激素和逆境胁迫对大豆维生素E和γ-TMT表达的影响.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):148-162收稿日期：20230303基金项目：中央引导地方科技发展资金项目（YDZJSX2022A035），国家重点研发计划（2021YFD16006012），山西省种业创新联合攻关项目（2023xczx03），山西农业大学育种工程项目（YZGC096），山西省自然基金项目（201901D111225）作者简介：白苗，女，硕士，研究方向：大豆遗传育种；Email:通讯作者：杜维俊，女，博士，研究方向：作物遗传育种；Email:；赵晋忠，男，博士，研究方向：生物化学；Email:激素和逆境胁迫对大豆维生素 E 和-TMT 表达的影响白苗1 田雯青1 武帅1 王敏1 王利祥1 岳爱琴1 牛景萍3 张永坡2 高春艳2 张武霞2 郭数进1 杜维俊1 赵晋忠2（1.山西农业大学农学院，太谷 030801；2.山西农业大学基础部，太谷 030801；3.山西农业大学生命科学学院，太谷 030801）摘 要：明确大豆维生素组分含量及合成相关基因-TMT 对激素和逆境胁迫的响应，为维生素 E 参与逆境胁迫研究开辟新思路。以山西省主栽品种晋大 88 为试验材料，在激素、逆境胁迫条件下对不同组织的维生素 E 组分含量、生理指标、-TMT 表达模式进行分析。结果表明，维生素 E 主要存在于叶中，茎中有少量，根中不存在。在激素及盐等胁迫条件下，叶和茎的总维生素E 含量小于对照，但-生育酚含量在 NaCl、H2O2、ABA 胁迫下含量高于对照。在激素和逆境胁迫环境下，大豆植株的生长被显著抑制，株高、鲜重、干重、SPAD 值以及含水量皆小于对照。基因组数据挖掘到 3 个-TMT，启动子中均存在许多胁迫应答和激素响应元件，在激素和逆境胁迫下，-TMT1-TMT3 在根、叶中的表达均发生上调或下调。在 NaCl 胁迫条件下，大豆叶中-生育酚含量增加，而-TMT2、-TMT3 的表达明显下调，推测-TMT2 和-TMT3 可能影响盐胁迫条件下维生素组分含量。激素和逆境胁迫显著抑制大豆茎和叶中维生素 E 的含量，进而抑制植株的生长，影响了大豆-TMT 表达和维生素 E 组分。关键词：大豆；维生素 E；-TMT；激素；逆境；胁迫DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230183Effects of Hormonal and Adversely Stress on Vitamin E and TMT Gene Expression in SoybeansBAI Miao1 TIAN Wenqing1 WU Shuai1 WANG Min1 WANG Lixiang1 YUE Aiqin1 NIU Jingping3 ZHANG Yongpo2 GAO Chunyan2 ZHANG Wuxia2 GUO Shujin1 DU Weijun1 ZHAO Jinzhong2（1.College of Agronomy,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801;2.Department of Basic Science,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801;3.College of Life Science,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801）Abstract:The response of vitamin content and synthesisrelated gene-TMT to hormonal and stress stress was clarified,which opened up new ideas for vitamin E to participate in the study of adversity stress.Taking Jinda 88,the main cultivars of Shanxi province,as the experimental materials,the vitamin E component content,physiological indexes and-TMT expression patterns