S100P对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制_高露.pdf

基金项目:国家自然科学基金项目(81971483);安徽省高校协同创新项目(GXXT 2020 058);安徽省高校拔尖人才项目(gxbjZD12);安徽省职业健康安全工程实验室项目(AYZJSGCLK202201001，AYZJSGCLK202201002，AYZJS-GCLK202202001);工业粉尘深度净化与职业健康安全安徽省教育厅重点实验室项目(AYZJSGXLK202202002);安徽理工大学大学生创新创业项目(2021CX2125，2021CX2126，2021CX2124，2022CX2139，2022CX2140)作者简介:高露，女，1999 09 生，在读硕士，E-mail:austgaol126 com收稿日期:2022 11 16S100P 对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制高露1，梁超1，周家伟1，刘亚锋1，郭健强1，王清森1，吴静1，2，3，4#，胡东1，2，3，4*(1安徽理工大学医学院免疫学教研室，淮南232001;2安徽省职业健康安全工程实验室;3工业粉尘深度净化与职业健康安全安徽省教育厅重点实验室;4安徽理工大学工业粉尘防治与职业安全卫生教育部重点实验室;*通讯作者，E-mail:austhudong 126 com;#共同通讯作者，E-mail:wujing8008126 com)摘要:目的探究 S100P 对人肺癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法qT-PC 检测人正常肺上皮细胞和 4 种人肺癌细胞 A549、95D、H1975 和 LTEP-a-2 中 S100P 的表达。将处于对数生长期的 A549 细胞分为两组:对照组(感染含有无意义链 Plvx-shNA2-shNC 的慢病毒载体)和敲低组(感染含有 Plvx-shNA2-S100P 的慢病毒载体)，然后利用 qT-PC 检测A549 细胞中 S100P 基因的水平。MTT 及克隆形成实验检测敲低 S100P 后 A549 细胞的增殖能力，流式细胞术检测敲低 S100P后 A549 细胞的凋亡水平，Western blot 检测增殖相关蛋白 PCNA及凋亡相关蛋白 cleaved Caspase-8、Caspase-8、cleaved PAP、PAP 及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPA-)蛋白的表达情况。结果人肺癌细胞系中 S100P 基因的相对表达量高于人正常肺上皮细胞(P0 01)。成功感染慢病毒后，敲低组 A549 细胞 S100P 基因的相对表达量较对照组明显降低(P 0 01)。与对照组相比，敲低组 A549 细胞增殖能力显著下降(P 0 01)，凋亡率显著上升(P 0 01)。与对照组相比，敲低组A549 细胞中 PCNA 的蛋白含量显著降低(P 0 01)，Caspase-8和 PAP的蛋白含量无明显变化，cleaved Caspase-8、cleavedPAP 及 PPA-的蛋白含量显著增高(P0 01)。结论S100P 在肺癌细胞中表达上调，沉默 S100P 后可通过抑制 PPA-信号通路，从而抑制肺癌细胞的增殖并促进肺癌细胞的凋亡。关键词:S100P;肺癌;PPA-;细胞增殖;细胞凋亡中图分类号:7342文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0409 07DOI:1013753/j issn1007 6611202304001Effect of S100P on proliferation and apoptosis of lung cancer cells and its mechanismGAO Lu1，LIANG Chao1，ZHOU Jiawei1，LIU Yafeng1，GUO Jianqiang1，WANG Qingsen1，WU Jing1，2，3，4#，HU Dong1，2，3，4*(1Department of Immunology，School of Medicine，Anhui University of Technology，Huainan 232001，China;2Anhui OccupationalHealth and Safety Engineering Laboratory;3Anhui Key Laboratory of Industrial Dust Deep Purification and Occupational Health，Ministryof Education;4Key Laboratory of Industrial Dust Prevention and Control Occupational Safety and Health of the Ministry of Education;*Corresponding author，E-mail:austhudong126 com;#Co-corresponding author，E-mail:wujing8008126 com)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of S100P on proliferation and apoptosis of human lung cancer cellsMethodsThe expression of S100P was detected in human normal lung epithelial cells and four human lung cancer cells A549，95D，H1975 and LTEP-a-2 by qT-PC