t e c h n o l o g y f o r p r e d i c t i n g t a r g e t s o f a t r a d i t i o n a l c h i n e s e m e d i c i n e f o r m u l a i n p r i m a r y l i v e r c a n c e r t r e a t m e n tJ.F r o n t P h a r m a c o l,2 0 2 2,1 3:7 6 8 8 6 2.D O I:1 0.3 3 8 9/f p h a r.2 0 2 2.7 6 8 8 6 2.1 3 VAN D A E L E R,D E B AV E Y E Y,L A G R OU K,e t a l.F l u-c o n a z o l e u n d e r e x p o s u r e i n c r i t i c a l l y i l l p a t i e n t s:a m a t t e r o f u s i n g t h e r i g h t t a r g e t sJ?A n t i m i c r o b A g e n t s C h e m o t h e r,2 0 2 1,6 5(6):e 0 0 4 3 0-2 1.1 4 D E B RUYN E D,R Y C K E L YN C K J P.C l i n i c a l p h a r m a c o k i-n e t i c s o f f l u c o n a z o l eJ.C l i n P h a r m a c o k i n e t,1 9 9 3,2 4(1):1 0-2 7.1 5 W I L D F E U E R A,L AU F E N H,S C HMA L R E C K A F,e t a l.F l u c o n a z o l e:c o m p a r i s o n o f p h a r m a c o k i n e t i c s,t h e r a p y a n d i n v i t r o s u s c e p t i b i l i t yJ.M y c o s e s,1 9 9 7,4 0(7-8):2 5 9-2 6 5.1 6 R B C,GH I R I N GHE L L I F.I n t e r l e u k i n-1 a n d c a n c e rJ.C a n c e r s(B a s e l),2 0 2 0,1 2(7):1 7 9 1.1 7 R O S S I J F,L U Z Y,J OUR D AN M,e t a l.I n t e r l e u k i n-6 a s a t h e r a p e u t i c t a r g e tJ.C l i n C a n c e r R e s,2 0 1 5,2 1(6):1 2 4 8-1 2 5 7.1 8 S A T OH T,OT S UKA A,C ONT A S S O T E,e t a l.T h e i n-f l a mm a s o m e a n d I L-1:i m p l i c a t i o n s f o r t h e t r e a t m e n t o f i n-f l a mm a t o r y d i s e a s e sJ.I mm u n o t h e r a p y,2 0 1 5,7(3):2 4 3-2 5 4.1 9 R O S E-J OHN S.I L-6 t r a n s-s i g n a l i n g v i a t h e s o l u b l e I L-6 r e-c e p t o r:i m p o r t a n c e f o r t h e p r o-i n f l a mm a t o r y a c t i v i t i e s o f I L-6J.I n t J B i o l S c i,2 0 1 2,8(9):1 2 3 7-1 2 4 7.2 0 T AN I GU C H I K,KA R I N M.I L-6 a n d r e l a t e d c y t o k i n e s a s t h e c r i t i c a l l y n c h p i n s b e t w e e n i n f l a mm a t i o n a n d c a n c e rJ.S e m i n I mm u n o l,2 0 1 4,2 6(1):5 4-7 4.2 1 P OUR S HE I KHAN I A,YOU S E F I H,T AVAKO L I-B A-Z Z A Z J,e t a l.E G F R b l o c k a d e r e v e r s e s c i s p l a t i n r e s i s t a n c e i n h u m a n e p i t h e l i a l o v a r i a n c a n c e r c e l l sJ.I r a n B i o m e d J,2 0 2 0,2 4(6):3 7 0-3 7 8.2 2 MOON H,P A R K H,C HA E M J,e t a l.A c t i v a t e d T A Z i n d u c e s l i v e r c a n c e r i n c o l l a b o r a t i o n w i t h E G F R/HE R 2 s i g-n a l i n g p a t h w a y sJ.BMC C a n c e r,2 0 2 2,2 2(1):4 2 3.2 3 L I U X,WAN G P,Z HAN G C,e t a l.E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r(E G F R):A r i s i n g s t a r i n t h e e r a o f p r e c i s i o n m e d i c i n e o f l u n g c a n c e rJ.O n c o t a r g e t,2 0 1 7,8(3 0):5 0 2 0 9-5 0 2 2 0.2 4 S T E E LMAN L S,F I T Z G E R A