in different tissues were analyzed under hormonal and adversity stress.The results showed that vitamin E was mainly present in the leaves,a small amount in stems,and absent in roots,and the total vitamin E content in leaves and stems was smaller than that in control under stress conditions such as hormones and salts,but the content of-tocopherols under NaCl,H2O2 and ABA stress was higher than that of the control.Under hormonal and adversity stress,the growth of soybean plants was significantly inhibited,and the plant height,fresh weight,dry weight,SPAD value and water content were all lower than those of the control.Genomic data were mined to 3-TMTs,and there were many stresses response and hormone response elements in the promoters,and the expression of-TMT1-TMT3 in roots and leaves was upregulated or downregulated under hormonal and adversity stress.Under NaCl stress,the content of-tocopherol in soybean leaves increased,while the expression of-TMT2 and-TMT3 was significantly downregulated,2023,39(10)149白苗等：激素和逆境胁迫对大豆维生素 E 和-TMT 表达的影响维生素 E 又名生育酚1，能够抗不孕、抗氧化、保持红细胞完整性、调节体内 DNA 的生物合成，是最主要的抗氧化剂之一。天然维生素 E 广泛存在于各种油料种子及植物油中。大豆中维生素 E 含量约为 18.90 mg/100 g，远远超过所有谷类食品2。膳食 中，维生素 E 的主要来源就是大豆3-4。维生素 E是光合产物-、-、-和-生育酚的总称，它们都有抗氧化特性，由于人类肝脏中有-生育酚转移蛋白，所以-生育酚具有最高的相对维生素 E 活性（100%），-、-和-生育酚的维生素 E 活性分别为50%、10%和 3%。-生育酚甲基转移酶（-TMT）催化-和-生育酚转化为-和-生育酚，是决定植物维生素 E 组分及活性的关键酶之一5。维生素 E 在作物生长发育抵御逆境胁迫发挥重要作用，在改善动物和人类内脏功能，保持生物体健康方面的研究非常多。目前，关于大豆籽粒维生素 E 含量积累研究相对较多，例如，气候条件6-7、稀土镧、铈8对大豆籽粒维生素 E 组分含量及品质的影响、大豆维生素 E 组分含量特异种质的鉴定及优异种质资源的挖掘9等，而对于维生素 E 响应激素和逆境胁迫的研究相对较少。通过对模式植物拟南芥外源喷施 5 mmol/L 维生素 E 发现，经处理的拟南芥单株种子产量显著高于野生型拟南芥，且提升了拟南芥的抗氧化能力10-11，表明根茎叶中维生素 E 组分含量与植物抗逆性有关。Cela 等12和Casadess 等13发现在拟南芥乙烯信号传导（EIN31）、感知（ETR11）和乙烯过量产生（ETO11）的突变体中，EIN31 的突变延迟了-生育酚与水分胁迫相关基因的增加，并导致-生育酚水平降低约 30%，而 ETR11 和 ETO11 突变体在叶片老化过程中-生育酚水平急剧增加（高达 5 倍），表明乙烯感知和乙烯信号传导可能参与水分胁迫和叶片老化过程中生育酚生物合成的调控。Maeda 等14和Knig 等15证明低温处理的 VTE2 具有独特的多不饱和脂肪酸（PUFAs）组成，与野生类型相比，亚麻酸（18：3）水平较低，亚油酸水平（18：2）较高，生育酚在低温下调节拟南芥的质外多不饱和脂肪酸代谢。