A549 cells in the logarithmic growth phase were divided into two groups:control group and knock-down group，and the cells were infected with lentiviral vectors containing nonsense strands Plvx-shNA2-shNC and lentiviral vectorscontaining Plvx-shNA2-S100P，respectively Then qT-PC was used to verify the level of S100P gene in A549 cells MTT andclonogenesis experiments were used to detect the proliferation ability of A549 cells after knocking down S100P Flow cytometry was usedto detect the apoptosis of A549 cells after knocking down S100P Western blot was used to detect the expression of proliferation-relatedprotein PCNA，apoptosis-associated proteins cleaved Caspase-8，Caspase-8，cleaved PAP and PAP proteins，and peroxisome prolif-erator-activated receptor(PPA-)proteinesultsThe relative expression of S100P in human lung cancer cell lines was higherthan that of human normal lung epithelial cells(P0 01)After successful lentivirus infection，the relative expression of S100P genein A549 cells in knockdown group was significantly lower than that in control group(P 0 01)Compared with control group，theproliferation capacity of A549 cells was significantly decreased and the apoptosis rate was significantly increased in knockdown group(P0 01)Compared with control group，the protein level of PCNA in A549 cells in knockdown group was significantly reduced(P904山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期0 01)，the protein levels of Caspase-8 and PAP showed no significant change，and the protein levels of cleaved Caspase-8，cleavedPAP and PPA-were significantly increased(P 0 01)ConclusionThe expression of S100P is upregulated in lung cancercells，and S100P silencing can inhibit the proliferation of lung cancer cells and promote the apoptosis by inhibiting the PPA-signaling pathwayKey words:S100P;lung cancer;PPA-;cell proliferation;cell apoptosis肺癌是世界第二大最常见的癌症，其发病率占全部已确诊癌症的 11 4%1。虽然手术、化学疗法和最近开发的靶向治疗已为肺癌患者提供主要治疗的方法2，但其 5 年生存率仍明显低于前列腺癌、乳腺癌和结肠癌3，因此有必要更深层次地探讨肺癌的发病机制，开发针对发病机制方面的新疗法，以提高患者的总体生存率。S100P 是钙结合蛋白家族中的一员，首次在人类胎盘中发现，在肺癌组织中高度上调4。根据报道，S100P 基因参与癌症的发生和发展，与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等生物学行为有关5 9。在肝细胞癌中，S100P 高表达并通过靶向cyclin D1 和 CDK2 参与细胞生长和抗凋亡10。胃癌中敲低 S100P 能促进胃癌细胞的凋亡并抑制其集落形成能力11。然而，尚不能完全明确 S100P 蛋白在肺癌中对凋亡和增殖的作用及其相应机制。因此，本研究通过慢病毒沉默肺癌细胞系 A549 细胞中S100P 基因表达，从而探究 S100P 基因对肺癌细胞凋亡和增殖的影响及机制，为阐明 S100P 影响肺癌细胞增殖和凋亡的分子机制提供一定的理论依据。