-生育酚甲基转移酶（-TMT）可以催化生物活性较低的-生育酚甲基化生成更高生物活性的-生育酚，-TMT 产物是决定植物维生素 E 组分及活性的关键酶之一。目前，大豆-生育酚甲基转移酶基因应对激素和逆境胁迫的研究较少，董强16对大豆植株进行低温胁迫处理，观察到低温胁迫使叶片中总维生素 E 含量增加，GmTMT2 转录本很高，揭示了基因在低温胁迫下的重要作用。通过对紫花苜蓿17、辣椒18、花生19-20等作物的-生育酚甲基转移酶基因在抗旱抗盐等逆境方面的研究表明，过量表达 MsTMT 显著促进紫花苜蓿叶片中-生育酚的合成及总生育酚含量的提高，转基因苜蓿抗旱性显著增强，叶片氧化损伤显著减轻，渗透调节物质积累增多21-23。贾会丽等24发现 MsTMT 在紫花苜蓿叶片中表达量最高，受 NaCl、PEG 及黑暗诱导后 MsTMT 表达上调，低温胁迫后 MsTMT 表达下降，外源 ABA 不影响 MsTMT 的表达。在干旱条件下，过表达拟南芥 VTE1 到转基因烟草中，叶绿素含量较野生型增加，VTE1 可用于增加植物的维生素E 含量，并增强对环境胁迫的耐受性25-28。研究者从拟南芥中分离出来两个胁迫诱导启动子和龙葵的VTE2.1 基因，在胁迫诱导型启动子控制下转基因烟草植株在干旱条件下表现出-生育酚水平的增加，增加植物体内维生素 E 的含量，并减少环境胁迫对植物的不利影响29-30。目前，关于大豆富含维生素 E 的研究主要集中在大豆种子维生素 E 积累方面研究，鲜见关于维生素 E 及其合成关键酶-TMT 参与大豆激素和逆境胁迫响应的报道。本研究通过对大豆在激素和逆境胁迫下幼苗各组织维生素组分含量及-TMT 的表达模式进行研究，探讨大豆维生素 E 组分含量及其-TMT 表达与激素and it was speculated that-TMT2 and-TMT3 may affect the content of vitamin components under salt stress.Hormonal and adverse stress significantly inhibited the contents of vitamin E in soybean stems and leaves,which in turn inhibited plant growth,i.e.,affected soybean-TMT expression and vitamin E components.Keywords:soybean;vitamin E;-TMT;hormone;adversity;stress生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10150和逆境的关系，从而为维生素 E 参与逆境胁迫开辟新思路。1 材料与方法 1.1 材料 试验大豆品种为晋大 88 号，由山西农业大学选育，是山西省主栽品种之一。1.2 方法1.2.1-TMT1-TMT3 的生物信息学分析 利用DNAMAN 进行氨基酸序列比对；利用 MG2C2.0 进行染色体定位；利用 PlantCARE、Tbtools 预测启动子的顺式作用元件。1.2.2 逆境胁迫环境下植物形态生理指标的测定 在温度、湿度合适的专用苗室内进行试验，将大豆种子播种于 20 cm15 cm 的育苗盆中，以蛭石作为基质，每穴 2 株，3 次重复，采用随机区组设计。待真叶完全展开后，以浓度为 150 mmol/L NaCl、330 mmol/L H2O2、100 mmol/L PEG、300 mg/L SA、0.20 mg/L ABA 低氮营养液进行胁迫处理，等量低氮营养液为对照，每 2 d 浇水 1 次，每盆浇水 1.5 L31-34。二出复叶完全展开时，用 SPAD502 型叶绿素测定仪测定顶叶到一叶 SPAD 值，每隔 3 d 测量 1 次。第16 天对维生素 E、株高、鲜重、含水量等各指标测定。1.2.3 逆境胁迫环境下植物根、茎、叶维生素 E 含量的测定 采用高效液相色谱法测定大豆维生素E35-36。选取处理后的根、茎、叶组织于 20保存24 h 后，在冷冻干燥箱中冷冻干燥 48 h，研磨成粉，取 0.100 0 g 加入抗坏血酸 0.125 g、70%乙醇提取液3 mL，振荡混匀 30 s，超声提取 20 min，再加入正己烷 6 mL，振荡混匀 30 s，超声提取 15 min，取出后 12 000 r/min 离心 8 min，上清液使用平衡浓缩仪氮气下吹干，复溶于甲醇中备用。色谱条件：流动相为甲醇，柱温 35，检测波长 295 nm，流速 1.0 mL/min，测量维生素 E 中各组分含量。1.2.4 逆境胁迫环境下-TMT 的表达分析 选取经SA、H2O2、PEG、ABA 处理后 0、3、8、18、36 和48 h 的幼苗根、叶，以及经 NaCl 处理后 0、4、8、18、36 和 72 h 的幼苗根、叶。选取生长状态一致的材料，每个样品 3 次生物学重复37-40。液氮速冻，80保存备用。利用 BioRad CFX96 实时荧光定量 PCR 仪，采用全式金 TransStartTip Green qPCR SuperMix 试剂盒进行荧光定量 PCR。根据-TMT序列，使用 Primer Premier6 软件设计实时荧光定量PCR 引物（表 1），GmCYP2 为内参基因。计算-TMT的相对表达。表 1-TMT 的 RT-qPCR 扩增引物Table 1 Primers for RT-qPCR amplification of-TMT gene基因名称 Gene name引物 Primer序列 Sequence（5-3）-TMT1FGTGTGGTCCATGGAGAGTGGRCCCTGTGGCACCATGTTACT-TMT2FCTGGCCGTCAGAGAATGGTTRGGAGCAACCAGTGTAGGCAT-TMT3FTGACGCCCTAAAGCAACCATRCCCTGTGGCACCATGTTACTGmCYP2FCGGGACCAGTGTGCTTCTTCARGTGCTGCTACCCGAGCTAAT2 结果2.1 大豆-TMT的家族成员数量及染色体定位大豆基因组中有 3 个-TMT，命名为-TMT1-TMT3。由染色体定位分析可知，-TMT1 定位区间是在大豆第 12 染色体的 1 020 482-1 023 990 bp，-TMT2 定位区间在大豆第 12 染色体的 1 028 184-1 031 945 bp，-TMT1 和-TMT2 定 位 区 间 比 较靠近，-TMT3 定位区间是在大豆第 9 染色体的 45 209 996-45 214 333 bp。2.2-TMT氨基酸序列比对通过序列比对发现（图 1），-TMT1-TMT3 氨基酸序列相似性为 80.15%，其中，有 5 个谷氨酸差异和 7 个丝氨酸差异，推测-生育酚甲基转移酶更多的丝氨酸差异可能是为甲基化反应提供更多的亚甲基集团以及反应所需的能量，催化反应的进行。2.3-TMT上游2 000 bp启动子顺式作用元件的 预测-TMT1 的上游顺式作用元件有脱落酸应答元件、植物抗旱元件、茉莉酸甲酯反应相关的调节因子、参与光反应的顺式作用调节元件、光响应的顺式调节元件、光敏感元件的一部分、参与防御和应激反应、参与水杨酸反应、光响应元件的一部分等，这些皆2023,39(10)151白苗等：激素和逆境胁迫对大豆维生素 E 和-TMT 表达的影响是参与胁迫、激素、伤害的元件。-TMT2 的上游顺式作用元件有参与脱落酸反应的元件、厌氧诱导中必不可少的元件、植物抗旱元件、茉莉酸甲酯反应相关的调节因子、参与光反应的顺式作用调节元件、光响应要素、普通顺式作用元件参与低温反应的元件、参与防御和应激反应的顺式作用元件等，这些皆是参与胁迫、激素、伤害的元件。-TMT3 的上游顺式作用元件有参与脱落酸反应的元件、植物抗旱元件、参与光反应的顺式作用调节元件、参与赤霉素反应的顺式作用元件、参与防御和应激反应的顺式作用元件、参与水杨酸反应元件等，这些皆是参与胁迫、激素、伤害的元件（图 2）。2.4 不同激素和胁迫环境下植物幼苗生理形态的分析2.4.1 不同激素和胁迫环境下叶片 SPAD 值 经PEG、SA、NaCl、ABA 和 H2O2处理 7 d 时，观察植物理化形态，株高、长势均低于对照，叶色却深于对照，SPAD 值大于对照。随着植株生长，对照叶片湿润有光泽，而处理的材料叶片干涩萎蔫。经 ABA处理 13 d 的植株萎蔫，经 H2O2处理的植株叶片微卷曲，经 PEG 处理的叶片微卷、叶色微黄。同时，处理材料的叶片 SPAD 值伴随叶片水分的减少而降?A：丙氨酸；R：精氨酸；N：天冬酰胺；D：天冬氨酸；C：半胱氨酸；Q：谷氨酰胺；E：谷氨酸；G.