1材料与方法1 1主要试剂Plvx-shNA2 质粒、psPAX2 和 pMD2 G 购自湖南丰晖生物科技有限公司，PCNA 兔多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，Caspase-8 兔单克隆抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，cleavedCaspase-8 兔单克隆抗体、PAP 兔单克隆抗体、cleaved PAP 兔单克隆抗体和 PPA-兔单克隆抗体购自美国 CST 公司，-actin 兔多克隆抗体、HistoneH3 兔单克隆抗体和荧光定量 PC 试剂盒购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG、TIzol 试剂、逆转录试剂盒购自赛默飞世尔科技中国有限公司，MTT 试剂盒购自美国CST 公司，LipofectamineTM2000 购自美国 Thermo 公司，IPA 裂解液、5 SDS 上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，Annexin-APC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物公司，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。1 2主要仪器Epoch 2 酶标仪(美国 Agilent 公司);Hema9600 梯度基因扩增仪(珠海黑马医学仪器有限公司);Quantstudio 3 实时荧光定量 PC 仪(赛默飞世尔科技中国有限公司);ImageQuant 800 凝胶成像分析仪(英国 Amersham 公司);DMi8 荧光倒置显微镜(德国 Leica 公司)。1 3细胞培养人正常肺上皮细胞株 BEAS-2B、人肺癌细胞株(A549、95D、H1975、LTEP-a-2)和人胚肾 293T 细胞株均为安徽理工大学医学院前沿实验中心常规保存。所有细胞培养于含 10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100 g/ml)的 DMEM 或1640 培养液，于 37、5%CO2的饱和湿度培养，每隔 2 3 d传代一次。1 4沉默 S100P 基因表达的肺癌细胞株建立将人胚肾 293T 细胞(5 105个/孔)接种于直径 6 cm 培养皿中培养 24 h，随后加入 2 g Plvx-shNA2 质粒、1 g psPAX2 和1 g pMD2 G 混合于LipofectamineTM2000 中进行转染，转染时 293T 细胞密度为 80%90%且细胞分布均匀，状态良好。转染 6 h 后观察细胞状态，弃去培养基换成新鲜的完全培养基，将细胞置于 37、5%CO2培养。分别于转染后的 48 h 和 72 h 收集细胞上清液，4、3 000 r/min 离心 10 min 去除细胞碎片，0 45 m 针式滤器过滤。将生长状态良好的 A549 细胞计数后以 1 104个/孔铺至六孔板，24 h 后在细胞密度为50%60%时进行转染，每孔加入 500 l 病毒上清液与等体积的完全培养基，转染12 h 后弃去上清液，加入完全培养基继续培养传代，于荧光显微镜下观察转染效率。转染成功后用质量浓度为 1 5 g/ml 的 puromycin筛选 3 5 d，直至筛选出稳定转染 Plvx-shNA2-shS100P 的 A549 细胞(敲低组)和稳定转染 Plvx-shNA2-shNC 的 A549 细胞(对照组)。用实时荧光定量 PC 法(qT-PC)检测 S100P 基因的敲低水平。014J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 41 5qT-PC 法检测细胞中 S100P 的表达水平对人正常肺上皮 BEAS-2B 细胞和 4 种肺癌细胞中 S100P 的 mNA 表达进行分析，使用 TIzol 试剂提取感染后对照组和敲低组细胞的总 NA 成分，测定总 NA 浓度及纯度。逆转录获得 cDNA，20 保存备用。使用 SYB Green 试剂盒在荧光定量PC 仪上进行 qT-PC 检测。GAPDH 作为内参基因。S100P 上 游 引 物 为 5 AAGGATGCCGTG-GATAAATTGC 3，下游引物为 5 ACACGAT-GAACTCACTGAAGTC 3;GAPDH 上游引物为5 CTGGGCTACACTGAGCACC 3，下游引物为 5 AAGTGGTCGTTGAGGGAATG 3。反应条件:95 预变性 30 s;95 变性20 s，60 退火30 s，72 延伸 30 s，共 43 个循环。实验重复 3 次。实验中样本基因的 Ct 值通过 GAPDH 的 Ct 值均一化，即 Ct=Ct样本 Ct内参，样本基因 mNA 相对丰度值以 2 Ct值表示。1 6平板克隆形成实验采用 0 25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的感染后的两组 A549 细胞，吹打成单个细胞，接种于6 孔板(1 000 个/孔)中，轻轻晃动使细胞均匀分散。37、5%CO2培养。当出现肉眼可见的克隆时即终止培养，弃培养液。加入4%多聚甲醛固定15 min，加入适量结晶紫染液染色 30 min，计算克隆数。1 7MTT 法检测细胞增殖将转染后的两组 A549 细胞分别接种到 96 孔板(5 103/孔)中培养过夜。分别在 24，48，72 h 后向每孔中加入 20 l MTT 溶液(5 mg/ml)。37 避光孵育4 h 后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入 150 l DMSO，震荡 10 min，使结晶物充分溶解。使用分光光度计在 490 nm 波长处测量吸光度。1 8流式细胞术检测细胞凋亡取转染后的两组 A549 细胞，调整细胞浓度，以每孔 3 105个细胞的密度分别接种于直径为 6 cm培养皿中。用 DMEM 培养基培养 48 h，收集细胞沉淀及培养液，2 000 r/min 离心 5 min，加入预冷的PBS 洗涤细胞 2 次，收集 1 1055 105个细胞，加入500 l Binding Buffer，轻轻吹匀成单细胞悬液，依次加入5 l Annexin-APC 和5 l PI 染液，轻轻吹匀，避光孵育 10 min，使用流式细胞仪上机检测。