甘氨酸；H：组氨酸；I：异亮氨酸；L：亮氨酸；K：赖氨酸；M：蛋氨酸；F：苯丙氨酸；P：脯氨酸；S：丝氨酸；T：苏氨酸；W：色氨酸；Y：酪氨酸；V：缬氨酸 A:Alanine.R:Arginine.N:Asparagine.D:Aspartic acid.C:Cystine.Q:Glutarnine.E:Lutamic acid.G:Glycine.H:Histidine.I:Isoleucine.L:Leucine.K:Lysine.M:Methionine.F:Phenylalanine.P:Proline.S:Serine.T:Threonine.W:Tryptophan.Y:Tyrosine.V:Valine图 1-TMT 氨基酸序列的比对Fig.1 Amino acid sequence alignment of-TMT图 2-TMT 启动子顺式作用元件预测热图Fig.2 Prediction heat map of-TMT gene promoter cis-acting element生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10152低，可能是胁迫处理阻止了 Na+、CI-等离子流向叶片，使叶绿素的合成受到影响，活性氧的大量积累也导致叶绿素的合成遭受破坏，同时加速了叶绿素的降解。处理 16 d 时，对照长势旺盛，株高最高，SPAD值最低，推测由于实验室光强稍微过盛，叶片或叶绿体暴露在强光下会导致叶绿素含量下降，光合作用下降，叶绿素蛋白质复合物中的 PSII 核心的 CPa受损，影响了 LHCP，抑制 PSII 的活性，最终导致SPAD 值降低（图 3）。2.4.2 不同激素和胁迫环境下植株鲜重、干重、含水量及株高的变化 由结果可知，NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA 处理后材料的株高约为 CK 的 0.45、0.31、0.65、0.29 和 0.31 倍，与 CK 相比，激素和胁迫处理后材料的株高显著低于 CK 的株高；NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA 处理后材料的鲜重约为 CK的 0.63、0.38、0.83、0.47 和 0.38 倍，处理后材料鲜 重 显 著 低 于 CK。NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA处理后材料的干重约为 CK 的 0.84、0.41、0.83、0.70和 0.60 倍，与 CK 相比，H2O2处理后材料的干重显著低于 CK，SA、ABA、PEG、NaCl 处理后材料的干重低于 CK。NaCl、H2O2、PEG、SA、ABA 处理后材料的含水量约为 CK 的 0.84、0.92、0.99、0.94 和 0.95倍，与 CK 相比，NaCl、H2O2、SA、ABA 处理后材料的含水量显著低于 CK，PEG 处理后材料的含水量低于 CK。CK 三出复叶、第二次三出复叶抽出的时间显著早于激素和胁迫处理的植株，表明激素和逆境胁迫环境下大豆植株的生长被显著抑制。材料株高、鲜重干重以及含水量皆小于 CK，植株生长处于一种受压迫的不利条件（图 4）。2.5 逆境胁迫环境下植物根茎叶维生素E含量 测定2.5.1 逆境胁迫环境下植物根茎叶维生素 E 含量分析 晋大 88 经激素和逆境处理生长期 16 d 后，对其根茎叶维生素 E 含量进行测定，由表 2 可知，各生育酚标准品的线性回归方程 R2 0.999 7，说明各生育酚质量浓度与峰面积的线性条件良好。与CK 相 比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA 处 理 后 的叶中总维生素 E 含量平均值约为 CK 总维生素 E 含量平均值的 0.85、0.94、0.90、0.97 和 0.78 倍（表3），激素和胁迫处理后的总维生素 E 含量平均值小710131620304050NaCl?NaCl processing time/dSPAD?SPAD valuesCKTreatedababaaab710131620304050H2O2?H2O2 processing time/dSPAD?SPAD valuesCKTreatedababaaab710131620304050PEG?PEG processing time/dSPAD?SPAD valuesCKTreatedababaaab710131620304050SA?SA processing time/dSPAD?SPAD valuesCKTreatedababaaab710131620304050ABA?ABA processing time/dSPAD?SPAD valuesCKTreatedaabababa不同小写字母表示与对照相比差异显著（P0.05）。下同Different lowercase letters indicate significant differences compared with the control（P-生育酚-生育酚（表 3），在茎中，-生育酚-生育酚（表 4）。在 晋 大 88 叶 中，与 CK 相 比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA 处理后的-生育酚含量平均值约为 CK 的 0.58、0.71、0.42、0.56 和 0.56 倍（表 3），PEG、NaCl、ABA、SA 处理后的-生育酚含量平均值低于 CK，H2O2处理后的-生育酚含量平均值显著低于 CK。与 CK 相比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA 处理后的-生育酚含量平均值约为 CK 的 0.96、1.18、1.14、1.14 和 0.87 倍（表 3），CK 高于 PEG、SA 处理后的-生育酚的含量，低于 H2O2、NaCl、ABA 处理后的-生育酚的含量，H2O2、NaCl、ABA处理一定程度上提高了-生育酚的含量。与 CK 相比，PEG、NaCl、H2O2、ABA、SA 处理后的-生育酚含量平均值约为 CK 的 0.57、0.59、0.22、0.51 和0.53 倍（表 3），PEG、NaCl、ABA、SA 处理后的-生育酚含量低于 CK，H2O2处理后的-生育酚含量显著低于 CK（表 3）。在晋大 88 茎中，与 CK 相比，PEG 处理后的-生育酚含量平均值约为 CK 的 0.37倍，NaCl 处理后的-生育酚含量平均值约为 CK 的0.12 倍，PEG 和 NaCl 处理后的-生育酚含量显著低于 CK（表 4）。与 CK 相比，PEG 处理后的-生育酚含量平均值约为 CK 的 1.19 倍，NaCl 处理后的-生育酚含量平均值约为 CK 的 1.20 倍，PEG 和 NaCl处理后的-生育酚含量高于 CK（表 4）。2.6-TMT对逆境胁迫条件的响应分析2.6.1-TMT1 对逆境胁迫条件的响应 为探究-TMT1-TMT3 是否与激素和逆境响应相关，对大豆幼苗进行 SA、ABA、H2O2、PEG 和 NaCl 胁迫处理，检测处理不同时间该基因的表达情况。经 SA 处理18 h 时，叶中-TMT1 相对表达量最高，约为对照的 45.05 倍，基因相对表达表现上调。经 SA 处理 3 h 时，根中基因相对表达量最高，约为对照的 84.2倍，基因相对表达表现上调；经 ABA 处理 48 h 时，CKNaClH2O2PEGSAABA0204060?Different processing conditions?Plant height/cmabbbbbCKNaClH2O2PEGSAABA0246?Different processing conditions?Fresh weight/gabbbbbCKNaClH2O2PEGSAABA0.00.51.0?Different processing conditions?Dry weight/gaaabaaCKNaClH2O2PEGSAABA60708090?Different processing conditions?Moisture content/%abbabb图 4 激素和逆境胁迫环境下植物各生理指标测定Fig.4 Determination of physiological indexes of plants under hormonal and adversely stress environment生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10154叶中-TMT1 相对表达量最低，约为对照的 0.02 倍，基因相对表达量受到显著抑制。经ABA处理36 h时，根中基因相对表达量最高，约为对照的 50.16 倍，3 h 时，基因相对表达量最低，约为对照的 1.12 倍，呈持续上调趋势；经 H2O2处理 8 h 时，叶中-TMT1相对表达量最高，约为对照的 24.9 倍，36 h 时，基因相对表达量最低，约为对照的 6.13 倍，呈上调趋势。