1 9Western blot 检测增殖相关蛋白、凋亡相关蛋白和 PPA-蛋白的表达将转染后的两组 A549 细胞分别接种于直径为6 cm 培养皿中，用 DMEM 培养基培养 12 h，待充分贴壁生长后收集细胞沉淀，加入适量IPA 裂解液，冰上充分裂解30 min，12 000 r/min 离心20 min，收集上清液并用 BCA 法测定蛋白浓度。蛋白变性后电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，分别加入 PCNA 抗体(1 1 000)、Caspase-8 抗体(1 1 000)、cleavedCaspase-8 抗体(1 1 000)、PAP 抗体(1 1 000)、cleaved PAP 抗体(11000)、PPA-抗体(11 000)、-actin 抗体(110 000)和 Histone H3 抗体(11 000)，4 条件下孵育过夜。TBST 洗涤 3 次，加入 HP标记的二抗(1 10 000)室温孵育 1 h，TBST 洗涤 3次，洗膜后采用 ECL 发光液成像系统检测，采用Image J 软件分析条带灰度值，计算各目的蛋白的相对表达量。1 10统计学分析采用 GraphPad Prism 8 0 1 软件进行统计学分析。所有实验数据均以平均数 标准差(?x s)表示，每个实验至少经过3 次重复验证。使用两样本 t检验方法分析比较两组间的差异，采用单因素方差分析比较多组间的差异，其中两两比较采用 LSD 检验。P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1S100P 基因在人正常肺上皮细胞和人肺癌细胞中的表达qT-PC 结果显示，与正常肺上皮细胞相比，4种肺癌细胞中 S100P mNA 表达水平均明显升高(P 0 001，见表 1)。表 1qT-PC 检测不同肺癌细胞系中 S100P 的表达Table 1The expression of S100P in lung cancer cell linesdetected by qT-PC细胞种类S100P mNABEAS-2B1 00 0 1695D2 13 0 08A549156 37 14 97H1975267 48 24 40LTEP-a-22 656 76 124 44F1 208P0 000 1与 BEAS-2B 细胞株相比，P0 000 12 2构建稳定干扰 S100P 基因的肺癌 A549 细胞株慢病毒感染 48 h，经 puromycin 筛选后，显微镜观察各组稳定细胞株荧光表达(见图 1)。qT-PC114山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期检测结果显示，与对照组相比，敲低组 A549 细胞中S100P 在 mNA 水平的表达明显受到抑制(P 0 01，见图 1)，表明成功构建稳定干扰 S100P 基因的肺癌 A549 细胞株。图 1慢病毒感染后肺癌 A549 细胞的荧光强度和 S100P 的沉默效率Figure 1Fluorescence intensity of lung cancer A549 cells after lentivirus infection and silencing efficiency of S100P2 3沉默 S100P 表达对 A549 细胞增殖的影响平板克隆形成实验结果显示，与对照组相比，敲低组肺癌 A549 细胞的克隆形成个数明显减少(P 0 01，见图 2)。通过 MTT 比色法检测沉默 S100P表达后 24，48，72 h 时 A549 细胞增殖能力。结果显示，两组细胞在接种24 h 和48 h 时细胞增殖能力无明显差异，而在 72 h 时敲低组肺癌细胞增殖能力显著减少，差异有统计学意义(P 0 01，见图 2)。以上结果均表明，沉默 S100P 基因的表达具有抑制肺癌细胞增殖的作用。与对照组比较，P0 01，P0 000 1图 2沉默 S100P 对肺癌 A549 细胞增殖的影响Figure 2Effect of S100P silencing on proliferation of lung cancer A549 cells2 4沉默 S100P 表达对肺癌 A549 细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示，与对照组相比，敲低组肺癌细胞凋亡率显著上升，差异具有统计学意义(P 0 001，见图 3)，表明沉默 S100P 对 A549 细胞的凋亡具有促进作用。2 5沉默 S100P 表达对肺癌 A549 细胞中相关蛋白含量的影响Western blot 检测结果显示，与对照组相比，敲低组肺癌细胞中与细胞增殖有关的 PCNA 蛋白表达下降(P 0 000 1)，而与细胞凋亡有关的 cleavedCaspase-8、cleaved PAP 的蛋白表达明显上升(P 0 01，见图 4)。2 6S100P 通过 PPA-诱导细胞凋亡蛋白的表达Western blot 结果显示，与对照组相比，敲低组细胞中 PPA-蛋白相对含量明显下降，差异具有统计学意义(P 0 001，见图 5)。