经 H2O2处理 8 h 时，根中基因相对表达量最高，约为对照的 9.54 倍，呈上调趋势；经 PEG 处理 18 h，-TMT1 在叶中相对表达量最高，约为对照的 3.34 倍，呈上调趋势。经 PEG 处理 48 h，基因在根中相对表达量最低，约为对照的 0.001 倍，表达量受到显著抑制；经 NaCl 处理 4 h，-TMT1 在叶中相对表达量最高，约为对照的 110.82 倍，18 h 时，基因相对表达量最低，约为对照的 0.78 倍。经 NaCl 处理 36 h，基因在根中的相对表达量最高，约为对照的39.90倍，8 h 时，基因相对表达量最低，约为对照的 1.28 倍（图 5）。2.6.2-TMT2 对逆境胁迫条件的响应 经 SA 处理48 h时，-TMT2在叶中表达量最低，约为对照的0.001倍，表达受到显著抑制。在根中表达量呈先升高后降低趋势，48 h 时，基因相对表达量最低，约为对照的 0.001 倍，表达受到显著抑制；在 ABA 处理条件下，3 h 时，-TMT2 在叶中表达量最低，约为对照的 0.006 倍，表达受到显著抑制。3 h 时，在根中表达量最低，约为对照的 0.72 倍，18 h 时，基因表达量最高，约为对照的 100.34 倍，呈上调趋势；在H2O2处理条件下，48 h 时，-TMT2 在叶中表达量最高，约为对照的 12.8 倍，总体呈上调趋势。8 h 时，在根中表达量最高，约为对照的 1.8 倍，呈上调趋势。在 PEG 处理条件下，3 h 时，-TMT2 在叶和根中的相对表达量显著下降，8 h 之后无显著变化；在NaCl 处理条件下，72 h 时，-TMT2 在叶中的表达量最低，约为对照的 0.001 倍，表达受到显著抑制。36 h 时，在根中的表达量最高，约为对照的 12.85 倍，总体呈上调趋势（图 6）。2.6.3-TMT3 对逆境胁迫条件的响应 在 SA 处理条件下，48 h 时，-TMT3 在叶中表达量最低，约为对照的 0.002 倍，表达受到显著抑制。36 h 时，在根中的表达量最高，约为对照的 16.4 倍，总体呈上调趋势。在 ABA 处理条件下，18 h 时，-TMT3 在叶中表达量最高，约为对照的 2.09 倍，48 h 时，基表 3 激素和逆境胁迫环境下大豆叶中维生素 E 含量分析Table 3 Analysis of vitamin E content in soybean leaves under hormonal and adversely stress environment不同处理Different treatment-生育酚-tocopherol/（g g-1）-生育酚-tocopherol/（g g-1）-生育酚-tocopherol/（g g-1）总维生素 ETotal vitamin E/（g g-1）CK21.359.41a93.0442.07a17.367.52a131.7555.16aPEG12.284.81b89.3534.07a9.775.26b111.4043.08bNaCl15.260.29b109.3715.00b10.320.44b124.2514.47aH2O28.930.61b105.837.39b3.860.38b118.628.26bABA11.952.14b106.337.45b8.930.63b127.218.77aSA11.963.21b81.3325.48b9.221.11b102.5025.49b注：不同小写字母表示与对照相比差异显著（P0.05）。下同Note:Different lowercase letters indicate significant differences compared with the control（P-生育酚-生育酚；在茎中，-生育酚-生育酚。在叶中 PEG、SA、NaCl、ABA 处理后的、-生育酚含量高于 CK 的、-生育酚含量，H2O2处理后的、-生育酚含量显著高于 CK 的、-生育酚含量，激素和胁迫条件下叶中-生育酚和-生育酚含量被抑制，CK 高于 PEG、SA 处理后的-生育酚的含量，低于 H2O2、NaCl、ABA 处理后的-生育酚的含量，H2O2、NaCl、ABA 处理一定程度上提高了的-生育酚含量。茎中-生育酚的含量为 0，与 CK 相比，PEG 和 NaCl 处理后的茎中-生育酚含量显著低于CK 的-生育酚含量，PEG 和 NaCl 处理后的茎中-生育酚含量高于 CK 的-生育酚含量。3.4-TMT启动子顺式作用元件预测及对激素处理和胁迫的响应分析-TMT 的启动子含有胁迫、伤害、激素响应等多种顺式作用元件，表明-TMT 可能参与调控复杂的非生物胁迫响应。研究者对-TMT 的启动子顺式作用元件进行了预测49-50。FAE1 是脂肪酸链延长酶的组分，在油料种子的胚中特异性表达，张明等51通过以拟南芥基因组为模板设计引物并且扩增到该基因启动子片段，与甘蓝型油菜-生育酚甲基转移酶（-TMT）基因连接，将构建成的表达载体 pFAE1TMT 通过农杆菌介导转化到大豆胚尖，获得了 2 株转-TMT 大豆植株。Tewari 等52对大豆-生育酚甲基转移酶基因启动子进行了克隆及功能分析。前人研究表明-TMT 启动子多态性可能与一些大豆品种的高-生育酚浓度有关53-55，为了解大豆品种-生育酚含量遗传变异的分子基础，对高-生育酚含量大豆品种和低-生育酚含量大豆品种-TMT 上游 1.4 kb 的启动子区进行了克隆，在核心启动子区域外观察到 7 个单核苷酸多态性，基于缺失启动子结构分析进一步阐明这些 SNP 影响-TMT启动子活性和-生育酚的浓度56-57。目前，国内关于大豆维生素 E 合成关键酶基因-TMT 对非生物胁迫及激素诱导响应的研究较少，进一步利用 RTqPCR 方法分析激素和胁迫诱导下的表达模式，在激素和逆境胁迫下，-TMT1 受 H2O2、NaCl、SA 诱导后叶和根中表达上调，受 ABA 诱导后叶中表达下调，根中表达上调，受 PEG 诱导后叶中表达上调，根中表达下调；-TMT2 受 H2O2诱导后叶和根中表达上调，受 SA 诱导后叶和根中表达下调，而在 NaCl、ABA 诱导后叶中表达下调，根中表达上调；-TMT3 受 H2O2、PEG、ABA、SA、NaCl诱导后根中表达上调，叶中表达下调。结合前面对盐胁迫条件下大豆维生素 E 及各组分含量的测定，大豆叶中-生育酚含量增加，而-TMT2、-TMT3的表达明显下调，由于-生育酚甲基转移酶（-TMT）可以催化-生育酚转化为-生育酚，推测-TMT2、-TMT3 影响盐胁迫条件下维生素 E 组分含量，在盐胁迫条件下-TMT2、-TMT3 表达量的下降导致大豆叶中-生育酚含量的增加。在苜蓿和油菜中发现-TMT 的过表达可以增加-生育酚的积累，在调控紫花苜蓿对PEG模拟干旱胁迫的响应中起积极作用，其机制可能涉及活性氧清除系统、气孔发育和多种激素信号通路58-59。研究人员发现-生育酚对逆境毒害的抵抗和减轻作用，玉米耐镉 ZmVTE4 编码-生育酚甲基转移酶通过其产物-生育酚减轻镉毒2023,39(10)159白苗等：激素和逆境胁迫对大豆维生素 E 和-TMT 表达的影响性60-61，在 Cd 逆境胁迫下，筛选获得具有耐 Cd 特性的玉米 ZmVTE4，通过异源表达 ZmVTE4 增强了酵母和烟草对 Cd 的耐受性，增加玉米叶片的生育酚含量，烟草叶片-生育酚和-生育酚的含量也增加。由此可见，在逆境胁迫下会促进-生育酚转化成-生育酚，增加-生育酚的含量。4 结论激素和逆境胁迫显著抑制大豆植株的生长。维生素 E 主要存在于叶中，茎中有少量。在激素和逆境胁迫处理时，-生育酚和-生育酚被抑制。其中，-TMT1 受 NaCl 诱导后，叶和根中表达上调。-TMT2受 NaCl 诱导后叶中表达下调，在根中表达上调。-TMT3 受 NaCl 诱导后，在根中表达上调，叶中表达下调。盐胁迫条件下，-TMT2、-TMT3 表达量的下降导致大豆叶中-生育酚含量的增加，-TMT2、-TMT3 影响盐胁迫条件下维生素 E 组分的含量。参 考 文 献1徐锐.高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中维生素 A 和 E含量的研究D.广州:华南理工大学,2019.Xu R.Determination of vitamin A and vitamin E in infant formula milk powder by HPLCD.Guangzhou:South China University of Technology,2019.2吴琦.黄豆的营养价值及其加工价值J.现代食品,2022,28（9）:110112.Wu Q.Nutritional value of soybean and its processing valueJ.Mod Food,2022,28（9）:110112.3李傲辰.大豆的主要营养成分及营养价值研究进展J.现代农业科技,2020（23）:213214,218.Li AC.Main nut