214J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4图 3沉默 S100P 对肺癌 A549 细胞凋亡的影响Figure 3Effect of silence of S100P on apoptosis of lung cancer A549 cells与对照组比较，P0 01，P0 001，P0 000 1图 4沉默 S100P 表达对肺癌 A549 细胞中相关蛋白表达的影响Figure 4Effect of S100P silencing on related protein expression in lung cancer A549 cells与对照组比较，P0 001图 5沉默 S100P 表达对肺癌 A549 细胞中 PPA-蛋白表达的影响Figure 5Effect of S100P silencing on PPA-protein expression in lung cancer A549 cells314山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期3讨论S100 蛋白通常以钙依赖性方式形成异二聚体复合物，广泛参与多种恶性肿瘤的多种生物学过程，在肺癌14、胆管癌15、胰腺癌16、结直肠癌17 和前列腺癌18 中发挥促癌作用，其表达失调是癌症的一个显著特征，不同类型的癌症都呈现出独特的 S100蛋白表达特征19。因此，S100 蛋白是许多癌症治疗的重要诊断标志物和治疗靶点20。S100P 作为S100 钙结合蛋白大家族的一员，在细胞外和细胞内与许多蛋白质相互作用，其在各种人类癌症中的过度表达与疾病进展、化学耐药性获得和预后不良有关，尤其在胰腺癌上，抗 S100P 特异性治疗已经取得了相当大的进展21 24。为了剖析肺癌细胞中S100P 影响肺癌细胞增殖和凋亡的分子机制，我们首先评估了 S100P 在已报道的影响多种癌症增殖活力和凋亡的生物学行为中的作用。根据已有的报道得知，S100P 促进前列腺癌细胞生长，抑制基底和喜树碱诱导的细胞凋亡25;GnH 拮抗剂通过下调S100P 来诱导子宫内膜上皮细胞凋亡26;且在胃癌中敲低 S100P 可促进细胞凋亡并抑制胃癌细胞的集落形成能力11。本研究中，S100P 在肺癌细胞中的表达显著上调，提示 S100P 可能与肺癌的发生发展有着密切关联。本研究进一步沉默肺癌细胞中S100P 的表达研究肺癌细胞的增殖活力和凋亡能力，结果表明，沉默肺癌细胞中 S100P 的表达后，肺癌细胞增殖活力显著降低，细胞凋亡明显增加。以上结果均提示 S100P 在肺癌中可作为癌基因而影响肿瘤细胞的增殖和凋亡能力。从细胞功能上看，细胞凋亡是细胞主动发生的生物过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控，对多细胞生物体具有重要的意义27。经典的细胞凋亡途径主要有两条:细胞外途径(细胞表面受体死亡途径)和细胞内途径(线粒体引发途径)28。Caspase 酶家族在细胞外途径起重要作用，是介导细胞凋亡的关键蛋白，其中 Caspase-8 是死亡受体通路的中间调控蛋白，并参与细胞凋亡的起始。PPA-属于激素核受体超家族的成员29，在脂质代谢、免疫调节、细胞生长与分化以及肿瘤的发展中起到至关重要的作用30。有研究表明 SEPINA3K 诱导的SW480 和 HT-29 细胞凋亡是由 PPA/Fas/FasL 信号通路介导的31。同时最新研究已证实 PPA-在包括肺癌在内的多种肿瘤细胞中表达32，但PPA-在调节肺癌细胞的增殖与凋亡方面的作用机殖并不清楚。本研究的结果表明，A549 细胞中沉默 S100P 基因抑制了肺癌 A549 细胞的增殖及集落形成能力，且促进了肺癌 A549 细胞的凋亡能力。进一步的实验表明，沉默 S100P 基因抑制了与细胞增殖有关的 PCNA 蛋白含量的表达，并提高了与细胞凋亡相关的 cleaved Caspase-8、cleaved PAP 的蛋白含量的表达。上述结果表明 S100P 的沉默抑制了肺癌细胞的增殖并促进其凋亡。值得注意的是，沉默 S100P 的表达后 PPA-的表达也显著降低，这说明沉默 S100P 后对肺癌细胞增殖和凋亡的影响可能是通过调控 PPA-信号通路起作用，但S100P 对 PPA-的靶向调控缺乏直接性的实验证据。此外，S100P 如何通过 PPA-信号通路调控肺癌的增殖、凋亡，仍需进行进一步的实验验证以及更深入的研究探讨，这也是后续的研究重点。总而言之，本研究证明肺癌细胞中的 S100P 处于高表达状态。沉默 S100P 通过调控 PPA-信号通路从而介导与细胞增殖和凋亡相关的蛋白含量表达，进而抑制肺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。本次研究初步探索了 S100P 在肺癌中的高表达及其功能，为肺癌的治疗提供一个潜在的靶点。参考文献:1Sung H，Ferlay J，Siegel L，et al Global cancer statistics2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality world-wide for 36 cancers in 185 countriesJ CA Cancer J Clin，2021，71(3):209 249 2Soria JC，Massard C，Le Chevalier T Should progression-freesurvival be the primary measure of efficacy for advanced NSCLCtherapy J Ann Oncol，2010，21(12):2324 2332 3Chen Z，Fillmore CM，Hammerman PS，et al Non-small-celllung cancers:a heterogeneous set of diseases J Nat ev Can-cer，2014，14(8):535 546 4Arumugam T，Logsdon CD S100P:a novel therapeutic target forcancer J Amino Acids，2011，41(4):893 899 5Camara，Ogbeni D，Gerstmann L，et al Discovery of 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